響應面法優化血糯米花青素提取工藝及抗氧化活性研究

龍弟梅，張月琴，葉雨欣，項慧靈，喻 穎，葉文峰

（宜春學院化學與生物工程學院，江西宜春 336000）

血糯米，稻米類植物，成熟米粒種皮紫紅，口感香甜軟糯，又稱“黑糯米”。血糯米富含多種營養素，包括豐富的維生素、蛋白質、生物吡咯色素，和鈣、鎂等常量礦物質元素與鐵、銅、鋅、硒等微量礦物質元素，研究發現血糯米中含有的脂肪、維生素、氨基酸等營養素均高于普通米的含量[1]。血糯米具有健脾養胃、滋陰益腎、明目補肝、益氣強身等方面的功效,是預防疾病、抗衰養顏、健體強身的滋養佳品[2]。

花青素又稱“花色素”，在不同pH 條件下呈現不一樣色澤的天然色素，是形成花瓣和果實的顏色的重要物質?；ㄇ嗨貙儆诜宇惢衔锏囊环N類黃酮化合物，具有抗氧化、抗炎、抗癌、抗衰老、保健皮膚等方面的功效[3]，常見的提取方法有溶劑提取法、水提取法、超聲波提取法、樹脂法等。

血糯米具有花色苷類(黑色素),經鑒定其主要成分是矢車菊-3-葡糖苷（Cy-3-Glu)，為水溶性紅色素[4]。血糯米花青素具有天然色素安全可靠且對環境友好的特點[5]，營養保健，具有良好的開發前景。利用血糯米開發的產品也越來越多樣，比如血糯米牛軋糖[6]、血糯米冰淇淋[7]、血糯米軟曲奇[8]、血糯桂圓酒[9]等。查閱有關文獻發現，當前對血糯米花青素的提取研究分析相對較少，因此本實驗選用血糯米為原料，使用溶劑提取法提取血糯米花青素，結合單因素試驗以及響應曲面法優化其提取工藝，并考察血糯米花青素抗氧化性能，為血糯米花青素的進一步開發應用提供參考。

1 材料與設備

1.1 實驗材料

血糯米，購于江西省宜春市富佳超市；2,2-聯氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）購于Sigma 公司；無水乙醇、鹽酸、氯化鉀、乙酸鈉、過氧化氫、水楊酸、抗壞血酸Vc，購于天津市永大化學試劑有限公司；硫酸亞鐵、過硫酸鉀購于西隴科學股份有限公司。

1.2 實驗設備

CS-1000高速多功能粉碎機CS-1000；HH-2數顯恒溫水浴鍋；SHZ-D(III)循環水式多用真空泵；DHG-9053A 電熱恒溫鼓風干燥箱；FE28/FE20K 臺式數顯酸度計；UV752紫外可見分光光度計；SQP電子天平。

2 實驗方法

2.1 血糯米花青素提取工藝流程

血糯米干燥→粉碎→過80目篩→乙醇回流提取→抽濾→定容→測血糯米花青素含量

2.2 血糯米花青素提取工藝

市購的血糯米先在設定溫度為50 ℃的烘箱中進行干燥，充分干燥后取適量血糯米到粉碎機中進行粉碎處理，過篩。稱取1.00 g 血糯米粉，在pH 值為2的條件下進行浸提，并經真空抽濾，得到的血糯米提取液，再用一定濃度的乙醇溶液定容到50 mL，搖勻后避光保存。

2.3 血糯米花青素含量測定與計算

使用pH 示差法[11]測定血糯米花青素的含量，使用公式：

上式中：T是樣品總花青素的含量，單位mg/g；A=（A525－A700）pH1.0－（A525－A700）pH4.5，pH1.0代表pH 值為1.0，pH4.5代表pH 值為4.5；A為吸光度；525、700 分別為紫外線波長，單位nm；V是血糯米提取液的總體積，單位mL；m是取樣量，單位g；DF是稀釋因子；26900 是Cy-3-Glu（矢車菊-3-葡萄糖苷）摩爾消光系數；449.2 是Cy-3-Glu 相對分子質量；L是光程，數值為1 cm。

2.4 單因素實驗

2.4.1 乙醇濃度對血糯米花青素提取的影響

分別稱取1.00 g樣品，樣品的料液比設為1 g∶10 mL，分別加入濃度為30%、40%、50%、60%、70%的乙醇溶液，在50 ℃的水浴條件下提取60 min，分析不同的乙醇濃度對血糯米中花青素提取的影響。

2.4.2 料液比對血糯米花青素提取的影響

分別稱取1.00 g 樣品，加入60%乙醇溶液，樣品的料液比設成1 g∶10mL、1g∶15mL、1 g∶20mL、1 g∶25mL、1 g∶30 mL，在條件為50 ℃的水浴中提取60 min，分析不同的料液比對血糯米中花青素提取的影響。

2.4.3 提取溫度對血糯米花青素提取的影響

分別稱取1.00 g樣品，樣品的料液比為1 g∶10 mL，加入60 %乙醇溶液10 mL，分別在40、50、60、70、80 ℃的水浴下，提取60 min，分析不同的提取溫度對血糯米中花青素提取的影響。

2.4.4 提取時間對血糯米花青素提取的影響

分別稱取1.00 g樣品，樣品的料液比為1 g∶10 mL，加入60%乙醇溶液10 mL，在溫度為50 ℃的水浴中分別提取15、30、45、60、75 min，分析不同的提取時間對血糯米中花青素提取的影響。

2.5 響應面設計實驗

依據單因素試驗的結果，固定血糯米花青素的提取時間為45 min，同時把料液比、提取溫度、乙醇濃度作為自變量，血糯米花青素含量作為因變量。通過使用Design Expert 8 軟件，以及依照Box-Bexhken中心組合試驗設計原理，通過展開回歸分析處理實驗數據，從而獲得血糯米花青素提取的最佳工藝參數。

2.6 血糯米花青素體外抗氧化分析

2.6.1 羥自由基清除率

清除羥基自由基活性測定試驗采用水楊酸法[12]，對提取后的花青素和VC 配制成不用質量濃度梯度，同時設置空白組和對照組，對其吸光值的測定。

羥自由基的清除率：

2.6.2 ABTS自由基清除率的測定

ABTS 自由基清除率實驗測定，參照只德賢等[13]的測定方法，對提取后的花青素和VC 配制成不用質量濃度梯度后進行其吸光值的測定。

ABTS自由基的清除率：

3 結果與分析

3.1 花青素得率的單因素試驗及結果

3.1.1 不同乙醇濃度對血糯米花青素提取的影響

乙醇濃度對血糯米花青素提取的影響見圖1。

圖1 乙醇濃度對血糯米花青素的影響

提取的血糯米花青素的含量會隨著乙醇體積分數的升高而增大。當乙醇濃度達到50%時，此時花青素含量最高，再增大乙醇體積分數，提取的花青素含量會降低。這也許是因為乙醇濃度上升，部分會同花青素一起競爭與乙醇－水分子結合的機會的醇溶性雜質以及親脂性比較強的物質溶出量增多[14]，或乙醇濃度超過了一定的閾值，使花青素溶解性下降，致使血糯米花青素含量下降。所以，選擇最佳的乙醇體積分數為50%。

3.1.2 不同料液比對血糯米花青素提取的影響

料液比對血糯米花青素提取的影響見圖2。

圖2 料液比對血糯米花青素的影響

溶劑提取的血糯米花青素含量會隨料液比的增加逐漸增大，當料液比是1 g∶25 mL 時最大，進一步增加料液比，花青素含量明顯下降?？赡苡捎谒衷黾佣岣吡巳芤旱娜苎趿?，溶液發生氧化反應。提取溶劑用量增加，血糯米粉同溶劑的接觸面積會增大，使花青素的溶出更加有利，當處于飽和狀態時，提高溶劑的用量，會提取出一些不利的雜質且會增添成本。并且，增多提取溶劑的用量，會使花青素濃度降低，從而致使分子間作用力減小，花青素穩定性被直接降低了[15]所以，選擇最佳的料液比1 g∶25 mL。

3.1.3 不同提取溫度對血糯米花青素提取的影響

提取溫度對血糯米花青素提取的影響見圖3。

圖3 提取溫度對血糯米花青素的影響

可以看出，如果溫度大到一定程度后再增大，血糯米花青素的含量會下降，當溫度達到70 ℃時，提取的血糯米花青素含量最多。由于溫度上升，提升了分子運動速度，其擴散、滲透與溶解速度也會提高，則血糯米花青素浸出速度會加快，提取含量增多[16]。進一步升高溫度，提取的花青素含量反而下降，可能是溫度過高造成色素氧化，血糯米色素結構破壞，發生降解，穩定性降低。所以，選擇最佳的提取溫度為70 ℃。

3.1.4 不同提取時間對血糯米花青素提取的影響

提取時間對血糯米花青素提取的影響見圖4。

圖4 提取時間對血糯米花青素的影響

因為花青素的不穩定性，花青素提取45 min效果最好，隨時間的延長，提取的花青素含量呈現下降趨勢。因為空氣氧化作用會造成花青素分解，使色素含量下降；隨提取時間延長，血糯米花青素的溶出量增加，花青素溶解達到飽和時，提取率不再上升；提取時間過久，會出現不必要的雜質，花青素的純度下降[17]。所以，選擇最佳的提取時間為45 min。

3.2 響應曲面優化實驗

3.2.1 響應曲面實驗設計及結果

依據單因素實驗的結果，使用Box-Bexhken中心組合設計，設乙醇濃度、料液比、提取溫度當做自變量，設計三因素三水平響應曲面實驗，提取液中的花青素含量是響應值，因素同水平見表1，做響應面實驗，設計及結果見表2、表3。

表1 響應曲面設計試驗因素與水平

表2 響應曲面法試驗結果

表3 響應曲面二次多項式模型的方差分析

3.2.2 提取含量模型建立與分析

本實驗各因素與響應值之間的函數關系的回歸方程為：Y=0.21+1.000E-003×A+2.500E-004×B-0.012×C+2.500E-004 ×AB-6.25E-003 ×AC+9.75E-003 ×BC-0.015×A2-0.015×B2-0.026×C2。Y，提取含量；A，乙醇濃度；B，料液比；C，提取溫度。由方差分析可知，模型P＜0.000 1 極顯著，失擬項P=0.140 8＞0.05 不顯著，R2=0.982 8，校正擬合度（R2adj=0.960 6）與展望擬合度（R2pred=0.796 4）一致性較好，說明實驗數據的置信度較高、該回歸方程可有效擬合各因素與響應值間的關系。C（提取溫度)、BC（料液比與提取溫度）的P＜0.01，表明C（提取溫度)、BC（料液比與提取溫度）對血糯米花青素提取影響極顯著，AC（乙醇濃度與提取溫度）的P＜0.05，說明AC（乙醇濃度與提取溫度）對提取含量的影響顯著；比較各因素的F值，C（提取溫度)＞A（乙醇濃度）＞B（料液比），說明影響提取含量起主要作用的是提取溫度，乙醇濃度的作用占第二位，料液比的作用最小。進一步說明此模型可以較好的反映響應值的改變和回歸方程的有效性。

3.2.3 響應曲面結果分析

根據回歸方程得到的數學模型，通過Design-Expert軟件繪制由各因素交互作用構成的響應曲面圖，并進行分析。

乙醇濃度和料液比對提取含量交互影響如圖5所示，固定提取溫度為零水平。從圖a響應曲面及圖b等高線可知，表明響應值受乙醇濃度同料液比的交互作用不明顯。料液比為在1 g∶22 mL～1 g∶26 mL范圍內達到最大值。固定料液比，血糯米花青素的提取含量在乙醇濃度大小為在45%～55%。范圍內提前含量達到最大值。

圖5 （a）乙醇濃度和料液比的交互項響應面圖面及（b）等高線

醇濃度和提取溫度對提取含量交互影響如圖6所示，由圖6 中的圖a 可知，提取含量隨著乙醇濃度的增加呈先增加后降低的趨勢，當乙醇濃度較低時，隨著提取溫度的增加，血糯米花青素提取含量呈先增加后平緩，當乙醇濃度較高時，隨著提取溫度的增加，血糯米花青素提取含量先增加后降低，從圖b 可以看出，提取含量隨提取溫度在等高線方向跨度大于乙醇濃度，說明提取溫度對提取含量的影響大于乙醇濃度，且當乙醇濃度在45%～55%，提取溫度在65～75 ℃范圍內，提取含量達到最大值。

圖6 （a）乙醇濃度和提取溫度交互項響應面及（b）等高線圖

提取溫度和料液比對提取含量交互影響如圖7所示，由圖a可知，血糯米花青素提取含量隨著提取溫度的增加先增加后降低，隨著料液比的增加，血糯米花青素提取含量先增加后降，由此說明二者之間存在顯著的交互作用，從圖b能夠看出，提取含量隨提取溫度在等高線方向跨度大于料液比，說明提取溫度對提取含量的影響大于料液比，且當料液比在1 g∶22 mL～1 g∶28 mL，提取溫度65～75 ℃范圍內，提取含量達到最大值。

圖7 （a）料液比和提取溫度交互項響應面圖面及（b）等高線

3.2.4 驗證性試驗

根據軟件得出最佳工藝條件為：乙醇濃度為51%，料液比1 g∶25 mL、提取溫度為67 ℃。為了檢驗實驗方法與結果的有效性，對血糯米花青素的取進行驗證試驗，通過進行3次重復試驗，確定血糯米花青素的最優結果，測得血糯米花青素含量的實際平均值為0.216 mg/g，與預測值提取含量為0.224 mg/g 相差在5%范圍內，進一步驗證了此回歸模型具有良好的適用性，表明優化結果具有合理性。

3.3 血糯米花青素體外抗氧化性實驗結果

由圖8、圖9 可知，在一定質量濃度范圍內，隨著濃度的增加血糯米花青素和VC 對OH、ABTS+清除率增加,但血糯米花青素對OH、ABTS+清除能力均低于VC，當VC 質量濃度為2 g/L 時，對OH、ABTS+清除率均超過90%，相同濃度下血糯米花青素對OH、ABTS+清除能力分別為68.9%、71.84%，即對ABTS+清除力較強。這主要因為花青素對不同自由基清除機理不同以及受花青素純度影響[20]。

圖8 清除羥自由基實驗結果

4 結論

血糯米花青素和VC 對羥自由基、ABTS 及DPPH的自由基清除率見圖8、圖9。

通過用單因素實驗與響應面分析法，以血糯米作為原材料，花青素含量為評價指標優化血糯米花青素提取的工藝。同時，以乙醇為提取溶劑，可以去除一些水溶性雜質，具有價格便宜、毒性小、提取液黏度小、易過濾、濃縮方便等優點。最后得到血糯米花青素的最優提取工藝條件為乙醇體積分數51%、料液比1 g∶25 mL、提取溫度67 ℃、提取時間45 min。用提取得到的血糯米花青素進行體外抗氧化性實驗，發現其具有一定抗氧化活性。