干血斑中34種苯二氮卓類物質的實時直接分析-串聯質譜快速篩查研究

劉富邦，張 瑛，王繼芬*，周沛龍，侯曉龍

（1.中國人民公安大學 偵查學院，北京 100038；2.北京市公安司法鑒定中心，法庭毒物分析公安部重點實驗室，北京 100192；3.中國醫學科學院 北京協和醫學院 藥物研究所，北京 100050）

苯二氮卓類物質（Benzodiazepines，BZDs）是一類功能強大的中樞神經系統抑制劑［1］，其種類繁多，使用較為普遍，是法醫毒物檢驗中常見的檢驗目標。該類藥物的許多衍生物與代謝物依然具有精神活性，且可能有更強的藥效與成癮性［1-2］。因此，BZDs 在服務于失眠、狂躁等癥狀的患者時，也具有十分重大的濫用風險。該類物質在自殺、強奸、搶劫等類案件中均有出現，且其中的苯二氮卓類新精神活性物質在歐洲、美國等地區的濫用越來越嚴重［3-4］。

血液是目前篩查BZDs 攝入的常用檢材基質。人體在服用BZDs 后，其原藥及代謝物會經血液循環到達身體各處。干血斑（Dried blood spot，DBS）是一種新興的血液樣本采集技術，需將取得的待測血液滴入特制試紙條上封裝保存［5-6］。該技術具有采集量少、采集難度低、易于運輸和儲存等優勢，在DNA檢驗中得到了廣泛應用，在毒物毒品檢驗中也具有強大應用潛力［7］。有研究表明BZDs在全血中降解速度快，而在DBS 中十分穩定，室溫下放置30 d 仍可保持初始數值的80%以上［8-9］，因此DBS 是BZDs 的極好檢材。

目前應用于干血斑中藥物檢測的方法主要是色譜-質譜聯用法［10-13］，尤其是液相色譜-質譜聯用法。Guo 等［11］采用液相色譜-串聯質譜（LC-MS/MS）法對DBS 進行分析，建立了DBS 中425 種藥毒物的篩選方法，方法檢出限（LOD）為0.1~10 ng/mL，并成功應用于103名疑似藥物中毒患者DBS樣本的檢測［11］。

實時直接分析（DART）技術是一種比較成熟的原位電離技術，通過彭寧電離等作用電離并脫附樣品中的物質使其進入質譜［14］。將DART與串聯質譜聯用的實時直接分析-串聯質譜（DART-MS/MS）法具有樣品制備簡單、分析快速、環境友好、操作簡單等優勢。Crawford 等［15］使用DART-MS/MS 法直接分析玻片上的血液斑并將該方法用于藥代動力學研究。Wang等［16］使用優化的DART-MS/MS方法定量DBS中的L-苯丙氨酸用以篩查新生兒苯丙酮尿癥，獲得了良好的線性關系并成功用于醫學實踐。

本文將DART-MS/MS 應用于DBS 中的毒物分析，開發了DBS 中34 種BZDs 的DART-MS/MS 篩查方法，并對該方法進行了考察和實際應用。DBS 易于運輸和存儲的特點使其有潛力成為案件的最佳留存檢材，該研究為DBS中BZDs的快速篩查提供了新選擇，也為后續的相關研究提供了參考。

1 實驗部分

1.1 主要儀器、試劑與樣品

QTRAP 4000 質譜儀與電噴霧電離源（美國AB SCIEX 公司）；DART-SVP 電離源（美國Ion Sense 公司）；SIGMA 3-30K高速冷凍離心機（德國Sigma公司）；旋渦混合器（美國Talboys公司）。

阿地唑侖（Adinazolam）等34 種BZDs 標準品均購自上海原思標物科技有限公司，純度≥99%，相關信息見表1。

表1 34種苯二氮卓類物質的CAS號、分子式和質譜條件Table 1 CAS number，molecular formula and mass spectrum conditions of 34 benzodiazepines

甲醇、乙腈均為色譜純，購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司；丙酮、乙酸乙酯均為分析純，購自國藥集團化學試劑有限公司；水為去離子水。

空白血液與檢材血液由北京市公安司法鑒定中心提供。采血卡購自北京達博創新科技開發有限公司。

1.2 溶液配制

以甲醇為溶劑使用5 mL 容量瓶分別配制34 種BZDs 的1 mg/mL 標準儲備液。實驗所需濃度的BZDs標準溶液均由甲醇稀釋標準儲備液配制。

各濃度血液加標樣品由空白血液與標準溶液以9∶1的體積比混勻制備而成。

1.3 DART-MS/MS條件

DART 條件：裝載DART 12Dip-ItTM進樣模塊，離子源出口與質譜接口距離為1.6 cm，每個玻璃棒進樣量為5 μL，移動速度為0.6 mm/s。在正離子模式下電離，柵極電壓為200 V，使用氦氣作為載氣，載氣加熱器溫度為400 ℃。

質譜條件：正離子掃描模式，電噴霧電壓為5 500 V，使用多反應監測（MRM）模式下的Scheduled MRM 功能設置68 個離子對的監測時間，使34 種苯二氮卓類物質分成3 組，每組監測兩個玻璃進樣棒的進樣結果，每組藥物的掃描窗口寬度為60 s，每次掃描總時間為1.2 s，在DART 開始進樣的同時開啟質譜掃描。優化的質譜參數及保留時間（即掃描中心時間）如表1所示。

1.4 樣品前處理方法

采血卡上的DBS 由50 μL 血液滴入試紙條上并陰干3~4 h 制成，每張采血卡上可同時采集兩個血斑。將制備好的DBS封袋冷凍保存。采血卡上制備好的DBS如圖1所示。

圖1 采血卡上制備的DBS照片Fig.1 Photograph of DBS prepared on blood collection card

將采血卡上的一個DBS 裁下并剪碎，置于1.5 mL 離心管中，并加入0.25 mL 水和0.75 mL 乙酸乙酯，渦旋振蕩1 min，超聲處理5 min，以14 000 r/min在4 ℃下冷凍離心5 min，取上層乙酸乙酯溶液進樣分析。

2 結果與討論

2.1 DART-MS/MS條件優化

裝載電噴霧離子源后使用100 ng/mL 的各BZDs 標準品進行質譜條件優化。以全掃描模式定位藥物母離子并記錄質荷比，然后使用二級質譜掃描模式掃描藥物碎片離子并記錄質荷比，選取響應最高的兩種離子對作為定性離子對。最后在MRM 模式下優化兩種離子對的去簇電壓（DP）和碰撞能量（CE），并計算其豐度比。優化后的質譜參數如表1 所示。在DART 自動進樣程序開始的同時開啟質譜掃描，為了在同一進樣程序內篩查34 種苯二氮卓類物質，使用Schedule MRM 功能，設置單次掃描總時間為1.2 s，每個峰掃描5次以上以確保準確性，在保留時間0.3 ~1.3 min 范圍內檢測第1組；保留時間1.4 ~2.4 min 范圍內檢測第2 組；保留時間2.5 ~3.5 min 范圍內檢測第3 組。由血液制備的DBS 樣品（1 μg/mL）的提取溶液中依替唑侖（第1 組）、氟西泮（第2組）、氟硝西泮（第3組）的譜圖如圖2所示。

圖2 DBS樣品提取溶液中依替唑侖（A）、氟西泮（B）、氟硝西泮（C）的譜圖Fig.2 Spectra of etizolam（A），flurazepam（B） and flunitrazepam（C） in DBS（1 μg/mL） sample extraction solution

DART 離子源出口與質譜接口的距離以及柵極電壓、載氣流速等參數使用默認值。DBS 樣品在溶液提取后濃度較低，載氣須選擇電離能力強的氦氣。選用相對穩定的DART 12Dip-ItTM液體進樣模塊，由于玻璃棒進樣量越大響應越高，為保持液滴穩定，將進樣量維持在5 μL。在不同溫度下測定100 ng/mL BZDs 混合標準溶液6 次并取平均值，結果顯示多數物質在350 ℃、400 ℃及450 ℃響應達到最大。綜合考慮，選用400 ℃作為載氣加熱器溫度。

2.2 前處理方法優化

干血斑試紙上的纖維在與血液結合后經高溫載氣電離吹掃時易有雜物脫落堵塞進樣口，目前尚未開發出有效的應對手段。研究制備的DBS的直徑約1.5 cm，其碎片的提取需使用1 mL溶劑。目前提取干血斑中的苯二氮卓類藥物多使用甲醇、乙腈及其混合溶劑［10-13，17］，此外乙酸乙酯是最常用于血液中苯二氮卓類物質液液萃取的溶劑［18-19］?？疾炝思状?、乙腈、甲醇-乙腈（體積比1∶1）混合溶劑、乙酸乙酯-水（體積比3∶1）混合溶劑作為提取溶劑對DBS（1 μg/mL）樣品和空白DBS樣品的提取效果。

結果顯示，甲醇作為提取溶劑時對DBS 樣品各離子對的響應強度高，但在空白樣品中檢出了阿地唑侖、二氯西泮、氟阿普唑侖、α-羥基咪達唑侖離子對的信號，表明使用甲醇提取DBS 樣品時基質干擾嚴重；乙腈作為提取溶劑時，空白樣品中未檢測到明顯的BZDs 信號，但DBS 樣品的信號響應較低，靈敏度差；甲醇-乙腈（體積比1∶1）混合溶劑的響應強度中等，但空白樣品中仍有阿地唑侖和二氯西泮被檢出；乙酸乙酯-水（體積比3∶1）混合溶劑提取液可以將更易溶于水的雜質留在下層水溶液中，乙酸乙酯提取層更加純凈，進樣后的信號響應強度相對較高，且空白樣品中無明顯BZDs信號檢出。因此，選用乙酸乙酯-水（體積比3∶1）混合溶劑作為DBS中BZDs的提取溶劑。

2.3 定性方法驗證

在分析高濃度（1 μg/mL）樣品后緊接著分析空白樣品2次以驗證方法的選擇性與延遲效應。在空白樣品中未發現34種BZDs的信號，因此該方法選擇性良好，無延遲效應影響。

分別使用3 份不同來源的空白血液稀釋制備1 000、500、200、100、50、20、10、5、2、1 ng/mL的DBS 加標樣品，采用所建立的方法進行分析。選取出峰位置前后的基線為參照計算各分析物的信噪比（S/N），將滿足3 份樣品出峰位置譜峰的S/N≥3 且離子豐度比誤差在允許范圍（表2）內的最低濃度認定為檢出限（LOD）。結果表明，氟西泮、奧沙西泮、阿地唑侖、α-羥基三唑侖的檢出限分別為5、100、200、500 ng/mL，氯溴唑侖、氟阿普唑侖、替馬西泮、阿普唑侖、咪達唑侖、三唑侖、氟硝西泮、α-羥基咪達唑侖檢出限為10 ng/mL，氟溴西泮、氟溴唑侖、芬納西泮、去甲西泮、硝西泮、氯硝西泮、7-氨基氯硝西泮的檢出限為50 ng/mL，其他BZDs 的檢出限為20 ng/mL?？梢娝ǚ椒勺鳛榘讣舸鍰BS中大多數BZDs物質的有效快速篩查方法。

表2 特征離子豐度比的最大允許相對偏差范圍Table 2 Maximum allowable relative deviation range of relative abundance of characteristic ions

2.4 實際應用

使用所建立的方法對35 個DBS 樣本（包括31 個陽性血液檢材和4 個空白血液檢材）進行快速篩查，并將篩查結果與LC-MS/MS 檢驗結果進行比較。其中，有3個陽性檢材樣本因濃度太小未檢出；5個陽性檢材樣本只能認定其中1 種原藥或代謝物；其他23 個陽性檢材樣本和4 個空白血液檢材樣本均獲得與LC-MS/MS一致的結論。陽性檢材的檢驗結果比較如表3所示。

在實際樣品檢驗中，2、7、12、14、29號檢材雖然檢測出的BZDs種類比LC-MS/MS法少，但能夠成功推斷出案件中所服用的物質，可在篩查后再使用LC-MS/MS 準確定性和定量。案件檢材DBS 的篩查失敗率僅為9.7%，均為檢材中藥物濃度低所致，因此推薦在自殺等服用藥物較多的案件中使用DART-MS/MS 法進行快速篩查。為方便保存，可將BZDs 濃度在LOD 以上的血液檢材存為DBS 樣品以便進行重復檢驗。

3 結 論

本文建立了一種快速篩查DBS中34種BZDs的DART-MS/MS方法，該方法操作簡單快捷、成本低，滿足絕大多數BZDs 的篩查需求。研究中使用的DBS 采血卡是DNA 保存與檢驗的標準載體，能夠實現一卡久存多用。該方法在案件檢材中的應用效果良好，符合實戰需求。

雖然直接吹掃干血斑表面可能會導致出現雜質堵塞進樣口等問題，但通過改進干血斑試紙或DART 離子源，本文所建方法仍有潛力在快速分析DBS 的應用中發揮重大作用。但由于靈敏度相對較低、現場取血操作難以保證重復性、血液血細胞比容不同等因素的影響，本方法在定量分析方面尚有一定的挑戰性。