冠心病患者血清lncRNA H19、CHAST的表達水平及臨床意義

李 鵬 王 勛 韓翠敏 汪明瑯 王怡練 孫黎明

心血管疾病(cardiovascular disease,CVD)目前是我國居民病死率最高的疾病,作為一種常見的慢性心血管疾病,冠心病(coronary heart disease,CHD)是其中重要的疾病之一,近年來病死率也呈持續上升趨勢,特別在農村地區尤為明顯[1]。冠心病的根本原因是動脈粥樣硬化,早期主要表現為內皮功能受損,而后巨噬細胞堆積、炎癥及脂質分子參與,導致粥樣斑塊形成及肌層纖維化,最終引起管腔狹窄、阻塞,導致心肌缺血、缺氧。臨床主要表現為心絞痛、心肌梗死甚至猝死等。血清長鏈非編碼RNA(long non-coding RNAs,lncRNAs)是一類與 mRNA 結構相近,但長度>200個核酸的 RNA 分子,由于其序列中開放閱讀框的缺乏而不參與蛋白質編碼,是廣泛分布于各種生物中的多功能調節劑[2]。

近年來研究表明,多種lncRNAs參與動脈粥樣硬化的形成[3]。其中人類母系印記基因lncRNA H19是較早發現的lncRNA之一,曾被報道其多態性與中國人群的CVD風險有關[4]。另外心肌肥大相關轉錄本lncRNA CHAST近年來亦被報道參與動脈粥樣硬化形成的過程[5]。但lncRNA H19在急性、慢性冠狀動脈綜合征中的表達差異及lncRNA CHAST在冠心病中的具體表達情況未見有進一步的研究。因此本研究通過測定入組患者血清lncRNA H19、lncRNA CHAST相對表達水平,探討lncRNA H19、lncRNA CHAST 在冠心病的發生、發展中的具體作用及其臨床價值。

材料與方法

1.研究對象:選取 2021年6月～2022 年5月在筆者醫院心血管內科住院患者共 197 例,分為 3 組,即急性冠狀動脈綜合征(acute coronary syndrome,ACS)組76 例、慢性冠狀動脈綜合征(chronic coronary syndrome,CCS)組59例和對照組(control組)62例。納入標準:冠心病患者均經冠狀動脈造影顯示至少1根主要心臟血管狹窄程度≥50%,ACS患者符合《急性冠狀動脈綜合征急診快速診療指南(2019)》[6],包括ST段抬高型心肌梗死、非ST段抬高型心肌梗死和不穩定性心絞痛,CCS組患者符合2019年歐洲心臟病學會慢性冠狀動脈綜合征的診斷和管理指南,包括慢性穩定性勞力型心絞痛、缺血性心肌病及ACS之后穩定的病情階段[7]。對照組均經冠狀動脈造影排除冠心病。排除標準:①心臟瓣膜病、先天性心臟病、心力衰竭、血管痙攣性心絞痛、惡性心律失常;②嚴重感染、肝腎功能或其他重要器官衰竭;③系統疾病如血液病、自身免疫性疾病、惡性腫瘤患者;④年齡小于 18 歲的患者,孕婦及哺乳期女性;⑤不自愿入組者以及病史資料不全者。本研究經筆者醫院醫學倫理學委員會批準(倫理學審批號:2022K005),所有入組患者均簽署知情同意書。

2.觀察指標:收集入組患者的一般臨床資料,包括性別、年齡、身高、體重、吸煙史、飲酒史等。實驗室指標:甘油三酯(triglyceride,TG)、總膽固醇(total cholesterol,TC)、高密度脂蛋白(high density lipoprotein,HDL)、低密度脂蛋白(low density lipoprotein,LDL)、超敏C反應蛋白(high sensitivity C-reactive protein,hs-CRP)、腫瘤壞死因子- α(tumor necrosis factor- α,TNF-α)、白介素-6(interleukin-6,IL-6)以及lncRNA H19、lncRNA CHAST的相對表達水平。

3.主要儀器與試劑:實時熒光定量PCR儀(type:StepOnePlus),RNA提取試劑盒(RNAliquid blood RNA kit, RN23)購自北京艾德萊生物有限公司,反轉錄試劑盒(Fast King KT, KR116)、熒光定量試劑盒(FastFire qPCR preMix,FP207)試劑盒均購自天根生物科技有限公司,引物合成由通用生物科技有限公司完成。

4.標本采集:所有入組患者均于次日取平臥位抽取空腹外周靜脈血4ml,放于EDTA抗凝管中,立即于溫控離心機下4℃ 3000r/min 離心15min,離心后取上層清液置于1.5ml RNase EP管,-80℃下保存待用。

5.RNA提取及實時熒光定量:按照試劑盒說明書取0.25μl血清樣本加入0.75μl裂解液混勻后按步驟提取總RNA,用Q9000分光光度儀測量其吸光度A值。按照反轉錄試劑盒說明書,各樣本取1μg RNA,去除gDNA后,于20μl體系下42℃孵育15min,95℃孵育3min后置于冰上反轉錄為cDNA。兩步法實時熒光(SYBR Green)定量分析,每個樣本設3個復孔,參數為95℃ 1min預變性,95℃ 5s變性,60℃ 15s退火 40個循環。U6為內參基因,測量各個樣本中lncRNA H19、lncRNA CHAST平均Ct值,采用2-ΔΔCt法計算其相對表達量。引物序列詳見表1。

表1 各引物序列

結 果

1.各組患者一般資料及血清lncRNA H19、lncRNA CHAST表達水平比較:各組患者年齡、BMI、糖尿病史、飲酒史、TG、TC比較差異無統計學意義(P>0.05)。與對照組比較,ACS組和CCS組性別、吸煙史、高血壓史、LDL、HDL、hs-CRP、TNF-α、IL-6及血清lncRNA H19、lncRNA CHAST表達水平等指標存在顯著性差異(P<0.05)。與CCS組比較,ACS組患者LDL、hs-CRP、TNF-α、IL-6及血清lncRNA H19、lncRNA CHAST表達水平顯著升高(P<0.05),HDL表達水平降低(P<0.05),詳見表2。

表2 各組資料比較

2.血清lncRNA H19和lncRNA CHAST表達水平診斷CHD的ROC曲線分析:血清lncRNA H19、lncRNA CHAST及聯合診斷CHD的ROC曲線下面積(area under curve,AUC)分別為0.9025(95%CI:0.8607～0.9443)、0.7749(95%CI:0.7116～0.8383)和0.9299(95%CI:0.8948～0.9649),最佳截斷值為1.29、1.56和0.98,特異性為75.6%、62.3%和73.3%,敏感度為88.7%、75.8%和93.5%,約登指數為0.643、0.477和0.668(圖1)。

圖1 lncRNA H19、lncRNA CHAST表達水平診斷CHD的ROC曲線

3.血清lncRNA H19 和lncRNA CHAST表達水平與其他指標的相關性:Pearson相關性分析表明CHD患者血清lncRNA H19、lncRNA CHAST表達水平與hs-CRP、IL-6、TNF-α、LDL呈正相關,與HDL呈負相關(P<0.05),詳見表3。

表3 CHD患者血清H19、CHAST表達水平與其他指標的相關性

4.Logistic多因素回歸分析CHD患者的危險因素:結果表明lncRNA H19、lncRNA CHAST、LDL、hs-CRP、吸煙、高血壓均為CHD的獨立危險因素(P<0.05),詳見表4。

表4 Logistic多因素回歸分析CHD危險因素

討 論

近年來,冠心病的發生率呈逐年上升趨勢,且發病年齡越來越趨于年輕化[1]。動脈粥樣硬化是冠心病的根本原因,其源于內皮細胞損傷,并最終由炎癥和免疫反應,脂質代謝,血管平滑肌的增殖和凋亡等機制共同參與形成動脈硬化斑塊[8]。lncRNAs廣泛分布于細胞核及胞質中,部分以外泌體等形式穩定存在于血漿中[9]。lncRNAs可介導多種信號轉導途徑,以及翻譯程序和基因表達的轉錄后調控, lncRNA還可以與mRNA及蛋白質相互作用,調節蛋白質翻譯后的修飾,這些作用大多是通過招募、信號、誘導、增強子及支架作用來實現的[10,11]。lncRNAs近年來被發現參與了冠心病形成的多個過程,如lncRNA Malat1可通過調節造血細胞的功能及促炎介質的表達進而影響脈粥樣硬化[3,12]。

lncRNA H19位于人類染色體11p15.5上,曾有研究報道lncRNA H19水平升高與冠狀動脈疾病的發病風險有關[13]。Tang等[14]研究發現,lncRNA H19亦可通過miR-152/VEGFA軸促進氧化型LDL(Ox-LDL)誘導的人主動脈內皮細胞功能障礙。而lncRNA CHAST位于人類7號染色體上,可由去氧腎上腺素、異丙腎上腺素以活化的T 細胞 (nuclear factor of activated T cell,NFAT)轉導的核因子激活[15]。有研究表明,在早期心肌梗死患者血清中lncRNA CHAST表達水平升高[5]。以上研究均提示lncRNA H19與lncRNA CHAST可能與冠心病相關。本研究表明,冠心病患者血清lncRNA H19、lncRNA CHAST的表達水平較對照組明顯升高(P< 0.05)。且ACS患者的lncRNA H19、lncRNA CHAST相較于CCS患者表達水平增高(P<0.05)。本研究顯示,lcnRNA H19、lncRNA CHAST參與冠心病的發生、發展,這可能與其參與炎癥、脂質代謝及內皮細胞功能障礙等因素相關。

ROC曲線分析結果表明,lncRNA H19、lncRNA CHAST對診斷冠心病有一定的價值。AUC分別為0.9025、0.7749。且兩者聯合診斷冠心病的AUC達到了0.9299,表明lncRNA H19、lncRNA CHAST聯合對冠心病具有較好的診斷效能。高珩等[16]曾報道在冠心病患者中血清lncRNA H19表達升高,對診斷冠心病有一定的價值,本研究結果與之相似,且本研究表明lncRNA CHAST對冠心病也有同樣的診斷價值。提示lncRNA H19、lncRNA CHAST或可作為診斷冠心病的血清標志物。

冠心病本質上是一種慢性炎癥性疾病,炎性細胞因子貫穿動脈粥樣硬化病變的整個過程。血管內皮細胞損傷后,LDL沉積在內皮下形成Ox-LDL,單核細胞在黏附因子和趨化因子的作用下聚集到內皮下分化形成巨噬細胞并吞噬大量的Ox-LDL 形成泡沫細胞[17]。同時產生大量的炎性細胞因子,引發一系列炎性反應,使得內皮損傷及趨化作用進一步加劇[18,19]。miRNA let-7是一種與炎癥及脂質代謝相關的miRNA,可通過NF-κB/let-7/IL-6軸促進血管炎癥的發展,有研究表明,lncRNA H19可通過調節NF-κB下調miRNA let-7來促進IL-6的表達[20],此外lncRNA H19還可以通過分子海綿作用直接靶向調節miRNA let-7促進炎性反應[21]。而lncRNA CHAST是自噬相關的lncRNA之一,冠心病患者心肌時常處于缺血狀態,加重了心肌的自噬現象,進一步激活了機體的炎性狀態,受損的自噬通量有助于炎癥的激活[22]。此外,lncRNA CHAST表達調節的也可由NFAT信號激活,NFAT是一種具有多向調控功能的轉錄因子,受多種信號通路調節,參與血管壁相關細胞的增殖、遷移、血管生成和血管炎癥[15, 22]。以上研究均支持lncRNA H19、lncRNA CHAST與炎性反應密切相關。

本研究結果表明,炎性細胞因子hs-CRP、IL-6、TNF-α以及LDL、HDL等指標在ACS組、CCS組及健康對照組間存在顯著性差異。且 lncRNA H19、lncRNA CHAST表達水平與炎性細胞因子hs-CRP、IL-6、TNF-α以及LDL呈正相關,與HDL呈負相關。再次證明lncRNA H19、lncRNA CHAST與炎性反應密切相關,提示 lncRNA H19、lncRNA CHAST可能通過調節炎性細胞因子及脂蛋白的表達水平而影響冠心病的發展。將lncRNA H19、lncRNA CHAST、hs-CRP、IL-6、TNF-α、LDL、吸煙、高血壓、性別等因素經Logistic多因素回歸分析表明,lncRNA H19、lncRNA CHAST均為冠心病的獨立危險因素。

綜上所述,冠心病患者血清lncRNA H19、lncRNA CHAST表達水平較正常人升高,其中ACS患者血清表達水平高于CCS患者。lncRNA H19、lncRNA CHAST在冠心病患者中與hs-CRP、IL-6、TNF-α等炎性細胞因子及LDL的表達呈正相關,與HDL呈負相關,lncRNA H19、lncRNA CHAST是冠心病的獨立危險因素,并可作為診斷冠心病的血清標志物,可能成為未來基因治療的靶點。