非小細胞肺癌組織EMSY、PIDD表達與同源重組修復基因的相關性及其臨床意義

陳麗萍,項保利,王布,姬澤萱,郭志青,趙建清

肺癌是人類最常見的惡性腫瘤,每年新發209萬例,死亡176萬例[1]。肺癌中約85%為非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)。NSCLC主要以手術為主的綜合治療,但治療效果并不理想,病死率無明顯改善[2]。EMSY轉錄抑制因子(EMSY transcriptional repressor, EMSY)是定位于DNA損傷部位的核蛋白,能結合乳腺癌易感基因2,誘導腫瘤基因組不穩定,促進卵巢癌等腫瘤發生發展[3-4]。p53誘導的死亡結構域蛋白1(p53-induced death domain protein 1,PIDD)富含亮氨酸的重復序列和死亡結構域,在細胞死亡信號傳導中起銜接蛋白的作用[5]。研究發現,PIDD表達通過增強核因子κB的SUMO化修飾,增強核因子κB的活化,抑制DNA損傷后的腫瘤細胞凋亡,促進腫瘤惡性進展[6]。同源重組修復是DNA損傷后重要修復方式,其表達失調會導致驅動基因差錯積累、腫瘤進展及放化療抵抗的形成[7]。本研究通過檢測NSCLC中EMSY、PIDD表達,探討兩者與同源重組修復基因表達及臨床病理特征的關系,分析兩者的診斷價值,報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2022年1月—2023年4月河北北方學院附屬第一醫院呼吸與危重癥醫學科診治NSCLC患者80例。男42例,女38例,年齡34～78 (64.27±6.29)歲;病程3～36(8.17±3.58)d;均無明顯誘因及家族史;合并癥:高血壓22例,糖尿病7例;吸煙史30例;病理類型:腺癌48例,鱗癌32例;腫瘤最大徑≤3 cm 55例,>3 cm 25例;TNM分期:Ⅰ～Ⅱ期54例,Ⅲ期26例;腫瘤分化程度:高中分化47例,低分化33例;合并淋巴結轉移28例。本研究經醫院倫理委員會審核批準通過(K2022104),患者或家屬知情同意并簽署知情同意書。

1.2 病例選擇標準 (1)納入標準: ①經病理組織學檢查確診為NSCLC;②患者既往無放化療及免疫治療等抗腫瘤治療; ③病例臨床及病理資料完整。(2)排除標準:①合并心、肝、肺等臟器異常;②有其他惡性腫瘤病史;③有肺結核、免疫系統疾病或其他嚴重感染。

1.3 觀測指標與方法 EMSY、PIDD表達與同源重組修復基因: 術中留取NSCLC癌和癌旁組織(距癌組織>2 cm,病理證實為正常組織),于液氮中研磨,離心取上清。應用組織RNA提取試劑盒(購自北京索萊寶公司,貨號R1240)提取組織總RNA,應用反轉錄試劑盒(購自北京索萊寶公司,貨號RP1105)將總RNA反轉錄為cDNA。采用實時熒光定量聚合酶鏈反應檢測組織中EMSY、PIDD及同源重組修復基因乳腺癌易感基因l(breast cancer susceptibility gene 1,BRCA1)、切除修復交叉互補基因1(excision repair cross-complementing gene 1,ERCC1)、核糖核苷酸還原酶亞單位1(ribonucleotide reductase catalytic subunit M1,RRM1)。實時熒光定量PCR試劑盒購自北京索萊寶公司,貨號SR1110。實時熒光定量PCR儀器購自美國ABI公司,型號ABI 7500。引物由上海生工科技公司設計合成。引物序列見表1。反應條件:94℃ 5 min,94℃ 30 s,58℃ 34 s,72℃ 30 s,共40個循環。反應總體系共20 μl,包括2×SYBR Premix Es Taq 10 μl,上游、下游引物各1 μl,cDNA 1 μl和ddH2O 7 μl。以GAPDH為內參,采用相對比率2-△△Ct法處理試驗數據。

表1 EMSY、PIDD表達與同源重組修復基因引物序列Tab.1 EMSY and PIDD expression and homologous recombination repair gene primer sequences

1.4 統計學方法 采用SPSS 26.0軟件對數據進行統計分析。符合正態分布的計量資料以均數±標準差表示,組間比較采用獨立樣本t檢驗;計數資料以頻數或率(%)表示,組間比較采用卡方檢驗;相關性分析采用Pearson相關分析;繪制受試者工作特征曲線(receiver operating characteristic curve,ROC),分析EMSY、PIDD對NSCLC的診斷價值。P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1 NSCLC癌組織中EMSY、PIDD及同源重組修復基因的表達 NSCLC癌組織中EMSY、PIDD、BRCA1、ERCC1、RRM1 mRNA相對表達量均高于癌旁組織,差異均有統計學意義(P<0.01),見表2。

表2 NSCLC癌組織中EMSY、PIDD及同源重組修復基因的表達比較Tab.2 Comparison of expression of EMSY, PIDD, and homologous recombination repair genes in NSCLC cancer tissue

2.2 NSCLC中EMSY、PIDD與同源重組修復基因表達的相關性 NSCLC癌組織中EMSY、PIDD mRNA與BRCA1、ERCC1、RRM1 mRNA表達均呈正相關(P<0.01),見表3。

2.3 NSCLC中EMSY、PIDD表達在不同臨床病理特征中差異比較 低分化程度、有淋巴結轉移及TNM 分期Ⅲ期NSCLC癌組織EMSY、PIDD mRNA表達分別高于高中分化程度、無淋巴結轉移及TNM 分期Ⅰ～Ⅱ期NSCLC癌組織,差異均有統計學意義(P<0.01),見表4。

表4 癌組織中EMSY、PIDD mRNA表達在不同NSCLC臨床病理特征中的比較Tab.4 Comparison of EMSY and PIDD mRNA expression in different clinical and pathological characteristics of NSCLC in cancer tissues

2.4 EMSY、PIDD mRNA表達對NSCLC的診斷價值 繪制 EMSY、PIDD mRNA及兩項聯合診斷NSCLC價值的ROC曲線,并計算曲線下面積(AUC),結果顯示:EMSY、PIDD mRNA及兩項聯合診斷NSCLC的AUC分別為0.834、0.802、0.906,兩項聯合診斷NSCLC的AUC大于EMSY、PIDD mRNA單一診斷(Z=4.751、5.257,P均<0.001),見表5、圖1。

圖1 EMSY、PIDD mRNA診斷NSCLC的價值ROC曲線分析Fig.1 ROC curve analysis of the diagnostic value of EMSY and PIDD mRNA for NSCLC

表5 EMSY、PIDD mRNA診斷NSCLC的價值比較Tab.5 Comparison of the diagnostic value of EMSY and PIDD mRNA in NSCLC

3 討 論

NSCLC是肺癌最常見的類型,目前NSCLC的治療包括手術、輔助放化療等,特別是近年來靶向治療及免疫治療取得了巨大突破,但其僅限于部分具有特定驅動基因突變的患者。部分NSCLC患者存在放化療抵抗或治療一段時間后形成耐藥性,均可導致術后腫瘤復發和轉移,進而導致患者不良預后。深入研究NSCLC癌變機制對于NSCLC臨床診治意義重大。

同源重組修復是真核細胞內一種DNA雙鏈斷裂的修復方式,可在電離輻射、抗癌化療藥物及遺傳毒性藥物等損害過程中產生,DNA雙鏈得不到修復,可導致染色體斷裂和細胞死亡。BRCA1主要參與核苷酸剪切修復和同源重組修復。ERCC1是核苷酸剪切修復家族成員,與XPF形成異源二聚體,在DNA單鏈受損處的5’端進行剪切而發揮功能。RRM1是核苷酸還原酶調節M1亞單位,當ERCC1將DNA鏈中受損的部分切除后,DNA鏈上留下的空缺由RRM1提供的核苷酸來填補。本研究中,NSCLC中同源重組修復基因表達升高,與既往研究中免疫組化的結果一致[8],表明NSCLC中存在同源重組修復基因表達失常。NSCLC中同源重組修復基因的表達異常升高可引起斷裂的DNA雙鏈不恰當修復,導致染色體缺失、重排、轉位及倒置,導致腫瘤的發生。另外,同源重組修復基因的表達異常升高能夠增強腫瘤對放化療等輔助治療的抵抗性,導致不良預后[9]。

EMSY也稱為C11orf30,基因定位于人類染色體11q13.5,編碼蛋白能夠結合乳腺癌中BRCA2并使其失活,導致DNA損傷后不能及時修復,導致腫瘤發生[10]。本研究中,NSCLC癌組織中EMSY表達升高,提示EMSY可能參與NSCLC的腫瘤發生。EMSY作為一種原癌基因,在卵巢癌中均存在EMSY基因啟動子序列的單核苷酸性位點的突變現象,導致EMSY基因表達上調,降低對紫杉醇化療的敏感性[11]。另有研究表明,Kelch樣環氧氯丙烷相關蛋白-1能夠泛素化修飾EMSY,促進EMSY蛋白經泛素蛋白酶體途徑降解,而NSCLC中Kelch樣環氧氯丙烷相關蛋白-1基因突變導致EMSY蛋白穩定性增加,導致EMSY表達水平升高[12]。本研究中,NSCLC中EMSY的表達與不良臨床病理特征有關,提示EMSY促進NSCLC的腫瘤進展。分析其機制,NSCLC中EMSY的表達上調能夠促進BRCAness表型的形成,腫瘤同源重組修復功能缺陷導致高腫瘤突變負荷,促進腫瘤細胞的惡性增殖和侵襲轉移[12-13]。此外,EMSY作為染色質重塑復合體的重要組成成分,其過度表達能夠抑制干擾素刺激基因的表達,抑制Ⅰ型干擾素反應及先天免疫信號通路的傳導,促進了腫瘤細胞的免疫逃避[12, 14]。本研究發現,NSCLC中EMSY與同源重組修復基因表達有關,提示EMSY能影響NSCLC中同源重組修復基因的表達。研究表明,EMSY能參與NRC相互作用因子1染色質重塑復合體的形成,促進組蛋白H3的去甲基化,在轉錄水平上調BRCA1、ERCC1、RRM1等同源重組修復基因的表達[15]。而BRCA1、ERCC1、RRM1等同源重組修復基因的表達上調能夠增強NSCLC腫瘤細胞對放化療治療的抵抗性,降低放化療治療的療效,導致患者不良預后[7]。因此,NSCLC中EMSY促進腫瘤的發生發展,以EMSY為靶點的治療可能是潛在的NSCLC新的治療方案。

PIDD是依賴于p53的效應因子,在細胞核中以SUMO化修飾方式激活,并活化核因子κB,啟動下游基因的轉錄,發揮促進惡性腫瘤發生發展的生物學作用[16]。本研究中,NSCLC中PIDD表達升高,與不良臨床病理特征有關,提示PIDD參與NSCLC腫瘤發生發展。PIDD作為一種分子開關,其表達及功能受伴侶分子的影響。研究發現,受體相互作用蛋白1結合于PIDD基因,促進PIDD基因的表達,PIDD能夠抑制天冬氨酸蛋白酶2,抑制p53的細胞周期阻滯效應,激活下游核因子κB通路,促進腫瘤惡性增殖[17]。有學者報道,在NSCLC中,PIDD能夠增強Kelch樣環氧氯丙胺相關蛋白1與核因子E2相關因子2相互作用,減少核因子E2相關因子2的泛素蛋白酶體途徑降解,上調成纖維生長因子21的表達,導致腫瘤細胞侵襲能力增強[18]。本研究中,NSCLC中PIDD與同源重組修復基因表達有關,提示PIDD能影響NSCLC的同源重組修復過程。研究表明,PIDD能夠與DNA依賴性蛋白激酶催化亞基相互作用,促進其募集到停滯的復制叉,激活ATR信號通路,上調同源重組修復基因表達,維持細胞在放化療等應激條件下的細胞存活[19-20]。另外,PIDD可通過促進腫瘤中同源重組過程,增強DNA損傷修復能力,但不完整的DNA損傷修復導致腫瘤積累DNA損傷,促進腫瘤逃逸免疫監視,導致腫瘤增殖和轉移[21-23]。本研究進一步分析發現,EMSY、PIDD mRNA聯合檢測對NSCLC具有較高的診斷價值,診斷的敏感度和特異度分別為0.871,0.802,具有潛在的臨床應用價值。

綜上所述,EMSY、PIDD在NSCLC癌組織中表達升高,與腫瘤分化程度、淋巴結轉移及腫瘤TNM分期有關,均參與NSCLC的腫瘤進展。NSCLC中EMSY、PIDD表達可能通過促進同源重組修復基因表達,干擾腫瘤DNA損傷修復過程,是潛在的NSCLC腫瘤治療靶點。臨床醫師可根據EMSY、PIDD的表達,評估NSCLC腫瘤惡性程度,指導臨床診治,以改善患者預后。但本研究也存在不足,樣本量有限,未能深入研究EMSY、PIDD調控同源重組修復基因表達的機制,有待今后進行深入探索。

利益沖突:所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明

陳麗萍:設計研究方案,實施研究過程,論文撰寫;項保利、王布:提出研究思路,分析試驗數據,論文審核;姬澤萱:實施研究過程,資料搜集整理;郭志青:進行統計學分析;趙建清:課題設計,論文修改