結直腸癌組織中SPON2、MGP表達及臨床意義

楊同昕,董建寧,施雪松,曹紅勇,楊維軍

結直腸癌(colorectal cancer,CRC)是常見的消化系統惡性腫瘤,全球每年新發患者190萬,死亡93.5萬[1]。CRC的治療包括手術、化療等,但腫瘤復發及轉移率較高,患者生存預后較差[2]。脊椎蛋白2(Spondin 2,SPON2)屬于細胞基質蛋白Spondin家族成員,能通過整合素家族識別病原體,參與先天免疫和適應性免疫過程[3]。研究發現,SPON2在肝癌、胰腺癌等惡性腫瘤中表達上調[4-5],介導腫瘤細胞與基質間的相互作用,促進腫瘤侵襲和轉移?；|Gla蛋白(matrix Gla protein,MGP)是一種分泌型蛋白,參與調節骨骼鈣磷代謝、動脈粥樣硬化等生物學過程[6]。近年來發現,MGP在胃癌、乳腺癌等腫瘤中過度表達,其通過與細胞外基質結合,促進腫瘤細胞的侵襲和增殖,是潛在的腫瘤標志物[7]。目前CRC中SPON2、MGP表達的臨床意義尚不清楚,本研究通過檢測CRC中SPON2、MGP的表達,分析兩者與臨床病理特征及預后的關系,報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 2018年1月—2020年1月南京市第一醫院普外科收治行手術治療CRC患者94例,男51例,女43例,年齡26～79(64.47±9.79)歲;腫瘤位置:直腸42例,結腸52例;淋巴結轉移33例;腫瘤直徑≤5 cm者55例,>5 cm者39例;腫瘤TNM分期:Ⅰ～Ⅱ期61例,Ⅲ期33例;腫瘤分化程度:高中分化59例,低分化35例。本研究經醫院倫理委員會審核通過,患者或家屬知情同意并簽署知情同意書。

1.2 病例選擇標準 (1)納入標準:①經術后病理組織學檢查確診為CRC;②均為原發初診患者;③臨床資料完整。(2)排除標準:①年齡<18歲或>80歲;②術前新輔助放化療或靶向治療;③復發性CRC、遺傳性CRC或合并其他惡性腫瘤;④合并其他嚴重臟器功能衰竭;⑤合并肺炎、泌尿系統感染等感染性疾病。

1.3 觀測指標與方法

1.3.1 SPON2、MGP蛋白表達檢測:留取術中獲取的部分CRC癌和癌旁組織(距離癌組織邊緣>5 cm)各約100 mg。將CRC癌和癌旁組織常規10%福爾馬林固定12 h,常規石蠟包埋后切片(切片機購自德國Leica公司,型號 RM2125 RTS),厚度4 μm,62℃烤片2 h后進行免疫組化染色(試劑盒購自北京中杉金橋生物有限公司,貨號PV-9004)。二甲苯透明化及石蠟包埋, 切片層厚4 μm,62℃烤片2 h后,梯度乙醇水化,在100℃檸檬酸溶液中抗原熱修復10 min,加入一抗(兔抗人SPON2、MGP單克隆抗體,1∶200,購自美國abcam公司,貨號ab215451,ab273651),4℃過夜,加入二抗(HRP結合的羊抗兔抗體)37℃下孵育1 h,DAB顯色5 min,蘇木精復染后,鹽酸酒精分化,梯度乙醇脫水后中性樹膠密封。由2位病理科醫生在200倍顯微鏡(日本奧林巴斯公司,型號CX31)下閱片, SPON2、MGP蛋白陽性染色為細胞核和/或細胞質出現棕黃色染色。采用半定量方法,根據染色強度和陽性細胞百分比的乘積計算最終得分。染色強度評分:0分為無染色;1分為淡黃色染色;2分為棕黃色染色;3分為棕褐色染色。陽性細胞百分比評分:0分為≤5%;1分為6%～25%;2分為26%～50%;3分為51%～75%;4分為≥76%。最終評分>2分為陽性,≤2分為陰性。

1.3.2 隨訪情況:自CRC患者出院時開始隨訪,隨訪3年,第1年每3個月隨訪1次,第2～3年每6個月隨訪1次,隨訪終點時間為2023年1月。隨訪內容為病史、體格檢查、腹盆腔超聲或CT等,記錄患者生存情況、生存時間等。

1.4 統計學方法 采用SPSS 25.0統計軟件分析數據。計數資料以頻數或率(%)表示,組間比較采用卡方檢驗。繪制Kaplan-Meier生存曲線,Log-Rank法比較不同SPON2、MGP表達生存曲線的差異。CRC預后影響因素分析采用多因素Cox比例風險模型。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 CRC癌及癌旁組織中SPON2、MGP蛋白表達的差異比較 SPON2、MGP蛋白在CRC癌組織細胞核和細胞質中均有表達,部分表達于細胞核。CRC癌及癌旁組織中SPON2陽性率分別為65.96%(62/94)和6.38%(6/94)。CRC癌及癌旁組織中MGP陽性率分別為63.83%(60/94)和8.51%(8/94)。SPON2、MGP蛋白在CRC癌組織中的陽性率高于癌旁組織,差異具有統計學意義(χ2=72.251、62.298,P均<0.001)。

圖1 SPON2、MGP蛋白在CRC癌及癌旁組織中的表達差異(免疫組化染色,×200)Fig.1 Differential expression of SPON2 and MGP proteins in CRC cancer and adjacent tissues (immunohistochemical staining, × 200)

2.2 SPON2、MGP表達在CRC不同臨床病理特征患者中比較 低分化程度、TNM分期Ⅲ期及有淋巴結轉移患者SPON2、MGP陽性率分別高于高中分化、TNM分期I～Ⅱ期及無淋巴結轉移患者,差異均有統計學意義(P<0.01),見表1。

表1 SPON2、MGP蛋白表達在CRC患者不同臨床病理特征中比較[例(%)]Tab.1 Comparison of SPON2 and MGP protein expression in different clinical and pathological characteristics of CRC patients

2.3 SPON2、MGP蛋白表達與CRC患者預后的關系 CRC患者隨訪中死亡32例,失訪2例,3年生存率為65.22%(60/92)。SPON2陽性組、陰性組3年生存率分別為54.84%(34/62)和86.67%(26/30);MGP陽性組、陰性組3年生存率分別為53.33%(32/60)和87.50%(28/32)。SPON2陽性組、MGP陽性組3年累積生存率低于SPON2陰性組、MGP陰性組,差異具有統計學意義(χ2/P=8.966/0.003、12.420/<0.001),見圖2。

圖2 Kaplan-Meier曲線分析SPON2、MGP蛋白表達與CRC患者預后的關系Fig.2 Kaplan Meier curve analysis of the relationship between SPON2, MGP protein expression and prognosis in CRC patients

2.4 CRC患者預后的多因素Cox回歸分析 以CRC患者預后為因變量,以上述結果中P<0.05項目為自變量進行多因素Cox回歸分析,結果顯示:腫瘤TNM分期Ⅲ期、低分化程度、伴淋巴結轉移、SPON2陽性、MGP陽性是影響CRC患者預后的獨立危險因素,見表2。

表2 CRC患者預后的多因素Cox回歸分析Tab.2 Multivariate Cox regression analysis of prognosis in CRC patients

3 討 論

CRC是我國常見的消化系統惡性腫瘤,男性常見,隨著人們生活水平及飲食方式的改變,其發病率有不斷升高的趨勢[8]。目前CRC的治療以手術輔以放化療的綜合治療為主,但術后仍有許多患者出現復發轉移,導致不良預后。目前腫瘤TNM分期是臨床中評估CRC患者預后的主要依據,但CRC具有高度異質性的特點,即使相同分期、相同治療方案的CRC患者,疾病進展存在較大差距,許多患者不能獲益[9]。深入研究CRC疾病機制,尋找能夠有效評估預后的腫瘤標志物,對于CRC的個體化治療,具有重要意義。

SPON2編碼基因位于4p16.3,包含TSR結構域和FS結構域,能夠作為模式識別受體結合細菌脂多糖、整合素等識別病原體,啟動內源性免疫反應。研究表明,肺癌中SPON2的表達能激活核因子κB信號通路,上調基質金屬蛋白酶2和9的表達,促進腫瘤細胞的遷移和侵襲[10]。本研究中,CRC癌組織中SPON2表達上調,提示SPON2可能與CRC的腫瘤發生有關。CRC中SPON2的表達受結腸癌轉移相關基因1的表達調控。研究表明,結腸癌組織中結腸癌轉移相關基因1的表達異常升高,其能與SPON2基因啟動子結合,促進SPON2蛋白的過度表達,增強CRC腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲能力[11]。本研究中,CRC中SPON2表達與不良臨床病理特征有關,提示SPON2參與促進CRC腫瘤的惡性進展。分析其原因,CRC中SPON2能夠激活整合素β1/富含脯氨酸的酪氨酸蛋白激酶2,促進單核細胞的細胞骨架重塑和跨內皮遷移,并通過上調腫瘤細胞中CC趨化因子配體2的表達,誘導巨噬細胞向M2型極化,促進腫瘤免疫逃逸,導致腫瘤過度增殖和侵襲[12]。另外,SPON2表達升高還能夠誘導血管內皮生長因子A和C的表達,促進膠質瘤等惡性腫瘤的腫瘤血管新生及淋巴管生成,導致腫瘤細胞發生血行轉移和淋巴轉移[13]。本研究中,CRC組織中SPON2陽性表達的患者生存預后較差,提示SPON2是新的CRC預后評估的腫瘤標志物。分析其原因,SPON2陽性的CRC腫瘤細胞惡性程度高,腫瘤的增殖、侵襲及轉移能力強,腫瘤術后復發和轉移風險高,導致患者預后較差。有學者利用高親和力SPON2肽配體競爭性結合靶向SPON2的SH結構域保守殘基,降低SPON2的生物學活性,結果胃癌腫瘤細胞的增殖及侵襲能力明顯受到抑制,實驗動物的生存率也顯著增加[14]。因此,SPON2的表達促進腫瘤發生發展,是新的CRC預后評估腫瘤標志物,以SPON2為靶點是潛在的CRC治療方案,值得臨床深入研究。

MGP是人體內血管和軟骨鈣化的抑制因子,廣泛表達于骨、心臟及肺臟等人體組織中,參與骨組織代謝和異位鈣化。近年來發現,MGP mRNA在乳腺癌、腎癌、肝癌和卵巢癌中均異常表達上調,可能是新的腫瘤早期診斷及預后評估的腫瘤標志物[7, 15]。本研究中,CRC癌組織中MGP表達上調,提示MGP可能參與CRC的腫瘤發生。CRC中MGP的表達上調與Wnt通路的激活有關。研究表明,CRC中存在Wnt/β-連環蛋白通路過度激活的現象,β-連環蛋白活化后進入細胞核并在轉錄水平直接上調MGP的表達,促進腫瘤細胞上皮間質轉化及腫瘤細胞干性特征形成,增強腫瘤細胞的侵襲和轉移能力[16-17]。本研究中,MGP表達與CRC不良臨床病理特征有關,提示MGP促進CRC的腫瘤進展。研究發現,CRC中MGP的表達升高能夠磷酸化激活核因子κB,上調腫瘤細胞表面程序性死亡因子配體1的表達,其能結合CRC腫瘤微環境中CD8+T細胞表面的程序性死亡因子1,促進CD8+T細胞耗竭及免疫效應能力的降低,導致腫瘤免疫逃逸及腫瘤進展[18]。另有研究報道,CRC腫瘤細胞中MGP的表達上調能夠顯著增加細胞內游離Ca2+濃度,促進p65磷酸化,進而上調癌基因c-MYC、細胞間黏附分子1和血管內皮生長因子A的表達,增強腫瘤細胞的惡性增殖和轉移能力[19]。本研究中,CRC癌組織中MGP陽性是CRC患者不良生存預后獨立危險因素,提示檢測CRC癌組織中MGP的表達有助于評估CRC患者的生存預后。分析其原因,一方面是MGP陽性表達的CRC腫瘤細胞惡性程度高,腫瘤轉移能力較強,術中難以徹底切除,術中殘留的微小病灶均能增加術后腫瘤復發轉移的風險。另一方面,MGP的表達能夠增強CRC腫瘤細胞對放化療等治療的抵抗性,降低術后輔助治療療效。有研究發現,CRC中MGP的過表達能夠通過上調銅轉運蛋白1,下調P型銅轉運ATP酶,提高腫瘤細胞對奧沙利鉑的耐藥性,而體外細胞實驗中敲除MGP的表達能夠顯著增加CRC腫瘤細胞系對奧沙利鉑的敏感性[20]。因此,MGP參與CRC腫瘤的發生發展,是新的評估CRC預后的腫瘤標志物。

綜上所述,CRC中SPON2、MGP表達升高,兩者與CRC患者的TNM分期、腫瘤分化程度及淋巴結轉移有關,均參與CRC的腫瘤進展過程。腫瘤TNM分期Ⅲ期、低分化程度、伴淋巴結轉移、SPON2陽性、MGP陽性是影響CRC患者預后的獨立危險因素。臨床醫師可根據CRC癌組織中SPON2、MGP的表達,同時結合傳統TNM分期、腫瘤分化程度等臨床病理特征,對CRC患者生存預后進行評估,指導臨床診治。本研究也存在不足,為單中心回顧性研究,樣本量有限,有待今后設計前瞻性多中心大樣本臨床試驗,深入研究SPON2、MGP的臨床價值。

利益沖突:所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明

楊同昕:設計研究方案,實施研究過程,論文撰寫;董建寧:提出研究思路,分析試驗數據,論文審核;施雪松:實施研究過程,資料搜集整理,論文修改;曹紅勇:進行統計學分析;楊維軍:課題設計,論文撰寫