銀耳二型態編碼MAPK關鍵差異基因的克隆及生物信息學分析

徐濤 孔旭強 占觀平 陳雅芳 曹繼璇 李亞星 孫淑靜

銀耳二型態編碼MAPK關鍵差異基因的克隆及生物信息學分析

徐濤 孔旭強 占觀平 陳雅芳 曹繼璇 李亞星 孫淑靜*

（福建農林大學生命科學學院，福建 福州 350002）

銀耳是我國特色的食用菌品種，其二型態轉換與實際生產密切相關并制約著育種工作的進展，而絲裂原活化蛋白激酶（Mitogen activated protein kinase，MAPK）途徑在真菌二型態轉換中具有重要調控作用。根據轉錄組測序數據克隆了銀耳二型態編碼MAPK的關鍵差異基因，包括基因、基因和基因分析表明，、、基因的基因組DNA序列全長分別為1 721 bp、1 865 bp、1 903 bp，ORF序列全長分別為1 191 bp、1 281 bp、1 149 bp，分別含有10、12、16個內含子，編碼396、426、382個氨基酸，相對分子質量在43.61 kDa～48.15 kDa間，理論等電點在5.82～6.89。序列同源性分析表明，、、基因所編碼的氨基酸序列分別與中同源蛋白的相似性最高。結構域分析表明，TfFus3、TfSlt2、Kss1蛋白都具有典型的蛋白激酶保守結構域且同屬于PKc_like super family。本研究結果為進一步探究MAPK信號通路在銀耳二型態轉換中的作用奠定了基礎。

銀耳；絲裂原活化蛋白激酶；二型態；生物信息學

銀耳（Berk）隸屬于真菌門、擔子菌綱、銀耳目、銀耳科、銀耳屬，為我國久負盛名的食藥用菌[1]，素有“菌中之冠”的美稱。銀耳是典型的二型態真菌，具有酵母型和菌絲型2種生長階段。其酵母型包括由擔孢子芽殖生成的單核酵母狀孢子和由雙核菌絲或子實體在游離水過多、高溫、機械刺激等不良條件下形成的雙核酵母狀孢子[2]。而其菌絲型則包括單核菌絲、雙核菌絲和假菌絲3種類型[3]。具有不同極性的銀耳擔孢子可在和雙因子控制的四極性交配型系統的控制下形成具鎖狀聯合的雙核菌絲[4]，雙核酵母狀孢子也可在適宜條件下萌發形成雙核菌絲和假菌絲。銀耳酵母狀孢子直接與香灰菌配對時萌發率低、很難形成白毛團，更無法獲得子實體，而用銀耳菌絲體與香灰菌配對時則可大大提高銀耳的成品率，因此探究銀耳酵母狀孢子向菌絲轉變的調控機制對今后銀耳的育種工作及生產至關重要。

真菌二型態轉變受外界環境因子和內部信號轉導途徑的影響，其中絲裂原活化蛋白激酶（Mitogen activated protein kinase，MAPK）信號通路在真核細胞中較為保守，與真菌二型態的轉變密切相關[5]。1994年Liu等[6]最先發現MAPK途徑在釀酒酵母（）形態轉化中有重要作用，后又發現該途徑與白念珠菌（）的二型態也有關。在模式真菌釀酒酵母中，MAPK信號通路主要包括由Fus3介導的信息素反應（pheromone response），Kss1介導的絲化和侵襲性生長（filamentation and invasive growth），Slt2介導的細胞壁完整性（cell wall integrity），Hog1介導的高滲透壓應激反應（high-osmolarity stress response）[7]。、作為2個同源基因主要調控釀酒酵母有性生殖和菌絲生長過程[8]。新生隱球菌（）的二型態轉變一直被認為是一個依賴信息素的過程，其交配反應通過信息素受體級聯反應介導，其中與釀酒酵母、分別具有52%和51%的相似性[9]。白念珠菌中與菌絲生長有關的MAPK通路為Cek1和Cek2信號轉導通路，Cek1與Kss1同屬一個家族，Cek2與Fus3有55%的相似性，其可恢復釀酒酵母Fus3/Kss1缺失菌株的交配缺陷[10]。此外，有研究發現白念珠菌中（同源基因）雙敲除菌株無法在Spider培養基上形成侵襲性菌絲，而在釀酒酵母中過表達基因則可促進在氮饑餓條件下假菌絲的形成[11]。/同源基因在許多植物病原體中也同樣起重要作用，禾谷鐮刀菌（）中同源基因的缺失會導致氣生菌絲生長減少，減弱了對植株的侵染能力，并且它對于有性生殖過程中的雌性生殖能力是必不可少的[12]。玉米小斑病菌（）中的和釀酒酵母（）的氨基酸序列有59%的相似性。缺失突變體的氣生菌絲發育不良，無附著孢，侵染能力嚴重降低，不產分生孢子，菌絲內部有自溶現象[13]。

銀耳作為典型的二型態真菌可在酵母態與菌絲態之間相互轉變，且一旦形成酵母狀芽孢便很難形成菌絲。目前有關銀耳二型態的研究多集中于外界環境條件上，對二者轉變過程中的關鍵基因及其調節網絡知之甚少。本課題組前期研究發現，銀耳在二型態轉變過程中MAPK信號通路中有多個基因出現了差異性表達，本研究根據銀耳酵母狀芽孢與菌絲體的轉錄組數據設計引物，對銀耳二型態編碼MAPK的關鍵差異基因、、進行克隆及生物信息學分析，為研究該通路在銀耳二型態轉變中的作用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

（1）供試菌株。銀耳“繡銀1號”，編號TWW01-AX，由福建農林大學生命科學學院特色食用菌品種創新與代謝工程團隊選育并保存。

（2）供試培養基。PDA加富液體培養基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，蛋白胨3 g，酵母粉3 g，MgSO4·7H2O 1.5 g，KH2PO41.5 g，水1 L。

（3）試劑。Ezup柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒、DEPC水、氨芐青霉素均購自生工生物工程（上海）股份有限公司；?DNA Polymerase、2K DNA Marker、Trans1-T1感受態細胞均購自北京全式金生物技術有限公司；TRIzol（Invitrogen）；Prime Script?RT regent Kit With gDNA Eraser反轉錄試劑盒（TaKaRa）； Hieff Clone? Zero TOPO-Blunt Simple Cloning Kit（上海翊圣生物科技有限公司）；D2500 Gel Extraction Kit（OMEGA），其余試劑均為國產分析純。

1.2 方法

（1）銀耳基因組DNA的提取。將銀耳酵母狀芽孢接種于PDA加富液體培養基中，25 ℃、150 r/min培養7 d，12 000 r/min離心10 min收集菌體，根據Ezup 柱式真菌基因組 DNA 抽提試劑盒說明書提取基因組DNA。

（2）銀耳總RNA的提取及cDNA合成。用Trizol法提取銀耳酵母狀芽孢總RNA并根據PrimeScript?RT regent Kit With gDNA Eraser反轉錄試劑盒說明書合成ORF模板。

（3）銀耳二型態差異基因的克隆及測序。根據銀耳酵母狀芽孢與菌絲體轉錄組數據庫中各基因在NR及KEGG數據庫的注釋結果，運用NCBI的ORFfinder功能搜尋MAPK信號通路中富集到的含有完整開放閱讀框的各差異基因序列，用Primer Premier 6軟件設計引物（表1）。分別以銀耳基因組DNA及總ORF為模板，根據DNA Polymerase說明書設置各基因的PCR反應體系及程序（表2），并擴增各基因序列。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳后，用D2500 Gel Extraction Kit試劑盒對目的片段進行回收純化，連接至pESI-Blunt simple vector中并轉入Trans1-T1感受態細胞，挑選陽性菌落，送生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序。

表1 引物序列

表2 Hieff Canace? High-Fidelity DNA Polymerase PCR反應體系

注：基因組DNA 50 ng～200 ng，質粒DNA 10 pg～20 ng，cDNA 1～5 μL；PCR反應程序為98 ℃預變性3 min，98 ℃變性10 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸（速度為30 s/kb），35個循環，72 ℃繼續延伸5 min，4 ℃保存。

（4）差異基因的生物信息學分析。將克隆得到的各基因序列，通過在線網站（http://gsds.cbi. pku.edu.cn/index.php）繪制基因的結構圖；采用ProtParam（http://www.expasy.org/）分析蛋白質的分子量大小、等電點等理化性質；利用Expasy在線服務器上的SOPMA（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/ npsa_automat.pl?page=/NPSA/ npsa_sopma.html）分析蛋白質的二級結構；利用在線網站（https:// swissmodel.expasy.org/interactive）預測蛋白質的三級結構；蛋白質信號肽預測與分析采用SignalP（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）；蛋白質跨膜結構分析采用TMHMM程序（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）；根據各基因的Blastp結果下載不同物種的同源蛋白序列，同時在NCBI搜索下載該基因酵母的蛋白序列。用ClustalX軟件將上述蛋白質序列進行同源比對，參數為默認值，以同源比對數據為基礎，采用MEGA7軟件中的近鄰法，Bootstrap值設置為1 000，其余參數為默認值，構建系統進化樹。

2 結果與分析

2.1 TfFus3、TfSlt2、Kss1基因組DNA及ORF的擴增

分別以銀耳酵母狀芽孢基因組DNA及cDNA為模板，以引物-F、-R克隆銀耳基因、以引物-F、-R克隆銀耳基因、以引物-F、-R克隆銀耳基因。cDNA擴增產物電泳結果（圖1），擴增得到的基因組DNA序列全長1 721 bp，開放閱讀框（ORF）序列全長1 191 bp；基因組DNA序列全長1 865 bp，ORF序列全長1 281 bp；基因組DNA序列全長1 903 bp，ORF序列全長1 149 bp。

2.2 TfFus3、TfSlt2、Kss1基因結構及蛋白質理化性質

基因測序結果（圖2）顯示，3個基因的基因組序列全長分別為1 721 bp、1 865 bp、1 903 bp，ORF全長分別為1 191 bp、1 281 bp、1 149 bp，分別含有10、12、16個內含子。其中，基因共編碼396個氨基酸，分子式為C2030H3156N542O591S16，相對分子質量45.12 kDa，其中帶負電荷的殘基（Asp + Glu）49個，帶正電荷的殘基（Arg + Lys）48個，理論等電點為（pI）6.89，不穩定性系數45.09（＞40）為不穩定蛋白，脂肪指數78.46，總平均親水系數（GRAVY）? 0.352＜0，推測該蛋白為親水性蛋白，無信號肽及跨膜結構域。Blast結果顯示，該基因編碼的氨基酸序列與隱球菌屬MAPK蛋白激酶相似性最高，為86.41%?；蚬簿幋a426個氨基酸，分子式為C2155H3331N595O623S19，相對分子質量48.15 kDa，其中帶負電荷的殘基（Asp + Glu）52個，帶正電荷的殘基（Arg + Lys）44個，理論等電點（pI）為6.06，不穩定性系數37.31（＜40）為穩定蛋白，脂肪指數82.89，總平均親水系數（GRAVY）? 0.344＜0，推測該蛋白為親水性蛋白，無跨膜結構域及信號肽?；蚬簿幋a382個氨基酸，分子式為C1953H3035N529O571S17，相對分子質量43.61 kDa，其中帶負電荷的氨基酸殘基（Asp + Glu）52個，帶正電荷的氨基酸殘基（Arg + Lys）43個，理論等電點為（pI）5.82，不穩定性系數38.03（＜40），為穩定蛋白，脂肪指數為84.79，總平均親水系數（GRAVY）? 0.358＜0，推測該蛋白為親水性蛋白。無信號肽，無跨膜螺旋區。Blast結果顯示，該基因編碼的氨基酸序列與黃金銀耳絲裂原活化蛋白激酶相似性最高，一致性為82.4%。

圖1 TfFus3、TfSlt2、Kss1基因ORF序列擴增結果

圖2 TfFus3、TfSlt2、Kss1基因結構

2.3 TfFus3、TfSlt2、Kss1蛋白質結構預測

TfFus3蛋白質二級結構預測結果如圖3a所示，該蛋白質主要由41.41%α-螺旋、13.13%延伸鏈、4.55%β-轉角和40.91%無規則卷曲構成，分別由164個、52個、18個和162個氨基酸參與形成。TfFus3蛋白質三級結構預測結果如圖3 b所示，該蛋白與模板2b9h.1.A一致性達54.89%，GMQE為0.73（可信度較好），QMEAN為? 2.04（與模板的匹配度較好），該模板蛋白為絲裂源活化蛋白激酶Fus3。

TfSlt2蛋白質二級結構預測結果如圖4 a所示，其主要由43.9%α-螺旋、11.74%延伸鏈、5.87%β-轉角和38.5%無規則卷曲構成，分別由187個、50個、25個和164個氨基酸參與形成。TfSlt2蛋白質三級結構預測結果如圖4 b所示，該蛋白與模板5z33.1.A一致性達65.36%，GMQE為0.75（可信度較好），QMEAN為? 1.41（與模板的匹配度較好），該模板蛋白為絲裂源活化蛋白激酶Slt2。

Kss1蛋白質二級結構預測結果如圖5 a所示，該蛋白質主要由46.34%α-螺旋、14.14%延伸鏈、4.97%β-轉角和34.55%無規則卷曲構成，分別由177個、54個、19個、132個氨基酸參與形成。Kss1蛋白質三級結構預測結果如圖5 b所示，該蛋白與模板2b9h.1.A一致性達54.49%，GMQE為0.71（可信度較好），QMEAN為? 2.41（與模板的匹配度較好），該模板為絲裂原活化蛋白激酶Kss1。

2.4 TfFus3、TfSlt2、Kss1蛋白保守結構域預測

TfFus3TfSlt2Kss1蛋白保守結構域預測結果如圖6、7、8所示。TfFus3蛋白在第44～390位氨基酸間含有一個胞外信號調節激酶1和2樣絲氨酸/蘇氨酸激酶的催化結構域（STKc_ERK1_2_ like結構域），屬于PKc蛋白超家族。該結構域主要是將ATP上的γ-磷?；D移到蛋白質底物上的絲氨酸/蘇氨酸殘基上，該亞家族由絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）ERK1、ERK2、釀酒酵母Fus3和類似蛋白質組成。TfSlt2蛋白在第21～358位氨基酸間含有一個真菌絲裂原活化蛋白激酶MPK1結構域（STKc_MPK1），屬于PKc_like超家族。同樣催化將γ-磷?；鶑腁TP轉移到蛋白質底物上的絲氨酸/蘇氨酸殘基上，該亞家族由釀酒酵母的MPK1、粟酒裂殖酵母（）的Pmk1和相似的蛋白質組成。Kss1蛋白在第32～375位氨基酸間含有一個細胞外信號調節激酶1和2類絲氨酸/蘇氨酸激酶的催化結構域（STKc_ERK1_2_like），屬于PKc_like超家族。STK催化γ-磷?；鶑腁TP轉移到蛋白質底物上的絲氨酸/蘇氨酸殘基，這個亞家族由絲裂原活化蛋白激酶（MAPKs）ERK1、ERK2、釀酒酵母Fus3和類似的蛋白質組成。

圖6 TfFus3蛋白保守結構域預測結果

圖7 TfSlt2蛋白保守結構域預測結果

圖8 Kss1蛋白保守結構域預測結果

2.5 TfFus3、TfSlt2、Kss1蛋白系統進化分析

（1）TfFus3蛋白系統進化分析。用ClustalX2及MEGA7軟件將TfFus3蛋白與釀酒酵母中已知的相關蛋白進行同源性比對，結果顯示該蛋白與酵母中的Fus3蛋白聚為一支（圖9）。

圖9 TfFus3蛋白與釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中相關蛋白序列同源比對結果

TfFus3蛋白系統進化分析如圖10所示，銀耳TfFus3蛋白與、、隱球酵母菌屬的新型隱球酵母（）、蓋替隱球酵母（）、親緣關系較近。而與角狀膠角耳（）、草菇（、毛韌革菌（）、斑玉蕈（）、灰樹花（）等擔子菌親緣關系次之，與白地霉（）、黑曲霉（）釀酒酵母（）等子囊菌親緣性較遠。

（2）TfSlt2蛋白系統進化分析。用ClustalX2及MEGA7軟件對TfSlt2蛋白與釀酒酵母中已知的相關蛋白進行同源性比對，結果顯示該蛋白與酵母中的Slt2蛋白聚為一支（圖11）。

TfSlt2蛋白系統進化分析如圖12所示，銀耳TfSlt2蛋白序列與親緣關系最近，并與、新型隱球酵母（）、蓋替隱球酵母（）聚為一類。而與立枯絲核菌（）、膠角耳（）、、陶蘭柱擔菌（）、絨毛栓菌（）、玉米黑粉菌（）等擔子菌親緣關系次之，與黑酵母菌（）釀酒酵母()、核盤菌（）等子囊菌親緣性較遠。

圖10 TfFus3蛋白系統進化樹

圖11 TfSlt2蛋白與釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中相關蛋白序列同源比對結果

圖12 TfSlt2蛋白系統進化樹

（3）Kss1蛋白系統進化分析。用ClustalX2及MEGA7軟件將銀耳Kss1蛋白與釀酒酵母中已知的相關蛋白質進行同源性比對，結果顯示該蛋白與釀酒酵母中的Kss1蛋白聚為一個分支（圖13）。

Kss1蛋白系統進化如圖14所示，銀耳Kss1蛋白與親緣關系最近，與、、、、、、的親緣關系次之，與釀酒酵母（）、光滑念珠菌（）親緣關系較遠。

3 討論

在真核生物中，異三聚體G蛋白可介導Ca2+、cAMP 和 MAPK 3條信號轉導途徑將胞外環境信號傳遞到細胞內[14]。在MAPK信號通路中主要通過交配信息素途徑介導兩單倍體的交配反應[15]。當交配信息素與相應的受體結合后激活Gα亞基使GDP轉變為GTP，此時Gαβγ三聚體解離為Gα和Gβγ復合體，他們分別通過cAMP、MAPK信號轉導途徑將信號傳遞至下游的效應分子調節相應的細胞活動[16]。G蛋白繼續通過支架蛋白將信號傳遞至MAPK信號通路中，再經MAPKKK-MAPKK-MAPK三級磷酸化過程最終將信號傳遞至TfFus3從而使釀酒酵母的單倍體細胞發生交配反應，除此之外該通路還與菌絲生長、孢子生成、致病性有關[17]。

圖13 Kss1蛋白與釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中相關蛋白序列同源比對結果

圖14 Kss1蛋白系統進化樹

銀耳酵母狀芽孢在非適宜條件下，往往通過芽殖、裂殖的方式進行無性增殖，當其向菌絲態轉變時與白念珠菌侵染宿主的過程類似，即首先會在一端形成芽管，芽管不斷伸長后成為菌絲，在這一過程中細胞以單一或特定的方向進行生長延伸，稱為細胞的極性生長[18]。酵母中極性生長主要發生在三個時期：酵母細胞極性位點的選擇、酵母細胞向菌絲的轉變過程、兩單倍體細胞的接合生長[19]。菌絲頂端這種高度極性生長的方式依賴于內質網的功能及細胞壁的有序合成及重塑[20]。研究發現，白念珠菌中同源基因敲除后與野生型相比其在42 ℃條件下培養時生長速率降低，且對熱敏感。在高Ca2+濃度、高滲透壓條件下突變體菌落變得光滑，菌絲生長受到抑制[21]。同時Slt2對球孢白僵菌、的毒力、侵襲性生長至關重要[22-23]。

在釀酒酵母中，有5條分別調控高滲環境生長的逆境反應、交配反應、菌絲生長、細胞壁完整性和孢子形成的MAPK途徑已被鑒定研究[24-26]。MAPKK是MAPK三級級聯信號途徑的中間蛋白，其高度保守的SxxxS/T位點受上一級雙特異性MAPKKK的雙重磷酸化誘導激活，其中Fus3和Kss1受同一個MAPKK蛋白的激活，共同調控交配反應和菌絲生長[23]。所以克隆基因有助于研究銀耳二型態轉變的關鍵基因。分析結果顯示，銀耳基因與釀酒酵母中的基因具有高度同源性，銀耳Kss1蛋白與親緣關系最近，本研究結合銀耳不同形態下的基因表達差異分析，發現基因在菌絲形態中相較酵母形態上調表達。推測基因可能在銀耳菌絲形成過程中起正調控作用。

4 結論

將獲得的銀耳酵母狀芽孢及菌絲體的轉錄組數據，通過NR注釋、KEGG富集后查找含有完整開放閱讀框的差異基因序列?？寺〔⒎治隽司幋a絲裂原活化蛋白激酶的基因、和。

序列分析發現，基因組序列全長1 721 bp，ORF全長1 191 bp，含有10個內含子，共編碼396個氨基酸，含有絲氨酸/蘇氨酸激酶催化結構域（STKc_ERK1_2_like結構域），與、、新型隱球酵母、蓋替隱球酵母的絲裂原活化蛋白激酶編碼基因親緣關系最近?；蚪M序列全長1 865 bp，ORF全長1 281 bp，含有12個內含子，共編碼426個氨基酸，含有絲裂原活化蛋白激酶MPK1結構域（STKc_MPK1），與親緣關系最近，并與、新型隱球酵母、蓋替隱球酵母聚為一類?；蚧蚪M序列全長1 903 bp，ORF全長1 149 bp，包含16個內含子，共編碼382個氨基酸，含有絲氨酸/蘇氨酸激酶的催化結構域（STKc_ERK1_2_like），與親緣關系最近。

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Cloning and bioinformatics analysis of key differential-expression genes encoding MAPK indiformis

XU Tao KONG Xuqiang ZHAN Guanping CHEN Yafang CAO Jixuan LI Yaxing SUN Shujing*

（College of Life Sciences, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002, China）

is a characteristic edible fungus in China. The diformis transformation is closely related to the actual production and restricts the progress of breeding. Mitogen activated protein kinase (MAPK) pathway plays an important role in the regulation of diformis transformation. Based on transcriptome sequencing data, key differential-expression genes encoding MAPK indiformis were cloned, includinggene,gene andgene. Analysis showed that the total length of genomic DNA sequence of,andgenes was 1 721 bp, 1 865 bp and 1 903 bp, and the total length of ORF sequence was 1 191 bp, 1 281 bp and 1 149 bp, containing 10, 12 and 16 introns, respectively. Coding 396, 426, 382 amino acids, the molecular weight ranging from 43.61 kDa to 48.15 kDa, the theoretical isoelectric point between 5.82 and 6.89. Sequence homology analysis showed that the amino acid sequences encoded by,andwere the most similar to homologous proteins in,and, respectively. Domain analysis showed that TfFus3, TfSlt2 and Kss1 all had typical conserved kinase domains and belonged to PKc_like super family. The results of this study laid a foundation for further exploring the role of MAPK signaling pathway in tremella dimorphism transformation.

; Mitogen activated protein kinase; dimorphic; bioinformatics

S646

A

2095-0934（2024）01-031-09

國家自然科學基金青年科學基金項目（31801556）；福建省種業工程特色食用菌育種與產業化開發（zycxny2021011）；福建省食用菌現代農業產業體系

徐濤（2003—），男，在讀本科生，研究方向為食藥用真菌學。E-mail：2071463989@qq.com。

孫淑靜（1978—），女，博士，教授，主要從事食藥用真菌學研究。E-mail：shjsun2004@126.com。