miR-124-3p調控激素性股骨頭壞死患者骨髓間充質干細胞成骨分化作用的研究*

楊增強 郝飛虎 原天祎 周治衡 崔泳

激素性股骨頭壞死（steroid-induced necrosis of femoral head, SINFH）是因為長期使用糖皮質激素及其衍生藥物導致的嚴重骨科疾病。SINFH的主要病理學特點是骨細胞和骨髓的慢性持續性壞死，最終導致股骨頭的破壞坍塌[1-3]。雖然藥物治療及核心減壓對SINFH 有一定的效果[4]，但早期的干預也只能減輕激素的副作用[5]。因此，尋找SINFH的發病機制和早期治療的有效方法在骨科領域至關重要。

既往研究表明，SINFH 與骨髓間充質干細胞（bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs）的成骨能力和成脂能力失衡有關[6]。骨髓間充質干細胞的分化方向受骨形態發生蛋白（bone morphogenetic proteins, BMPs）、Wnt 和Notch 等信號通路，Runx2、C/EBP 和PPARγ 等轉錄因子，非編碼RNA，激素及線粒體等眾多因素的調控，任何環節的異常都可能導致病理狀態的發生[7]。

非編碼RNA（noncoding RNA, ncRNAs）是一類調節基因表達的小分子RNA，可以調控基因的表達和轉錄[8-9]，在SINFH 中發揮著重要作用[10-11]。CTNNB1 基因可以編碼蛋白質β-連環蛋白（β-Catenin），參與調控細胞的增殖和凋亡，以及調節骨形成和骨吸收之間的平衡[12]。有研究發現，miR-322-5p、miR-124-3p、miR-125a-3p和CTNNB1的表達失衡與SINFH 有關[13]。同時，miR-124 對人類BMSC的生物學功能有一定的影響[14]。然而，miR-124-3p、CTNNB1在SINFH中的作用和分子機制仍不清楚。本研究主要探討SINFH 中miR-124-3p 對BMSCs 的調控作用及其與CTNNB1 的相關性，明確miR-124-3p 對BMSCs 的調控作用，為SINFH的診治提供依據。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

細胞培養箱（美國Thermo Fisher 公司）；超凈工作臺（蘇州安泰科技有限公司）；低溫冷凍離心機（德國Sigma公司）；Real-time檢測儀（美國Thermo Fisher公司）；研究級倒置顯微鏡（中國廣州市明美科技有限公司）；人骨髓間充質干細胞（中國武漢普諾賽生命科技有限公司）；F12K培養基、FBS（美國Hyclone 公司）；miR-124-3P NC、miR-124-3P mimic、 miR-124-3p inhibitor、 CTNNB1-3'UTR-WT、CTNNB1-3'UTR-MUT 載體（上海吉瑪制藥技術有限公司）；DMEM、血清、胰酶（美國Gibco 公司）；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒（美國Promega 公司）；Trizol 試劑、Lipofectamine? 3 000（美國Invitrogen 公司）；SYBR Green PCR試劑盒（美國Thermo Fisher公司）；逆轉錄試劑盒（美國Thermo Fisher 公司）；抗CTNNB1 抗體（美國Abcam公司）。

1.2 一般資料

1.2.1 病例選擇

選擇在2020 年9 月到2022 年5 月就診于新疆醫科大學第五附屬醫院行髖關節置換術的患者，術中擴髓時收集骨髓組織。期間收集SINFH 患者病例20 例隨機選擇15 例作為實驗組，收集股骨頸骨折（無SINFH）患者病例28例隨機選擇15例作為對照組。SINFH診斷定義為平均每日使用類固醇激素劑量16.6 mg 或最高每日劑量80 mg，至少1年[15]，由磁共振圖像確認。有慢性疾病、癌癥或飲酒的患者被排除在外。本研究經新疆醫科大學附屬第五醫院倫理委員會批準（XYDWFYLS-2019-06），所有方法均按照相關指南和規定進行，患者已知曉此研究并取得同意。

1.2.2 BMSCs來源

細胞培養在DMEM培養基中，其中含有10%胎牛血清細胞（fetal bovine serum, FBS）、100 U/mL青霉素和100 mg/mL鏈霉素。用甲潑尼龍（輝瑞，美國）處理細胞建立SINFH細胞模型，濃度為4 mg/106個細胞，每8 h 1次，共處理5次。培養在37℃、5% CO2的培養箱中，用于后續實驗。

1.3 方法

1.3.1 qRT-PCR檢測miR-322-5p、miR-124-3p、miR-125a-3p以及CTNNB1表達

收集實驗組和對照組擴髓時的骨髓組織，采用Trizol法提取總RNA，純化，逆轉錄獲取互補cDNA。反應體系：SybrGreen qPCR Master Mix 10 μL，cDNA 模板1 μL，上下游引物各0.4 μL。反應條件：95℃預變性5 min；95℃變性30 s，95℃退火5 s，72℃延伸30 s。各引物及其序列如表1 所示。以U6 為內參，采用2-△△CT法計算miR-322-5p、miR-124-3p、miR-125a-3p及CTNNB1表達量。

表1 反應體系中各引物及其序列

1.3.2 Western Blot檢測CTNNB1蛋白的表達水平

用冰凍的含蛋白酶抑制劑的放射性免疫沉淀試驗（RIPA）裂解緩沖液從骨髓間充質干細胞中提取蛋白質。用10%SDS-PAGE 分離等量的蛋白質，然后轉移到聚偏氟乙烯膜上。用脫脂干牛奶阻斷后，用特異性一抗孵育膜。然后用酶標二抗孵育膜。以β-肌動蛋白作為內參蛋白，測定CTNNB1蛋白表達水平。

1.3.3 細胞轉染及分組

分別用無血清培養基稀釋miR-124-3p mimic、miR-124-3p mimic NC、miR-124-3p inhibitor（DNA含量為3 μg），根據Lipofectamine? 3 000轉染試劑說明書轉染。依次分為BMSC 組、BMSC+miR124-3p+NC 組、BMSC+miR124-3p+inhibitor 組、BMSC+miR124-3p+mimics 組。轉染48 h 后，收集細胞。

1.3.4 轉染后各組細胞中miR-124-3p和CTNNB1的表達

取上述細胞接種于24孔板，各組設置3個復孔。待細胞貼壁后，提取RNA 進行q-RTPCR 檢測，其反應體系、引物、條件同前。PCR擴增后，實時熒光定量PCR儀自動分析結果，采用2-△△CT法計算miR-124-3p 和CTNNB 的相對表達量。Western Blot操作同前。

1.3.5 分化能力評估

取轉染分組后細胞接種于培養皿，使其匯合度為70% ～ 80%。分為兩組，分別棄去原培養基，一組進行成骨誘導（osteoblasts induction, OI）分化，添加成骨誘導培養基（內含50 mM 抗壞血酸、100 nM 地塞米松、10 mM β‐磷酸甘油和15%胎牛血清），另一組進行成脂誘導（adipogenic induction, AI）分化，添加成脂誘導培養基（內含10 μg/mL 胰島素，1 μM 地塞米松，0.5 mM IBMX 和0.1 mM吲哚美辛）。2 d換液一次，15 d后分別進行茜素紅染色和油紅O染色，顯微鏡下觀察拍照。

1.3.6 miR-124-3p與CTNNB1的靶向驗證

利用生物信息學數據庫Starbase 預測miR-124-3p 與CTNNB1的結合位點。轉染前一天，將細胞接種于24孔板內，使其匯合度為70% ～ 80%。按照試劑盒說明書步驟提取質粒，然后將miR-124-3p mimics和提取的質粒共轉染進BMSCs。具體組別為CTNNB1-3'UTR-WT+NC、CTNNB1-3'UTR-WT+hsa-miR-124-3p mimic、CTNNB1-3'UTR-MUT+hsa-miR-124-3p mimic，48 h后，依據雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒（Promega）使用說明檢測海腎熒光素酶（RL）和螢火蟲熒光素酶（FL）的強度。

1.4 統計學方法

采用SPSS 25.0軟件進行統計學分析。所有數據均以均數±標準差表示，組間差異采用t檢驗，兩兩比較采用LSDt檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組患者BMSCs 中miR-322-5p、miR-124-3p、miR-125a-3p及CTNNB1表達

qRT-PCR實驗結果顯示，實驗組BMSCs中miR-124-3p的表達量低于對照組，miR-125a-3p 和CTNNB1 的表達量高于對照組（P＜0.001），miR-322-5p的表達量未見明顯差異，見圖1。

圖1 qRT-PCR實驗結果：A. miR-124-3p表達水平；B. miR-322-5p表達水平；C. miR-125a-3p表達水平；D. CTNNB1表達水平

2.2 Western Blot檢測CTNNB1蛋白的表達水平

Western Blot結果顯示，實驗組CTNNB1蛋白表達水平高于對照組（P＜0.05），差異具有統計學意義，結果見圖2。

圖2 CTNNB1 蛋白Western Blot 檢測結果：A. CTNNB1 蛋白電泳條帶；B. CTNNB1相對表達水平

2.3 轉染后各組miR-124-3p和CTNNB1表達比較

轉染miR-124-3p mimics組miR-124-3p表達量高于BMSC組和BMSC+miR124-3p+NC 組（P＜0.001），而CTNNB1表達量低于BMSC組和BMSC+miR124-3p+NC組（P＜0.001）；轉染miR-124-3p inhibitor 組miR-124-3p 表達量低于BMSC組和BMSC+miR124-3p+NC 組（P＜0.001），CTNNB1表達量高于BMSC 組和BMSC+miR124-3p+NC 組（P＜0.001），見圖3。

圖3 轉染后各組miR-124-3p 和CTNNB1 表達量：A. 轉染后miR-124-3p的表水平；B. 轉染后CTNNB1的表達水平

2.4 轉染后CTNNB1蛋白的表達水平

Western Blot 結果顯示，BMSC 組和轉染miR-124-3p+NC組CTNNB1蛋白表達水平沒有差異。轉染miR-124-3p+inhibitor 組和BMSC 組相比，CTNNB1 蛋白表達水平較高（P＜0.001）。轉染miR-124-3pmimics 組和BMSC 組相比，CTNNB1蛋白表達水平較低（P＜0.001）。結果見圖4。

圖4 轉染后CTNNB1 蛋白Western Blot 檢測結果：A. CTNNB1 蛋白電泳條帶；B. 各組CTNNB1表達水平

2.5 分化能力評估

2.5.1 成骨分化結果

BMSCs成骨誘導15 d后進行茜素紅染色，結果顯示各組有紅色鈣結節形成，提示成功誘導BMSCs向成骨細胞分化，結果見圖5。

圖5 成骨誘導分化結果：A. BMSCs+OI組；B. BMSCs+OI+NC組；C. BMSCs+OI+miR-124-3p+mimic組；D. BMSCs+OI+inhibitor組

2.5.2 成脂誘導結果

BMSCs 成脂誘導15 d 后進行油紅O 染色，結果顯示，各組有脂滴形成，提示成功誘導BMSCs 向脂肪細胞分化，結果見圖6。

圖6 成脂誘導結果：A. BMSCs+AI 組；B. BMSCs+AI+NC 組；C. BMSCs+AI+miR-124-3p mimic 組；D. BMSCs+AI+miR-124-3p inhibitor組

2.5.3 成骨和成脂誘導數據分析結果

在對成骨誘導實驗結果進行分析后發現，與BMSCs+OI組和BMSCs+OI+NC 組相比，BMSCs+OI+miR-124-3p mimic組染色區域擴大（P＜0.01）；BMSCs+OI+miR-124-3p inhibitor 組染色區域減?。≒＜0.01），這提示BMSCs+OI+miR-124-3p mimic組鈣沉積多于其他組，過表達miR-124-3p可以促進BMSCs 的成骨分化；抑制miR-124-3p 表達則結果相反，結果見圖7。

圖7 染色區域相對面積：A. 成骨誘導茜素紅染色區域相對面積； B. 成脂誘導油紅O染色區域相對面積

在對成脂誘導實驗結果進行分析后發現，與BMSCs+AI 組和BMSCs+AI+NC 相比， BMSCs+AI+miR-124-3p mimic 組染色區域減少（P＜0.01），BMSCs+AI+miR-124-3p inhibitor 組染色區域擴大（P＜0.01），這提示BMSCs+AI+miR-124-3p inhibitor 組脂滴形成增多，而BMSCs+AI+miR-124-3p mimic 組脂滴形成較少，過表達miR-124-3p 可抑制BMSCs 的成脂分化；抑制miR-124-3p 表達則結果相反，結果見圖7。

2.6 miR-124-3p與CTNNB1的靶向驗證結果

Starbase 數據庫中檢索發現，CTNNB1-3'UTR 含有miR-124-3p的結合位點。實驗結果顯示與對照組相比，轉染miR-124-3p mimic 的野生型CTNNB1 熒光素酶報告質粒相對活性下降（P＜0.01）。而CTNNB1-MUT 組與對照組熒光素酶活性相比，兩者活性相當，差異無統計學意義（P＞0.05）。說明CTNNB1-WT 與miR-124-3p 存在靶向關系，結果見圖8。

圖8 CTNNB1 與miR-124-3p 的結合位點和雙熒光素酶實驗結果：A. CTNNB1與miR-124-3p的結合位點；B. 雙熒光素酶實驗結果

3 討論

激素性股骨頭壞死（SINFH）是激素的副作用導致的髖關節退行性病變。截至目前，其潛在的發病機制仍然不清楚，這限制了人們對激素性股骨頭壞死的診斷和治療，雖然早期可以通過髓內減壓和移植骨瓣等手段緩解病情[16-17]，但遠期的效果并不理想，給醫生和患者帶了很大困擾。

MiRNA作為一類高度保守的內源性非編碼單鏈RNA，在調節基因表達中起著重要作用[18]。大量的研究表明，miRNAs 參與調控脂質和骨代謝[19-20]，從而影響SINFH 的發生發展過程。在本研究中，筆者證實miR-124-3p和miR-125a-3p在實驗組和對照組中差異表達，且實驗組miR-124-3p 表達量低于對照組，miR-125a-3p 表達量高于對照組。miR-124-3p作為一種基因調控因子，對細胞的增殖、凋亡和分化起著很重要的作用，miR-124-3p可以與STAT3結合抑制鼻咽癌細胞的增殖和轉移[21]。同時miR-124-3p可以調控血管平滑肌細胞、心肌細胞和神經元細胞的增殖和凋亡[22-24]，過表達miR-124-3p 可以增強細胞活性，減緩細胞凋亡。有學者在對綿羊基質血管組分（stromal vascular fraction, SVF）分化研究中發現，過表達miR-124-3p 可以減弱SVF 成脂作用，抑制miR-124-3p 表達則結果相反[25]。這與本研究結果吻合，本研究中過表達miR-124-3p促進了BMSCs 的成骨作用，減弱了BMSCs 的成脂作用。過量激素誘導骨髓間充質干細胞可造成骨標志物Alpl、Bglap 和Runx2 的降低，但過表達miR-124-3p 可以逆轉骨髓間充質干細胞的生理活動，促進Alpl、Bglap和Runx2等成骨標志物的表達[26]。

CTNNB1編碼β-catenin蛋白，鈣粘蛋白黏附復合物的組成部分，調節細胞-細胞黏附和典型Wnt信號通路中的基因表達，典型的Wnt/β-catenin信號通路是祖細胞增殖和分化的重要調節因子，是各種人類疾病發病機制的核心，包括那些影響骨骼發育和腫瘤進展的疾病。在維持關鍵的生物穩態方面受到高度調控。CTNNB1的異常積累與大多數癌癥有關。研究發現，抑制CTNNB1可抑制腎癌細胞的增殖、遷移和侵襲，并誘導細胞凋亡。過表達CTNNB1可以促進腎透明細胞癌細胞的增殖、遷移和侵襲，抑制細胞凋亡[27]。CTNNB1 變異與兒童硬化性骨發育不良和腎上腺皮質腺瘤[28]、痙攣性雙癱瘓和視覺缺陷的神經發育障礙[29]以及子宮內膜異位癥細胞增殖和侵襲[30]緊密相關。大量研究證實，Wnt信號通路可以調節骨骼和骨量發育，激活Wnt/β-catenin 信號通路可以促進BMSCs 的成骨分化[31-33]。β-catenin 是Wnt 信號通路的組成部分，并且是該信號通路的核心蛋白，其活性和含量對BMSCs的成骨分化具有重要作用[34]。本研究中雙熒光素酶實驗結果顯示，miR-124-3p與CTNNB1 有潛在的結合位點，提示miR-124-3p 可能在Wnt信號通路中發揮一定作用，然而miR-124-3p/CTNNB1發揮的功能、發揮功能的途徑及下游的靶基因仍需進一步的研究。

在本研究中，筆者對激素誘導的股骨頭壞死患者骨髓組織進行了研究，發現在SINFH患者體內miR-124-3p的表達量下降，CTNNB1的表達量升高；進一步實驗證實過表達miR-124-3p 可以促進BMSCs 的成骨分化；同時miR-124-3p和CTNNB1有靶向結合關系。為激素性股骨頭壞死的研究提供了一個新思路，做出了一定的補充。

總而言之，本研究表明，miR-124-3p在SINFH患者中表達量下降，miR-124-3p 可以靶向結合CTNNB1，并且過表達miR-124-3p可以促進BMSCs的成骨分化。