兔膝骨關節炎成纖維樣滑膜細胞分離培養方法的研究

陳芳 朱以良 張傳成 劉琴 喻晶 楊麗君 張宜

膝骨關節炎（knee osteoarthritis, KOA）是一種臨床上常見的慢性、膝骨關節退行性疾病，多見于中老年群體，主要病理表現為膝關節周圍骨質增生、滑膜炎癥、滑膜增生、關節軟骨損傷等[1-3]。KOA 患者中約90%伴有滑膜組織炎癥，貫穿KOA病程的各個時期[4]。KOA滑膜炎可以加劇軟骨退化、軟骨下骨增生及膝關節周圍骨贅的形成，導致KOA 的病理進程加劇和癥狀加重[5-7]。但KOA滑膜炎的發病機理尚不完全明確[8]。成纖維樣滑膜細胞（fibroblast-like synoviocytes, FLS）為滑膜中最主要的細胞，在KOA 的發病機制中有重要作用，可參與炎癥發生、滑膜血管形成等過程[9]。KOA 中FLS 的過度增殖、凋亡不足促使滑膜組織異常增生，是造成關節和軟骨破壞的主要原因[10-11]，成纖維樣滑膜細胞在KOA發病中扮演著重要作用，因此對FLS的研究意義重大。通過文獻研究與初步探索，本研究在傳統的組織塊培養法的基礎上優化分離培養出兔KOA成纖維樣滑膜細胞，通過傳代凍存滿足后續實驗需求，以期在細胞和分子水平對KOA 的作用機制進行深入研究，為KOA的藥物篩選治療提供了大量的細胞。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選取16只健康的新西蘭大白兔，購自萬千佳興實驗動物養殖場，生產合格證號：SCXK（鄂）2021-0011，雌雄不限，體重均在2.5 kg 左右。實驗地點：中部戰區總醫院實驗動物室[SYXK（鄂）2019-0082]。

1.2 主要材料與儀器

主要材料：胎牛血清（FBS，美國Gibco 公司），DMEM 高糖培養基（美國Hyclone 公司）；雙抗（青霉素、鏈霉素，武漢博士德生物工程有限公司），PBS緩沖液、胰蛋白酶（上海碧云天生物技術有限公司）；小鼠Vimentin抗體、熒光（Cy3）標記羊抗小鼠IgG（武漢博士德生物工程有限公司）；MTT、DMSO（美國Amersco公司）。

主要儀器：倒置顯微鏡、DP70熒光顯微鏡（日本奧林巴斯公司）；酶聯免疫分析儀（深圳市雷杜生命科學股份有限公司）；生物安全柜、二氧化碳恒溫細胞培養箱[賽默飛世爾科技（中國）有限公司]；迷你掌上離心機（北京大龍有限公司），康寧細胞計數器（廣州科適特科學儀器有限公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 兔KOA模型的制備及鑒定

將新西蘭兔16 只隨機分為正常組和模型組，每組各8只，造模方案根據本研究課題組預實驗基礎上制定，通過手術誘導建立膝骨關節炎兔模型，正常組正常飼養，不做任何處理。將模型組實驗動物稱重做好記錄后，耳緣靜脈注射3%戊巴比妥鈉，根據體重按1 mL/kg量的標準給藥麻醉，觀察，待完全麻醉后將實驗動物仰臥位固定，用剪刀剔除右下肢毛發，充分暴露皮膚，常規備皮，充分消毒右下肢側膝關節，皮下注射利多卡因局部麻醉，取髕旁內側切口，逐層分離切開，直到顯露髕骨后將髕骨向外側脫位，屈曲膝關節至完全暴露前交叉韌帶，輕輕摘除半月板，剪斷前交叉韌帶，然后迅速徹底止血，將髕蓋骨完全復位，充分消毒后逐層細致縫合切口并包扎，并注意觀察術后實驗動物狀態。模型組兔手術后連續3 d 肌內注射青霉素40 萬U/kg，預防感染。術后1 周等傷口逐漸恢復好后，開始每天固定時間段驅趕活動1 h，直至術后4周。術后滿4周，隨機抽取正常組和模型組各3只，對右下肢膝關節進行X 線檢查；并隨機抽取正常組和模型組各3 只，耳緣靜脈注射過量麻藥處死，解剖右下肢膝關節，觀察其變化，鑒定模型。

1.3.2 兔KOA成纖維樣滑膜細胞的分離培養

模型組術后4 周，經X 線確定為造模好的KOA 模型兔，取出4 只分別耳緣靜脈注射過量的麻藥處死。用剃毛刀刮凈右下肢毛發，充分消毒，在膝關節正中縱行切開皮膚，再次充分消毒切口處及周圍，在無菌環境下逐層分離組織直至關節囊后，用手術刀片輕輕刮離出關節囊的纖維層和滑膜層，通過手術止血鉗，找到光亮、平滑的地方，即為滑膜層組織，迅速將其輕輕取出，放入含雙抗（100 U/mL青霉素、0.1 mg/mL鏈霉素）的PBS液的無菌培養皿中。迅速移入超凈工作臺里面含有無菌生理鹽水的培養皿中，用含雙抗的PBS緩沖液清洗干凈，輕輕將上面附著的纖維、脂肪等組織剔除，用提前準備好的滅菌濾紙輕輕吸凈滑膜表面附著的液體，剪成2 ～ 3 mm3大小，置于提前用少量培養液濕潤過的一次性無菌平皿（3.5 cm）中，每皿中放入6 ～ 7 塊滑膜組織塊，組織塊均勻鋪開且不要靠近皿壁，在培養箱內放置5 ～ 6 min 后取出，在超凈臺內加入1 mL含雙抗、10%胎牛血清的高糖DMEM培養液，放入5% CO2、37℃培養箱內培養。24 h后鏡下觀察確定無污染后，每皿輕輕補加1 mL含雙抗、10%胎牛血清的高糖DMEM 培養液。根據培養液的顏色及組織塊狀況4 ～ 5 d后進行首次換液，每天定時觀察，約2 周后吸掉皿底的剩余組織碎塊，待培養皿內細胞布滿后，用含0.25%EDTA的胰蛋白酶液進行消化，按1∶2進行傳代培養，每天在倒置顯微鏡下觀察并適時拍照記錄生長狀況。

1.3.3 兔KOA成纖維樣滑膜細胞鑒定

將處于對數生長期的第3 代細胞在15 mL 一次性無菌離心管中制成均勻單細胞懸液，用鑷子將消毒好的蓋玻片置于每孔中，將細胞懸液接種在6 孔板中，其接種濃度為4×107個/L，置于37℃、5%二氧化碳培養箱內培養，隔天在倒置顯微鏡下觀察細胞狀態及有無污染，確定無污染后，培養48 h后于倒置顯微鏡下觀察細胞狀態，在超凈臺內輕輕吸出培養液，注意槍頭不要戳到無菌蓋玻片上，用PBS緩沖液輕輕沖洗蓋玻片2次，每次沖洗2 ～ 3 min。在6 孔板的每孔中加入2.5 mL 的4%多聚甲醛液，將洗凈的蓋玻片傾斜緩緩放入孔中，蓋上蓋子，于4℃冰箱中放置30 min，將細胞固定。取出蓋玻片，用一定量的PBS 緩沖液輕輕洗掉蓋玻片上多聚甲醛液，在室溫下加入2.5 mL的0.5%Triton X-100，進行通透，時間約為25 min。用一定量的PBS緩沖液清洗掉通透液，吸凈蓋玻片上液體，讓其上面無液體附著，在上面滴加山羊血清抗體進行封閉，作用30 min左右，取出蓋玻片直接吸掉殘余的液體，加入事先稀釋好的一抗（小鼠Vimentin抗體），置于濕盒中，放在冰箱中冷藏過夜。用PBS緩沖液清洗掉一抗，吸掉蓋玻片上液體，加入稀釋好的二抗（熒光標記羊抗小鼠IgG），置于濕盒中，在常溫下充分作用約60 min后，用一定量的PBS緩沖液清洗掉二抗，吸掉蓋玻片上液體，滴加DAPI 液，在暗室中作用5 min，完成細胞核染色。用一定量的PBS緩沖液多次清洗，吸掉蓋玻片上殘余DAPI，讓其上面無液體附著，然后進行封片，在熒光顯微鏡下觀察。

1.3.4 MTT法繪制細胞生長曲線

將傳至第三代的細胞制成均勻的單細胞懸液，稀釋成濃度為5×106個/mL，置于15 mL一次性無菌離心管中，邊搖動離心管邊接種至96孔培養板內，每孔細胞懸液200 μL，每組設置8個復孔，共7組，放在37℃、5%二氧化碳培養箱內培養，24 h后取出一組，在8個孔中，分別加入25 μL的MTT 液共培養，其濃度為5 mg/mL，在培養箱中放置4 h后取出，可見孔底形成藍紫色的結晶物，吸掉上清，每孔中依次加125 μL DMSO，震蕩搖勻，使其充分作用，溶掉結晶物，液體變成酒紅色，事先設置好酶標儀上波長（490 nm）參數，上機檢測各孔的A值。同法依次測出48、72、96、120、144、168 h 各孔的A 值。根據記錄各組A值，在電腦軟件上繪制出細胞生長曲線。

2 結果

2.1 兔KOA模型的鑒定

術后4 周，X 線片結果顯示，正常組關節面平整、光滑，無骨贅形成，無關節間隙狹窄；模型組關節面粗糙，有骨贅形成，關節間隙狹窄（見圖1）。解剖可見關節腔有明顯的積液（圖2A 對比圖2B），進一步剔除旁邊的組織，暴露關節，可見微血管增生和關節面痰液樣的炎性分泌物（圖2C 對比圖2D），提示兔KOA模型制備成功。

圖1 各組兔膝關節X射線片：A. 正常組；B. 模型組（病變位置用紅色箭頭標出）

圖2 兩組兔膝關節病變特征：A. 正常組膝關節；B. 模型組膝關節；C. 正常組關節解剖面；D. 模型組關節解剖面

2.2 兔KOA成纖維樣滑膜細胞形態觀察

每天觀察，當組織塊接種5 ～ 7 d后，在倒置顯微鏡下可見組織塊周圍松散、透亮，有大量堆積的圓點，少量細胞從組織塊周圍爬出來，其形狀似梭形（見圖3A）。9 ～14 d 后，鏡下可見組織塊周邊透亮，組織塊變少，周邊的細胞擁擠成片，大量細胞從組織塊爬出，組織塊周圍像網狀，以梭形為主，少數呈蝌蚪狀（見圖3B）。兩周后，輕輕沖洗底部組織塊并吸掉，進行換液。15 ～ 21 d后，數量明顯增多，平皿底部布滿細胞，以長梭形為主（見圖3C）。約24 d 后，在倒置顯微鏡下可見平皿底部密密麻麻細胞，緊密排列，似長扁梭形（見圖3D），換液、消化后按1∶2比例進行傳達培養。

圖3 原代兔關節炎成纖維樣滑膜細胞培養（×100）。A. 原代培養5 ～ 7 d；B. 原代培養9 ～ 14 d；C. 原代培養15 ～ 21 d；D. 首次傳代前細胞

2.3 兔KOA成纖維樣滑膜細胞的鑒定

免疫熒光染色后，在鏡下觀察，檢測結果顯示，Vimentin 表達呈陽性，鏡下觀察不同放大倍數下染色的形態（見圖4）。

圖4 免疫熒光檢測兔KOA 成纖維樣滑膜細胞中波形蛋白表達情況：A. ×40； B. ×100；C. ×200；D. ×400

2.4 兔KOA成纖維樣滑膜細胞生長曲線

根據MTT法檢測不同時間段各孔光密度值，制作細胞生長曲線圖，呈“S”形（見圖5），表明傳至第三代細胞活性強，生長旺盛，呈對數生長期。

圖5 兔關節炎成纖維樣滑膜細胞生長曲線

3 討論

KOA 的發病受多種因素的影響，其發病機制尚不明確，目前尚無特效藥物可以治療此病，主要以對癥治療為主[12]。KOA的主要病變是關節軟骨的退變與破壞，滑膜炎繼發于軟骨病變后，起著至關重要的作用；而且在KOA全膝關節成形術患者中，滑膜炎的嚴重程度直接與現行功能障礙及殘疾程度密切相關[13]。隨著滑膜炎病變加劇，對骨質、關節軟骨會帶來進一步破壞，導致KOA 患者病情加速，如活動受限、關節腫痛等癥狀的加重，但目前滑膜炎病變發病機制尚不完全明確，從細胞、分子學角度探索其發病機制與治療效果有著重要的理論價值和指導臨床給藥作用，因此對膝骨關節炎成纖維樣滑膜細胞培養方法的研究意義重大[14]。

關節囊分為內外兩層，外層為致密結締組織，在韌帶和腱的相連處增厚；內層較疏松，稱為滑膜?；け砻嬗? ～ 4 層立方形或扁平的上皮樣結締組織細胞，即為滑膜細胞，細胞間有少量的基質和纖維?；ぜ毎譃閮煞N，一種稱為M 細胞似巨噬細胞，含較多溶酶體，有吞噬能力；另一種稱為F 細胞似成纖維細胞，含較多的粗面內質網，可分泌黏蛋白和透明質酸，形成滑膜液，潤滑關節，對關節軟骨的軟骨細胞提供營養及氧氣[15-16]?；そM織中最活躍的細胞是滑膜成纖維細胞，對關節正常功能的維持起著重要作用，同時參與各種關節病變，通過旁分泌或自分泌方式產生大量的炎性細胞因子及免疫反應介質，加速軟骨基質的降解，是引起各種臨床癥狀的主要因素[17-18]?；ぱ装Y及增生是膝骨關節炎的重要病理特征之一，滑膜組織中的滑膜成纖維細胞、單核細胞或巨噬細胞通過分泌相關基質金屬蛋白酶（基質金屬蛋白酶1、基質金屬蛋白酶3 和基質金屬蛋白酶9 等）和炎癥細胞因子引起軟骨損傷[18-19]。因此，治療KOA的一種思路是抑制滑膜細胞增殖。體外原代細胞的培養能很好地模擬體內細胞的生長環境，通過多種因素的影響，在此基礎上開展相關機理及藥效學研究，是一種常見的研究手段，因此體外進行兔KOA模型的FLS原代培養能提供前期KOA相關機理研究的細胞工具。

深入研究KOA的發病機制和藥效學評價離不開動物模型，目前膝骨關節炎模型的制備方法主要是手術創傷法[20]。手術創傷法包括傳統Hulth法及改良Hulth法，但都對膝關節損害過大，成模過程與臨床上膝骨關節炎的發病機理不能吻合[21]。大、小鼠膝關節過小，不利于后期的觀察、操作，且取材困難；而兔子為中等體型動物，膝關節體積較大，價格也不貴。在衡量其利弊的基礎上，本研究中采用的兔膝骨關節炎模型是課題組通過預實驗反復對比摸索出來的，相比于傳統手術創傷法既能達到成模要求，又可以減少膝關節損傷，更貼近臨床膝骨關節炎的發病過程[22]。

原代細胞培養主要有機械分散法、組織塊培養法和酶消化法[23]。目前，FLS 的原代培養主要是組織塊培養法和酶消化法，但各有利弊：組織塊培養法周期長，操作煩瑣、容易污染，一些細節沒把控好容易導致實驗失??；酶消化法雖然能快速提取細胞，但酶的濃度及作用時間很難把控，酶消化過度很容易導致細胞死亡，酶消化時間不夠則獲得的細胞量太少。本研究在傳統組織塊培養法的基礎上進行摸索和改進，組織塊清洗完之后，未立即轉移至培養皿，而是用無菌的吸水紙輕輕吸掉上面明顯的液滴后置于培養皿底部，放培養箱5 min 后，滑膜組織塊牢固貼在培養皿底部，輕輕加入培養液直到培養皿體積的一半，24 h后加滿培養液。傳統組織塊培養法未進行吸去上面附著液體這一步的處理，組織塊貼壁時間為2 ～ 4 h，由于貼得不夠牢固，操作稍微不慎或是晃動一下組織塊就會脫離皿底或漂浮在液面，影響細胞爬出量，導致培養失敗?；そM織的取材相當煩瑣，而且量比較少，需要反復操作，才能熟練掌握；取出的滑膜組織量少，顯得非常珍貴，剔除上面少量的纖維和脂肪要特別小心，否則破壞滑膜；滑膜處理好后，不是剪得越碎越好，而是要在2 ～ 3 mm3，放在皿底的組織塊也不是越多越好，而是要適量且保持一定的距離，每皿6 ～ 7 塊。注意組織塊大小和接種到皿底的組織塊數量，都是通過前期預實驗反復摸索出來的，沒把握好這個標準就很容易導致培養實驗失敗。本研究通過差速貼壁法獲得高純度的KOA兔FLS，傳至第三代細胞采用免疫熒光染色鑒定，Vimentin 蛋白表達陽性，染色顯示細胞呈紡錘形，生長曲線呈“S”形，細胞活性強，可用于后續實驗研究，與筆者及團隊前期研究一致[24-25]。

兔成纖維樣滑膜細胞原代培養過程中要特別注意以下事項：①取材過程要確保在無菌條件下進行，避免組織污染；②準確定位滑膜組織，快速取出，避免時間過長，導致組織活性喪失；③預估培養皿放置組織塊間距，間距均勻，否則不利于細胞生長；④密切觀察不同時間的細胞狀態，注意把控換液時間、消化程度，否則會影響細胞生長，甚至導致細胞死亡。這些都需要通過前期大量的預實驗來摸索，才能確保實驗成功，以期為同行研究者提供實驗方法的依據。

綜上，通過手術誘導建立兔膝骨關節炎模型，對組織塊培養法進行改進，培養的兔膝骨關節炎成纖維樣滑膜細胞為典型的梭形，符合成纖維樣滑膜細胞的生長特征，免疫熒光染色顯示波形蛋白強表達。此法操作簡單，可重復性強，可為后續開展KOA的機制研究提供大量細胞。