木糖合成納米木聚糖在抗菌材料中的應用研究

王舉偉 張嘉俊 劉思佳 李 冰 李慧杰 龐久寅

（北華大學木質材料科學與工程重點實驗室，吉林省吉林市 132013）

作為農業生產大國，我國每年會產生大量的農業廢棄物，而這些農業廢棄物中含有豐富的生物質資源[1-2]。若能對其有針對性地進行轉化利用，則可以獲得重要的新材料、化工原料、高熱值燃料、功能食品和藥物等[3-4]。因此，生物質精煉已成為經濟和社會發展的重大戰略舉措[5]。

抗菌材料是近年來材料科學領域的一大亮點[6]，根據其來源、理化性能和抗菌機理，可分為無機抗菌劑、有機抗菌劑和天然抗菌劑3大類[7-9]。

無機抗菌劑的抗菌效果具有廣譜性、持久性、耐熱性、不產生細菌耐藥性等優點，主要分為金屬類和碳材料類。有機抗菌劑的殺菌效率高，合成方法簡單，種類多樣，是一類常見的抗菌劑，在市場中占據主導地位[10]。天然抗菌劑主要通過一些生物體合成，根據其來源可分為植物源、動物源及微生物源抗菌劑[11-13]。

這些抗菌劑各有優缺點，大量使用無機抗菌劑容易在環境中積累并產生污染，對水生生物和土壤微生物會造成不良影響，也可能產生抗性菌株，使抗菌劑的效果逐漸減弱[8]。長期使用有機抗菌劑則可能造成環境污染和人體健康問題。天然抗菌劑的缺點在于提取成本較高，容易被污染或發生變質。

木糖是戊糖的一種，主要分布于植物體內，如玉米的穗軸、秸稈，以及棉桃的外皮等。因此，以農業廢棄物為原料，開發新型、低毒、高效的納米木聚糖抗菌劑是一個值得深入研究的課題[14-16]。

鑒于此，本研究采用高溫縮聚法[17]，使木糖在山梨醇與檸檬酸的作用下，聚合成低聚木糖，并用于制備納米木聚糖。在此基礎上，考察納米木聚糖的抑菌效果，以期為天然抗菌劑的開發與利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

木糖（化學純，山東新華制藥有限公司）、山梨醇（化學純，江蘇誠信生物科技有限公司）、檸檬酸（化學純，山東新華制藥有限公司）、氫氧化鈉（化學純，山東新華制藥有限公司）、硫酸（分析純，山東新華制藥有限公司）、無水乙醇（工業級，山東新華制藥有限公司）、胰蛋白胨（試劑級，江蘇誠信生物科技有限公司）、酵母提取物（江蘇誠信生物科技有限公司）、氯化鈉（分析純，山東新華制藥有限公司）、瓊脂（食品級，江蘇誠信生物科技有限公司）、蒸餾水（山東新華制藥有限公司）。

1.2 試驗儀器與設備

電熱恒溫水浴鍋（HH-1），金壇市富華儀器有限公司；數顯多頭磁力加熱攪拌器（HJ-6A），常州市億能實驗儀器有限公司；分析天平（TG328A），上海天平儀器廠；高速離心機（HC-3514），安徽中科中佳科學儀器有限公司；高速多功能粉碎機（HL-FS400），上海寰熙醫療器械有限公司；電熱鼓風干燥箱（DL102），天津市實驗儀器廠；真空冷凍干燥機（BK-FD12T），山東博科生物產業有限公司；紫外分光光度計（UV-1200），上海美析儀器有限公司；傅里葉紅外光譜儀（FTIR-1500），中世沃克科技發展股份有限公司；納米激光粒度儀（Winner802），濟南微納儀器股份有限公司；立式蒸汽滅菌鍋（BKQ-B5011）， 山東博科生物產業有限公司；恒溫恒濕培養箱（BSC250），上海博訊實業有限公司。

1.3 木糖合成低聚木糖

稱取適量山梨醇和檸檬酸，分別加入少量蒸餾水溶解。稱取27 g木糖，將山梨醇溶液與木糖混合均勻，倒入三頸燒瓶，加熱升溫至90 ℃，轉速20 r/min。在升溫的同時緩慢加入檸檬酸溶液，持續加熱30 min，使其充分融化呈透明淡黃色，升溫至140～170 ℃，轉速調至40 r/min，持續反應1 h。待反應結束后將藥品取出，冷卻至室溫。

1.4 納米木聚糖的制備

稱量2 g木聚糖，加入一定濃度氫氧化鈉溶液200 mL，在一定溫度下（40～80 ℃）進行溶解。反應一段時間后，降至室溫，加入事先稀釋好的硫酸調節pH至5.5。加入3倍體積95%乙醇進行醇沉，醇沉24 h；將醇沉后的樣品進行抽濾，并使用蒸餾水對沉淀物洗滌2～3次。隨后再沉淀加入適量蒸餾水并進行離心，轉速為6 000 r/min，時間3 min，重復離心3 次，確保除盡乙醇。將離心后的樣品取出，過濾液體，將濾渣放入冰箱預凍一段時間，確保能夠結塊。隨后，將預凍好的樣品放入真空冷凍干燥機中干燥24 h，即可獲得納米木聚糖[18-21]。

1.5 抗菌性能測試

參考GB/T 38483—2020《微生物源抗生素類次生代謝產物抗細菌活性測定抑菌圈法》對納米木聚糖的抗菌性能進行測試[22]。

LB液體培養基：稱取胰蛋白胨10.0 g、酵母提取物5.0 g、氯化鈉10.0 g，然后將上述各成分加于1 000 mL蒸餾水中，煮沸溶解，調節pH至7.0±0.2，分裝至錐形瓶中，121 ℃滅菌20 min。

LB固體培養基：稱取胰蛋白胨10.0 g、酵母提取物5.0 g、氯化鈉10.0 g、瓊脂20.0 g，然后將上述各成分加于1 000 mL蒸餾水中，煮沸溶解，調節pH至7.0±0.2，分裝至250 mL錐形瓶中，121 ℃滅菌20 min。

采用紙片擴散法[23-24]，用打孔器將濾紙加工成若干小圓片，在紫光燈下充分照射，確保無雜菌，用于承載樣品。以蒸餾水為溶劑，配制納米木聚糖溶液。另外選用未經任何處理的空白試樣作為對照組。

菌株活化：將菌株接種到LB液體培養基的試管中，37 ℃下培養12 h。用接種環挑取菌懸液以劃線法接種到LB固體平板上，37 ℃恒溫培養箱中培養24 h，然后從平板中挑取單菌落接種在LB固體培養基試管斜面內，37 ℃恒溫培養箱中培養24 h。

菌懸液制備[25-27]：用接種環取保存菌，以劃線法接種到LB固體平板上，37 ℃下培養24 h。取LB液體培養基20 mL加入容量為100 mL的無菌錐形瓶內，用接種環取平皿上的單菌落接種在LB液體培養基內，37 ℃培養12 h。菌懸液用冷卻至55 ℃左右的LB固體培養基按1∶10的比例稀釋，充分混勻后取15 mL于無菌培養皿內，使用滾珠法將其均勻鋪開，待其凝固后制成檢測平板備用。將小圓片以一定間距擺放在平板上，在小圓片上滴加適量樣品溶液，將平板正置于37 ℃的恒溫培養箱中培養12 h取出。

1.6 紅外光譜（FT-IR）分析

利用中世沃克公司的傅里葉變換紅外光譜儀(FTR-1500)測試樣品的紅外光譜，采用KBr壓片法制備，背景選用空氣。取適量測試樣品研磨成粉末，將粉末與KBr混合壓片，測試范圍為3 500～500 cm-1。圖1 為納米木聚糖的紅外光譜圖。由圖可知，納米木聚糖在3 418 cm-1附近出現的特征吸收峰歸因于多糖O—H的伸縮振動；2 900 cm-1處是甲基、亞甲基等的C—H的伸縮振動吸收峰；1 617 cm-1處為木糖單元的C—C伸縮振動吸收峰；1 180～1 050 cm-1內的振動吸收峰源于吡喃環的C—O 、C—O—C的伸縮振動與C—O—H的伸縮振動疊加的結果；1 145 cm-1附近處的強吸收峰證明單糖以吡喃糖苷的形式存在；996 cm-1處為吡喃糖B-型C—H變角振動的特征峰。綜合紅外光譜特征可知，納米木聚糖的糖鏈主要以β糖苷鍵連接，并且其糖環為吡喃環。

圖1 納米木聚糖的紅外光譜Fig.1 Infrared spectroscopy of nanoxylan

1.7 核磁共振氫譜（1HNMR）分析

利用日本電子JEOL公司的JNM-ECZS核磁共振波譜儀對樣品進行測定和確證，使用重水（D2O）做氘代試劑。

圖2 為納米木聚糖的1HNMR譜圖。理論上，氘水的溶劑峰和水峰在4.79 ppm，而在此圖中，溶劑峰在4.6 ppm處。其中，5.3 ppm處出現的單峰為叔碳上H的質子吸收峰，5.0～5.5 ppm出現的多重峰為木聚糖上羥基的質子吸收峰，4.0 ppm處出現的單重峰為叔碳上H的質子吸收峰，3.0～4.0 ppm處出現的多重峰為分子中與羥基相連的叔碳上H的質子吸收峰和分子中亞甲基的質子吸收峰。

圖2 納米木聚糖的1HNMR譜圖Fig.2 1HNMR spectra of nanoxylan

2 結果與分析

2.1 低聚木糖的合成分析

如表1 所示，采用正交試驗法來確定木糖合成低聚木糖的優化工藝，其方差分析如表2 所示。

表1 正交試驗因素水平表Tab.1 Orthogonal test factor level table

表2 方差分析Tab.2 Analysis of variance

低聚木糖一般在2～7 個聚合度，此反應中山梨醇作為增塑劑可以與木糖結合形成山梨醇-木糖產物，促進低聚木糖的形成。此外，山梨醇還能增加反應混合物的黏度，提高反應的分子濃度，從而促進反應進行。同時，山梨醇也是終止劑，對于控制聚合度，最直觀的反應就是產物的顏色。當產物偏向深黃色時，則聚合度過大，原因在于檸檬酸作為催化劑與交聯劑，其中含有多個羧基，可能會干擾反應產物的穩定性并加劇聚集，對產物的生成具有顯著影響。因此，合成低聚木糖時木糖、山梨醇、檸檬酸的最佳用料比為18 ∶6 ∶1，處理溫度為170 ℃。

2.2 納米木聚糖的合成分析

如表3所示，采用正交試驗來確定制備低聚木糖的優化工藝，其方差分析如表4所示，粒徑情況如圖3所示。

表3 正交試驗因素水平表Tab.3 Orthogonal test factor level table

表4 方差分析Tab.4 Analysis of variance

圖3 納米木聚糖粒徑測試Fig.3 Nanoxylan particle size test

從方差分析結果可以看出，3種因素中，堿液濃度的影響最顯著，其均方數F值達到了5.21，p值小于顯著性水平0.05，說明對粒徑有顯著影響。而溫度和時間的p值均大于0.05，說明對粒徑沒有顯著影響。因此，優化工藝為堿液濃度為3.5%，處理時間為2 h，處理溫度為60 ℃，該條件下制備的納米木聚糖其粒徑較小。

2.3 抗菌性能分析

圖4～6為不同組的金黃色葡萄球菌抑菌測試結果，右側2個為滴加了納米木聚糖溶液的紙片。由圖可知，木聚糖對照組在金黃色葡萄球菌中抑菌圈直徑為8 mm，納米木聚糖試驗組在金黃色葡萄球菌中抑菌圈直徑為11 mm，抗菌性能相對提升37.5%。

圖4 空白對照組Fig.4 Blank control group

圖5 木聚糖對照組Fig.5 Xylan control group

圖6 納米木聚糖對照組Fig.6 Nanoxylan control group

圖7～9為不同組的大腸桿菌抑菌測試結果，右側2個為滴加了納米木聚糖溶液的紙片。由圖可知，木聚糖對照組在大腸桿菌中抑菌圈直徑為9 mm，納米木聚糖試驗組在大腸桿菌中抑菌圈直徑為12 mm，抗菌性能相對提升30%。

圖7 空白對照組Fig.7 Blank control group

圖8 木聚糖對照組Fig.8 Xylan control group

圖9 納米木聚糖對照組Fig.9 Nanoxylan control group

3 結論

本文以木糖、山梨醇、檸檬酸為原理，以高溫聚合法制備了低聚木糖；隨后將其與氫氧化鈉溶液混合反應，制備得到了納米木聚糖。在此基礎上，考察了納米木聚糖的抑菌效果，主要得出以下結論：

1）低聚木糖的優化制備工藝為：木糖、山梨醇、檸檬酸的物料比18 ∶6 ∶1，處理溫度為170 ℃，處理時間為1 h。納米木聚糖的優化制備工藝參數為堿液濃度3.5 %，處理溫度為60 ℃，處理時間為2 h，納米木聚糖平均粒徑可達126 nm左右。

2）木聚糖本身具有一定的抗菌性，納米化后抗菌性能更佳。一方面，可能是因為細菌表面對于多糖具有一定的識別性；另一方面，在納米化后，木聚糖對細菌的細胞膜、細胞壁、酶和代謝等產生了干擾作用，從而顯示出良好的殺菌效果。