血清生長相關蛋白-43、α-突觸核蛋白對小兒癲癇診斷價值研究

賈小慧,秦雪蓮,劉青,劉亞楠,廉喆

癲癇是兒童期最常見的慢性神經系統疾病,約占總人群發病率的50/10萬[1]。癲癇發作及合并癥如注意缺陷、焦慮及抑郁等可導致患兒嚴重生活障礙[2]。生長相關蛋白-43(growth associated protein 43,GAP-43)是一種突觸前神經末梢富集的胞膜磷蛋白,在神經纖維發育、軸突再生及突觸功能維持等方面發揮重要的作用[3]。研究發現,GAP-43的降低能夠促進顳葉神經細胞損失,促進癲癇持續狀態的形成[4]。α-突觸核蛋白(α-Synuclein,α-Syn)是腦神經元含量最豐富的蛋白質之一,參與調節神經遞質釋放、突觸傳遞及神經元凋亡等過程,與阿爾茨海默病、多發性硬化等神經系統退行性疾病關系密切[5]。有學者在內側顳葉癲癇患者中發現海馬神經元中α-Syn沉積,其促進神經系統慢性炎性反應及癲癇發作的發生[6-7]。目前癲癇患兒血清GAP-43、α-Syn表達及臨床意義尚不清楚。本研究檢測癲癇患兒血清GAP-43、α-Syn水平,探討兩者對癲癇的診斷價值,報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2019年4月—2022年4月臨汾市人民醫院兒科診治小兒癲癇患者80例為癲癇組:男46例,女34例,年齡3～14(6.21±0.76)歲;病程2～37(7.34±2.15)個月;均無明顯誘因及癲癇家族史;癲癇類型:全身強直陣攣發作45例,局灶性發作35例;根據第4版韋氏兒童智力量表評分[8]分為認知功能障礙27例(評分≤69分),無認知功能障礙53例(評分>69分)。選取同期醫院神經內科診治的暈厥患兒50例為暈厥組:既往均無神經內科疾病且經頭顱影像學檢查排除器質性病變,男27例,女23例,年齡4～12(6.17±0.69)歲。選取同期外科擇期手術的腹股溝斜疝患兒50例為對照組,均無神經內科疾病且經頭顱影像學檢查排除器質性病變,男27例,女23例;年齡3～14(6.09±0.71)歲。3組患兒性別、年齡之間比較,差異無明顯統計學意義(P>0.05)。本研究經醫院倫理委員會批準通過(T20190313001),患兒家屬知情同意并簽署知情同意書。

1.2 癲癇組病例選擇標準 (1)納入標準:① 原發性癲癇診斷符合國際抗癲癇聯盟的診斷及分類標準[9],且距離最近一次發作時間<1周;②首次發病,年齡≤14歲;③臨床資料完整。(2)排除標準:①經頭部計算機斷層掃描及磁共振成像等證實存在器質性病變,包括腦外傷、腦發育畸形、顱內占位及腦梗死等;②有癲癇家族史;③有神經系統其他疾病;④合并肝腎等臟器功能障礙;⑤既往有抗癲癇治療或免疫抑制劑用藥史。

1.3 觀測指標與方法

1.3.1 血清GAP-43、α-Syn水平檢測:采集研究對象清晨空腹靜脈血5 ml,室溫靜置1 h后離心留取上層血清,-20℃冰箱保存待測。以Multiskan FC酶標儀(購自美國賽默飛公司)采用酶聯免疫吸附試驗檢測血清GAP-43、α-Syn水平。GAP-43 ELISA試劑盒購自上海臻科生物公司,貨號ZK-3466。α-Syn ELISA試劑盒購自深圳子科生物公司,貨號ZK-H1620。試驗步驟按照試劑盒操作說明進行。

1.3.2 腦電監測及顱腦MR檢查:(1)常規腦電圖檢查?；純喝朐?2 h內使用腦電采集監測系統(美國Nicolet one EEG v32)完成常規腦電圖檢查,出現異常腦電圖及不同頻段腦功能區功率升高為陽性。異常腦電圖包括廣泛性或爆發性棘波、尖波、尖—慢綜合波、棘—慢綜合波、較多散在3 Hz左右δ波、背景以θ節律/δ波為主等;腦功能區功率升高頻段包括δ頻段、α頻段、θ頻段、δ+θ頻段。(2)顱腦多序列檢查。入院72 h內,采用德國西門子公司生產的1.5T超導MR成像系統進行顱腦多序列檢查,提示顱內非特異病變為陽性,表現為腦積水、腦萎縮、腦內囊腫、腦室擴張、巨腦回形成、丘腦白質體積減少、皮質發育異常、脫髓鞘病變等。

1.3.3 癲癇嚴重程度評估:參考國立醫院癲癇發作嚴重程度量表(National Hospital Seizure Severity Scale,NHS3)評分[10],評估癲癇患兒癲癇發作的嚴重程度。評分范圍1～27分,分值越高,癲癇發作越嚴重。

2 結 果

2.1 3組血清GAP-43、α-Syn比較 血清GAP-43水平癲癇組<暈厥組<對照組,差異均有統計學意義(P均<0.05);血清α-Syn水平癲癇組>暈厥組>對照組,差異均有統計學意義(P均<0.05),見表1。

表1 3組血清GAP-43、α-Syn水平比較Tab.1 Comparison of serum GAP-43,α-Syn levels in three groups

2.2 血清GAP-43、α-Syn在癲癇患兒不同臨床特征中比較 患兒血清GAP-43在癲癇局灶性發作、無認知功能損害者中升高,α-Syn水平在癲癇局灶性發作、無認知功能損害者中降低,差異均具有統計學意義(P均<0.05),二者在患兒性別、年齡、腦電圖異常、頭顱MR異常者中比較,差異無統計學意義(P均>0.05),見表2。

表2 血清GAP-43、α-Syn在癲癇患兒不同臨床特征中比較Tab.2 Comparison of serum GAP-43,α-Syn in different clinical characteristics of children with epilepsy

2.3 血清GAP-43、α-Syn與癲癇嚴重程度的相關性 癲癇組患兒NHS3評分3～25 (14.57±3.22)分。Pearson相關性分析顯示,血清GAP-43水平與NHS3評分呈負相關(r=-0.645,P<0.001),血清α-Syn水平與NHS3評分呈正相關(r=0.702,P<0.001)。

2.4 血清GAP-43、α-Syn及聯合檢測對小兒癲癇的診斷價值 繪制血清GAP-43、α-Syn及兩項聯合預測小兒癲癇的診斷價值ROC曲線,并計算曲線下面積(AUC),結果顯示:血清GAP-43、α-Syn及兩項聯合預測小兒癲癇的AUC分別為0.740、0.738、0.835,二項聯合預測的AUC高于單項預測,差異具有統計學意義(Z=4.482、4.391,P均<0.001),見表3、圖1。

圖1 血清GAP-43、α-Syn及聯合檢測對小兒癲癇的診斷價值ROC曲線Fig.1 ROC curve of diagnostic value of serum GAP-43,α-Syn and combined detection for pediatric epilepsy

表3 血清GAP-43、α-Syn及兩項聯合預測小兒癲癇的診斷價值分析Tab.3 Analysis of diagnostic value of serum GAP-43,α-Syn and two joint predictions for pediatric epilepsy

3 討 論

癲癇是嬰幼兒及兒童最常見也是最具有破壞性的神經系統疾病。全球范圍內,癲癇患病例數達5 000萬例,每年死亡例數達12.5萬例[11]。目前小兒癲癇的診斷主要根據間隔24 h的2次或2次以上無源性發作病史進行判斷。雖然腦電圖、腦成像及基因檢測為癲癇的診斷提供了重要支持,但仍有一定的誤診率[12]。深入研究小兒癲癇的疾病機制,尋找能夠早期輔助診斷癲癇的血清生物標志物,具有重要意義。

GAP-43是一種神經細胞膜上的磷蛋白,在生長錐及突觸前末梢中表達較為豐富,是軸突生長的關鍵因子。GAP-43主要表達于嗅球、海馬及皮質聯合區等可塑性區域中,神經元和神經膠質細胞在腦損傷時能釋放GAP-43等神經營養因子,促進神經修復和再生[13]。本研究中,癲癇患兒血清GAP-43水平降低,提示GAP-43可能參與癲癇的發生。有學者在幼年大鼠腦可塑性模型中證實,在戊四唑誘導的癲癇發作持續10 h～3 d后,CA3、CA1等區域的GAP-43 mRNA水平下降,導致大腦內神經元形成異常的突觸聯系及病理性神經環路,促進癲癇的發生[14]。此外,癲癇患兒血清GAP-43水平與癲癇嚴重程度有關,提示GAP-43的降低促進癲癇的疾病進展。有學者報道,癲癇患兒血清GAP-43水平與血鋅水平呈正相關,GAP-43表達水平的降低導致神經元損傷修復能力減弱,神經元過度興奮及癲癇發作導致大量活性氧等氧自由基的產生,消耗機體抗氧化劑鋅等微量元素,造成氧化與抗氧化系統平衡失調,加重神經元損傷及癲癇發作嚴重程度[15]。另外,Royero等[4]發現,GAP-43的水平降低能夠激活賴氨酸受體,參與癲癇持續狀態后海馬中發生的神經元丟失和皮質神經元的功能重組,促進神經元內鈣離子內流,激活鈣離子依賴性蛋白激酶,促進神經元信號傳導的長時程增強[4]。本研究中,血清GAP-43水平在全身強直痙攣發作、伴有認知功能損害的癲癇患兒中降低更為明顯。筆者分析,一方面是GAP-43水平降低能夠降低血鋅水平,阻斷抑制性神經遞質γ氨基丁酸,導致超氧化物歧化酶和谷胱甘肽過氧化物酶合成不足,促進全身強直痙攣發作[16]。另一方面,GAP-43水平降低導致其神經修復能力減弱,過度氧化應激加重小膠質細胞中白介素1β等促炎性因子的表達,誘導神經元凋亡,造成患兒認知功能損害[17]。因此,GAP-43的水平降低參與小兒癲癇的發生發展,是新的小兒癲癇血清標志物。

α-Syn在中樞神經系統突觸前末梢及神經元核內廣泛表達,是由140個氨基酸組成的可溶性小分子蛋白質。α-Syn可以聚集形成不溶性的寡聚體,影響突觸小泡運輸、減少神經遞質釋放及引起線粒體和突觸功能障礙,在神經退行性疾病中發揮重要作用[18]。近年來發現,成年頑固性癲癇患者的腦脊液和血清中α-Syn水平均明顯升高,有助于頑固性癲癇的鑒別診斷及預后評估[19]。本研究中,癲癇患兒血清α-Syn水平升高,提示α-Syn可能參與促進小兒癲癇的發生。既往學者在毛果蕓香堿誘導癲癇動物模型中也證實,海馬齒狀回和近中顳葉組織中α-Syn表達增加,而α-Syn的大量沉積能夠誘導神經元局部炎性反應的發生,損傷神經細胞,誘導反應性膠質增生,促進頑固性癲癇的發生[20]。本研究中血清α-Syn水平與癲癇嚴重程度呈正相關,表明血清α-Syn升高參與促進癲癇疾病進展。分析其原因,α-Syn的表達升高能夠誘導星形膠質細胞分泌產生白介素1β及白介素6等促炎細胞因子,促進炎細胞浸潤、破壞血腦屏障并活化小膠質細胞,加重癲癇發作嚴重程度[21]。本研究中,伴有認知功能損害的癲癇患兒血清α-Syn水平明顯升高,表明α-Syn有助于反映癲癇患兒認知功能損害情況。分析其原因,α-Syn水平升高能夠誘導神經系統慢性炎性反應狀態的形成。有學者在內側顳葉癲癇動物模型中,發現海馬組織中α-Syn的蓄積能夠誘導神經系統炎性反應及膠質細胞的過度增殖,造成海馬硬化及長時程增強改變損傷動物的空間學習記憶功能,導致認知功能障礙的發生[6,22]。本研究通過ROC曲線分析發現,血清GAP-43、α-Syn聯合對癲癇診斷的曲線下面積為0.835,診斷的敏感度和特異度分別為0.776、0.804,表明兩項聯合對于小兒癲癇具有較高的診斷價值,有望成為小兒癲癇早期診斷的生物標志物。

綜上所述,小兒癲癇血清GAP-43降低,α-Syn表達升高,兩者與癲癇嚴重程度、發作類型及認知功能損害有關,均參與小兒癲癇的發生發展過程。血清GAP-43、α-Syn聯合對小兒癲癇具有較高的診斷效能,有利于輔助臨床醫生早期診斷小兒癲癇。本研究也存在局限性,如樣本量有限,納入研究對象可能存在一定的偏倚。另外,本研究未對腦脊液中GAP-43、α-Syn水平進行檢測,有待日后擴大樣本量,設計嚴格病例對照研究,深入探索兩者的臨床價值。

利益沖突:所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明

賈小慧、秦雪蓮:設計研究方案,實施研究過程,論文撰寫 資料搜集整理,論文修改;劉青、劉亞楠、廉喆:實施研究過程,數據收集,分析整理,進行統計學分析