驅動基因陽性肺癌外周血EGFR甲基化及臨床意義

劉 東 李 真 王保慶 王自全 王丙武 李慶妍

肺癌是男性和女性癌癥死亡的主要原因,占全球所有癌癥死亡人數的1/3,中國肺癌發生率和病死率也是居高不下。非小細胞肺癌(non small-cell lung cancer, NSCLC)占肺癌病例的80%以上,其5年生存率低至約18%[1]。而肺癌病死率和預后差的主要原因與肺癌發生的生物學機制有關,且個體差異較大。EGFR突變是非小細胞肺癌發生的驅動基因之一,IPASS研究表明針對EGFR驅動基因陽性肺癌的患者使用吉非替尼,總體治療有效率可達71.2%,但仍有部分患者無效,可能與合并其他基因突變、擴增和其他未知機制有關,表明了肺癌靶向治療的異質性[2]。

近年來不涉及DNA序列的表觀遺傳學改變,參與了肺癌的發生、發展,成為肺癌研究熱點[3]。有研究表明EGFR蛋白低表達合并EGFR高甲基化的非小細胞肺癌患者對EGFR靶向治療不敏感[4,5]。但EGFR驅動基因陽性肺癌的發生是否合并EGFR啟動子CpG島甲基化狀態目前存在爭議,且與肺癌發生、發展相關的差異性甲基化CpG位點的研究目前尚未見報道[6～8]。MALDI-TOF MS技術是近年來的新興的甲基化檢測技術,可實現DNA甲基化的定性、定量、定位分析,本研究利用MALDI-TOF MS技術檢測EGFR驅動基因陽性肺癌患者的EGFR基因CpG島內甲基化位點狀態,篩選肺癌發生的差異性甲基化CpG位點,探討其與臨床病理特征、EGFR突變亞型之間的關系,為驅動基因陽性肺癌發病機制、預后預測及靶向治療提供新的理論依據。

材料與方法

1.材料:隨機收集徐州醫科大學第二附屬醫院2021年1月～2022年11月收治的32例肺腺癌患者,均經肺穿刺活檢或手術切除,病理證實均為肺腺癌,EGFR 19del患者17例,EGFR 21 L858R患者15例,3個月內未經放化療。其中男性14例,女性18例,患者年齡范圍51～82歲,中位年齡63歲。以24例正常體檢健康人群作為正常對照組,肺癌患者及正常對照組均空腹采集外周靜脈血3ml,-80℃冰箱保存備用。本課題實施前所有研究對象均知曉并簽署知情同意書,并經徐州醫科大學第二附屬醫院醫學倫理學委員會批準后實施{倫理學審批號:[2020]121301}。

2.外周血DNA提取:采集肺癌患者及正常體檢人群外周血,運用DNA提取試劑盒(BioTeKe Corpration)提取DNA,具體操作嚴格按照試劑盒操作說明。運用Nanodrop ND-1000紫外分光光度儀檢測DNA濃度和純度進行質量鑒定,確保純度(A260/A280)為1.5～2.2,濃度>50ng/μl,-80℃冰箱保存備用。

3.EGFR基因甲基化引物設計:查詢EGFR基因序列,位于7號染色體,位置:55014017～55020016(數據來源:NCBI,GRCh38.p13版本),選擇距離轉錄起始位點-5000bp～1000bp范圍為靶向區域進行引物設計,利用CpG島在線預測網站,預測序列潛在的CpG島,發現1個CpG島。采用Agena EpiDesigner程序對靶向序列進行引物方案設計。綜上因素評估,選擇#29和#30引物進行擴增,詳見圖1,具體引物信息詳見表1。

表1 EGFR#29、EGFR#30PCR擴增引物信息

圖1 EGFR基因CpG島靶向區域引物設計

3.MALDI-TOF MS技術進行DNA甲基化定量檢測分析:MALDI-TOF MS技術基于MassARRAY系統平臺,是一種新型高通量甲基化定量檢測方法,可完成特定位置甲基化位點的定量、定性、定位的高通量甲基化檢測。提取后達標的DNA嚴格按照EZ-96 DNA甲基化試劑盒(Zymo Research)亞硫酸氫鹽處理流程和美國Sequenom公司的推薦方式操作。經PCR擴增,蝦堿性磷酸酶處理PCR擴增產物(SAP)、體外轉錄及T裂解、樹脂樣本純化,由MassARRAY Nanodispenser 點樣機(美國Agena公司)進行384-well SpectroCHIP?bioarray芯片(美國Agena公司)點樣,Massy array質譜儀(美國Agena公司)進行質譜檢測得出質譜圖,最后經MassARRAY EpiTYPERTM軟件(美國Agena公司)分析質譜圖從而得出所檢測基因具體CpG位點的甲基化數據,具體檢測步驟嚴格按照制造商的說明操作。

圖2 EGFR#29、EGFR#30PCR擴增產物瓊脂糖凝膠電泳圖

4.統計學方法:應用GraphPad 8.0及SPSS 20.0統計學軟件對數據進行統計分析。GraphPad 8.0繪制肺癌患者及正常對照組外周血中EGFR位點甲基化比較直方圖;EGFR甲基化位點在肺癌與正常對照組之間的比較采用Mann-WhitneyU檢驗分析;EGFR甲基化與臨床資料、EGFR突變亞型組間或多組間的比較采用Mann-Whitney檢驗和Kruskal-Wallis檢驗分析,以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1.DNA質量鑒定結果及EGFR甲基化PCR擴增結果:對肺癌及正常對照組外周血提取DNA運用瓊脂糖凝膠電泳進行完整性檢測。濃度和純度達標的DNA用于亞硫酸氫鹽修飾,PCR擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳,在目的區域出現擴增片段詳見圖2。

2.EpiTYPER 軟件甲基化分析結果:運用EpiTYPER甲基化分析軟件分析樣本質譜圖,顯示EGFR#29擴增子包含20個CpG位點,T裂解為15個CpG單位,包含20個CpG位點,覆蓋率為100%(20/20)。EGFR#30擴增子中包含47個CpG位點,T裂解為23個CpG單位,其中2個單位(包含8個CpG位點)即CpG_30.31.32.33和CpG_34.35.36.37不可被分析,因此21個CpG單位可分析,實際包含39個CpG位點,覆蓋率達83.0%(39/47)。EGFR#29和EGFR#30部分位點甲基化水平詳見圖3。

圖3 EGFR#29(A)、EGFR#30(B) CpG位點甲基化情況

3.EGFR甲基化在肺癌與正常對照組中平均甲基化率對比:比較肺癌及正常對照患者外周血中EGFR CpG位點甲基化差異,詳見圖4。EGFR#29 15個CpG位點中除了4個位點CpG_3、CpG_7、8,CpG_10,CpG_20,11個CpG位點在肺癌組中甲基化率均低于正常對照組,其中EGFR#29 CpG_2在肺癌平均甲基化率(25.7%±2.1%)低于正常對照組(36.5%±4.6%),差異有統計學意義(P<0.05)。而EGFR#30 21個可分析CpG單位中有11個在肺癌組中甲基化率均低于正常對照組,其中CpG_8.9.10.11、CpG_25、CpG_40.41.42在肺癌組中甲基化率(4.6%±0.4%、2.8%±0.7%、4.4%±0.4%)低于正常對照組(6.0%±0.6%、4.8%±0.9%、7.1%±0.4%),差異有統計學意義(P<0.05)。

圖4 肺癌患者及正常對照組外周血中EGFR#29(A)、EGFR#30(B)CpG平均甲基化率比較Mann-Whitney U檢驗分析與正常組比較,*P<0.05

4.EGFR甲基化與肺癌患者臨床病理特征、EGFR突變亞型的關系:本研究將EGFR差異性甲基化CpG單位與肺癌臨床特征等進行相關性分析,詳見表2。結果發現EGFR#29 CpG_2,EGFR#30 CpG_8.9.10.11、CpG_25、CpG_40.41.42甲基化與肺癌患者患者年齡、分化程度、發病位置、TNM分期均無相關性(P>0.05)。在性別比較中發現,4個CpG位點在女性肺癌組較男性呈低甲基化狀態,其中EGFR#30 CpG_2在性別組中比較,差異有統計學意義(P<0.05)。在吸煙史對比中,2個CpG位點CpG_8.9.10.11、CpG_25、CpG_40.41.42在吸煙組肺癌患者中呈甲基化率升高趨勢,其中CpG_25在兩組中的甲基化差異有統計學意義(P<0.05)。而EGFR#30 CpG_8.9.10.11在淋巴結轉移組中甲基化水平要低于無淋巴結轉移組(P<0.01)。在EGFR甲基化與EGFR突變類型的相關性分析研究中,4個CpG位點在EGFR 19del和21 L858突變組中的甲基化比較,差異無統計學意義(P>0.05)。

表2 EGFR 差異性甲基化CpG單位與肺癌臨床病理特征、EGFR突變亞型的關系

討 論

肺癌的發生、發展是一個多因素參與的過程,可能包括環境因素、遺傳學和表觀遺傳學共同作用的結果。而肺癌的異質性在一定程度上決定了肺癌患者的治療療效和預后[9]。隨著基因檢測技術的進步,肺癌中EGFR 驅動基因的發現,針對EGFR靶點的精準治療使得非小細胞肺癌治療有效率明顯提高,提高了患者生存期[10]。EGFR 酪氨酸激酶抑制劑奧希替尼的應用目前已成為 EGFR突變的晚期或可切除NSCLC患者的標準治療方法,但即使這樣,仍然有部分患者治療無效,預后差,推測可能合并其他突變或新的機制。不涉及DNA序列變化的表觀遺傳學改變,近年來成為肺癌研究的熱點,且與肺癌的發生、發展有關[11～16]。而目前關于EGFR驅動基因陽性是否合并表觀遺傳學的改變,國內外也進行了一系列探討,但目前仍存在爭議[6～8]。

MALDI-TOF MS技術可檢測全基因組甲基化水平和特定CpG位點的甲基化,實現了甲基化定性、定量及定位的檢測。它比亞硫酸氫鹽測序PCR能更有效地反映低甲基化區域的真實甲基化水平,可以檢測到低至5%的甲基化水平[17]。因此,課題組利用MALDI-TOF MS技術檢測驅動基因陽性肺癌患者及正常對照組外周血中EGFR基因甲基化狀態。研究選取了EGFR基因CpG島的兩個擴增區域,檢測后發現EGFR基因在驅動基因肺癌患者較正常健康對照組中存在差異,且在肺癌中呈現廣泛低甲基化狀態,這與既往的研究一致,并篩選出4個差異性甲基化CpG單位EGFR#29 CpG_2,EGFR#30 CpG_8.9.10.11、CpG_25、CpG_40.41.42[7,8]。推測在EGFR驅動基因陽性肺癌發生機制中,DNA低甲基化可能使得原癌基因EGFR激活參與肺癌的發生,且EGFR突變合并EGFR低甲基化改變可能在局晚期及晚期肺癌發生中存在協同效應。

Hu等[18]研究表明,在大多數肺腺癌早期癌癥進展期,DNA遺傳學改變以及DNA甲基化的變化也可能同時發生。但EGFR突變與EGFR甲基化在肺腺癌進展演變過程中存在何種協同表達模式,目前仍無定論。而強少盈等[6]研究出現相反的結果,發現在EGFR-TKI敏感突變的11例肺癌患者中未見檢測到甲基化,而在無EGFR-TKI敏感突變的29例肺癌患者甲基化率為34.5%,究其原因可能與甲基化檢測的方法不同有關。探討差異性甲基化CpG位點與EGFR驅動基因陽性肺癌患者臨床特征的相關性,結果發現EGFR甲基化與肺癌患者患者年齡、分化程度、發病位置、TNM分期均無明顯相關性。而EGFR 4個CpG單位在女性肺癌患者中呈現更低的甲基化,其中EGFR#30 CpG_25的差異更明顯。EGFR4個CpG單位中有3個在吸煙組肺癌患者中呈甲基化率升高趨勢,其中CpG_25甲基化差異更為明顯,推測長期吸煙的患者可能使得EGFR CpG位點發生甲基化改變,這與既往的研究結果大致一致,細胞長期暴露于香煙煙霧會導致進行性表觀遺傳變化參與肺癌的發生,并已篩選出部分與肺癌患者吸煙相關的甲基化CpG位點作為肺癌發生風險的預測因子,但這與Li得出的研究結果不同,究其原因可能與檢測方法及CpG島擴增區域不同有關[19～21]。

在淋巴轉移比較中發現,EGFR#30 CpG_8.9.10.11在淋巴結轉移組中的甲基化水平要明顯低于無淋巴結轉移組,提示出現EGFR#30 CpG_8.9.10.11低甲基化的肺癌患者更容易出現淋巴結轉移,并可能作為預后預測的分子標志物。作為一種重要的化學修飾,DNA甲基化狀態可能和染色體不穩定性增加以及癌癥突變率有關[18,19]。有研究表明,DAPL1基因的高甲基化可能與非小細胞肺癌19外顯子缺失突變亞型有關。而EGFR CpG位點甲基化與EGFR突變亞型是否存在相關性未見報道。本研究也進行了探討,發現在EGFR 19del和21 L858突變組中EGFR位點存在不同程度的甲基化,但差異無統計學意義。

本研究通過MALDI-TOF MS技術檢測驅動基因陽性肺腺癌患者及正常人群外周血中EGFR CpG島甲基化狀態,發現肺腺癌患者在發生EGFR突變的同時合并了EGFR的低甲基化改變,推測EGFR低甲基化改變與EGFR突變在晚期肺癌發生中可能存在協同效應,并篩選出與驅動基因陽性肺癌患者發生顯著相關的差異性甲基化CpG位點,因此,通過肺癌患者外周血檢測可能作為肺癌診斷的生物學標志物。同時本研究還篩選出與性別、吸煙以及淋巴結轉移有關的CpG位點,可能作為肺癌患者發生、發展及預后預測的重要分子標志物。限于樣本量較少,結果可能存在一定局限性,仍需擴大樣本量進一步研究,而精準篩選與EGFR表達密切相關的差異性甲基化CpG位點也是課題組后續的研究方向。DNA甲基化是可逆的過程,針對驅動基因陽性肺癌發生、發展相關的特異性甲基化CpG位點進行去甲基化藥物干預,可能為肺癌的靶向治療和聯合治療提供了新的思路。