沙棘中黃酮類化合物提取及抗氧化活性

吳翠芳, 劉雅宣, 李宇輝, 郝奇奇, 何旭豪, 王俊鋼*

(1.亳州學院 生物與食品工程系,安徽 亳州 236800;2.亳州市天然產物分離純化工程技術研究中心,安徽 亳州 236800;3.新疆農墾科學院 農產品加工研究所,新疆 石河子 832000)

沙棘(HippophaerhamnoidesL.),也稱為沙棗、吉漢、酸柳、達普,是胡頹子科沙棘屬的一種重要的落葉樹種,具有很好的防風固沙作用。目前,沙棘果的營養保健及醫療作用被廣泛關注[1]。中國沙棘資源占全世界上95%以上,素有“沙棘王國”之稱[2]。沙棘果是一種藥食同源食品,具有極高的營養和藥用價值,在治療咳嗽、改善胃腸功能、抗炎、抗病毒、提高免疫力、激發細胞新陳代謝等方面作用顯著[3]。沙棘富含黃酮、類胡蘿卜素、甾醇激素、生育酚等[4],其中黃酮類化合物是其最重要的活性成分。研究表明,黃酮類化合物可以保護腸道上皮屏障[5-7]、參與免疫調節[8-10]、調節腸道菌群結構[11-12]、維持細胞的健康和保護內皮功能[13]等重要的生理活性。陳薇伊等[14]研究發現,山楂黃酮能顯著提升糖尿病小鼠血清和肝臟中SOD、T-AOC、GSH-PX酶活性;李雪涵等[15]研究發現榆莢仁黃酮可顯著增強慢性睡眠剝奪小鼠大腦、肝臟、十二指腸中SOD、GPX活性和T-AOC。隨著科技的進步和人們對健康的重視程度不斷增加,越來越多對人體健康有益的功能性物質被挖掘,并驗證其功效[16]。張峰等[17]通過構建氧化應激條件下花青素對小鼠脂代謝及抗氧化性能的模型,發現花青素可以顯著提高小鼠肝臟的抗氧化能力和細胞的免疫機能,從而保護肝臟功能。吳冕等[18]將滁菊總黃酮和滁菊多糖進行配伍,發現合理的配比可以顯著增強其體內外抗氧化活性?？傊?黃酮類化合物的抗氧化活性和增強動物體內抗氧化物質的表達等作用使得其研究被逐漸重視,而沙棘鮮果中含有1 500～3 000 mg/kg總黃酮,其更具研究價值。

植物中黃酮類化合物的提取通常選用乙醇法,借助超聲波[19]、表面活性劑[20]等處理手段可增加黃酮得率。為優化沙棘中黃酮的提取方法,提高沙棘黃酮得率,本試驗借助超聲輔助提取技術,在單因素試驗基礎上,通過響應面方法確定沙棘中黃酮的最佳提取工藝,并對得到的沙棘黃酮類化合物的體外抗氧化活性進行研究,可為沙棘黃酮的抗氧化性質和抗氧化能力提供基礎數據,為下一步開發功能性食品、保健食品等提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗原料與試劑

沙棘全果凍干粉(新疆紅螞蟻農業科技有限公司);蘆丁(上海源葉生物科技有限公司);無水乙醇(AR,海博生物技術有限公司);亞硝酸鈉,硝酸銀,氫氧化鈉(AR,國藥集團化學試劑科技有限公司);亞硫酸鐵,水楊酸(AR,天津市興復精細化工研究院);DPPH(AR,上海源葉生物科技有限公司);抗壞血酸(AR,鄭州市化學試劑三廠)。

1.2 儀器與設備

KQ-200VD超聲波清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司);HH-4B恒溫水浴鍋(國華(常州)儀器制造有限公司);SY204C電子天平(上海佑科儀器儀表有限公司);FCD-2000恒溫鼓風干燥箱(上?，樮帉嶒炘O備有限公司);UV-6000T紫外分光光度計(上海元析儀器有限公司)。

1.3 試驗方法

1.3.1 標準曲線繪制及回歸方程建立 采用亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉法,將20 mg蘆丁標準品溶解于少量的60%乙醇中,加60%乙醇定容至100 mL,得到0.2 mg/mL蘆丁標準溶液。參照林繼輝等[21]方法,分別吸取0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL 0.2 mg/mL蘆丁標準溶液,分別加入6 mL 30%乙醇溶液、1 mL 5%亞硝酸鈉溶液,混勻后放置6 min,加入1 mL 30%硝酸銀溶液,混勻靜置6 min,加入10 mL 10%氫氧化鈉溶液,加入30%乙醇溶液至25 mL,混勻后靜置15 min,在510 nm處測定吸光度。得出回歸方程y=9.890 6x+0.013 7,R2=0.998 1,表明蘆丁標準品的含量與吸光度有良好的線性關系(圖1)。

圖1 標準曲線與回歸方程Fig.1 Standard curve and regression equation

1.3.2 單因素試驗 準確稱取2.00 g沙棘粉末,固定其他提取因素分別考察提取時間(20、30、40、50、60 min)、提取溫度(40、50、60、70、80 ℃)、乙醇體積分數(40%、50%、60%、70%、80%)、料液比(1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35 g/mL)對黃酮得率的影響。

1.3.3 響應面優化設計試驗 利用Design-Expert 8.0.6 設計響應面優化試驗方法,提取時間(A)、提取溫度(B)、乙醇體積分數(V乙醇/V總)(C)、料液比(D)等4個影響因素為自變量,黃酮得率為因變量,設計四因素三水平的響應面試驗(表1)。

表1 響應面試驗因素水平表Table 1 Response to flour test factor level table

1.3.4 黃酮得率的測定 通過準確吸取已經處理好的沙棘黃酮溶液,在510 nm處測定吸光度A,獲得沙棘黃酮質量濃度,計算沙棘黃酮得率。

1.3.5 DPPH自由基清除率的測定 參考田建華等[22]方法。準確稱將沙棘黃酮粗提取物和Vc對照品各0.5 g,用75%乙醇定容至100 mL,配制成5 mg/mL沙棘黃酮粗提取物溶液和Vc對照品溶液。然后分別用75%乙醇溶液將其稀釋配制成1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mg/mL樣品溶液。稱取0.79 g DPPH粉末加蒸餾水定容至1 000 mL配制成2 mmol/L的DPPH溶液。分別吸取2.0 mL上述不同質量濃度的沙棘黃酮粗提取物樣液,加入2 mL 2 mmol/L DPPH溶液,將溶液在常溫下遮光30 min后,于517 nm下測得吸光度A1;分別吸取2.0 mL上述不同濃度的沙棘黃酮粗提取物樣液,加入2.0 mL 75%乙醇于相同波長下分別測定其吸光度A2;吸取2.0 mL 2 mmol/L的DPPH溶液加2.0 mL 75%乙醇在517 nm下測定吸光度A0,使用相同的方法測定Vc進行陽性對照試驗。DPPH自由基清除率計算公式如式(1)所示:

(1)

其中,A1為2.0 mL樣品溶液+2.0 mL 2 mmol/L的DPPH溶液吸光度;A2為2.0 mL樣品溶液+2.0 mL 75%乙醇溶液吸光度;A0為2.0 mL 2 mmol/L的DPPH溶液+2.0 mL 75%乙醇溶液吸光度。

1.3.6 羥自由基清除率的測定 參考田建華等[22]方法,略有改進。準確稱將沙棘黃酮粗提取物和Vc對照品各0.5 g,用75%乙醇定容至100 mL,配制成5 mg/mL沙棘黃酮粗提取物溶液和Vc對照品溶液。然后分別用75%乙醇將其稀釋成1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mg/mL樣品溶液。準確稱取1.391 0 g硫酸亞鐵加蒸餾水配制成5 mmol/L硫酸亞鐵溶液。準確稱取0.690 0 g水楊酸加無水乙醇配制成5 mmol/L水楊酸的乙醇溶液、再配制0.1%過氧化氫溶液。分別吸取上述不同質量濃度的沙棘黃酮粗提取物樣液2.0 mL,加入5 mmol/L硫酸亞鐵溶液、5 mmol/L水楊酸乙醇溶液、0.1%過氧化氫溶液各2 mL,混勻后于530 nm處測定其吸光度A1;分別吸取2.0 mL上述不同濃度的沙棘黃酮粗提取物樣液,加入蒸餾水、0.1%過氧化氫溶液、5 mmol/L水楊酸乙醇溶液各2.0 mL,混勻后于530 nm處測定其吸光度A2;吸取蒸餾水、5 mmol/L硫酸亞鐵溶液、0.1%過氧化氫溶液、5 mmol/L水楊酸乙醇溶液各2.0 mL,混合均勻后,于530 nm處分別測定其吸光度A0,然后使用相同的方法測定Vc進行陽性對照試驗,根據式(2)計算沙棘黃酮粗提取物和Vc的羥自由基清除率:

(2)

其中,A1為2.0 mL樣品溶液+2.0 mL硫酸亞鐵溶液+2.0 mL過氧化氫溶液+2.0 mL水楊酸乙醇溶液吸光度;A2為2.0 mL樣品溶液+2.0 mL蒸餾水+2.0 mL過氧化氫溶液+2.0 mL水楊酸乙醇溶液吸光度;A0為2.0 mL蒸餾水+2.0 mL硫酸亞鐵溶液+2.0 mL過氧化氫溶液+2.0 mL水楊酸乙醇溶液吸光度。

1.4 數據統計與分析

采用SPSS 22.0 軟件進行單因素方差分析,所有試驗均測定3次,結果以“平均值±標準差”表示。P<0.05 表示差異顯著,P>0.05表示差異不顯著。采用Origin 8.0軟件作圖。

2 結果分析

2.1 單因素試驗結果

由圖2A結果可以看出,提取時間為10～20 min時,沙棘黃酮得率隨著提取時間延長呈遞增趨勢,當提取時間為20 min時沙棘黃酮提取效果最佳,黃酮得率顯著高于(P<0.05)其他水平,為1.44 mg/g。然而當提取時間超出20 min后,則黃酮得率逐漸下降(P<0.05),這可能是由于提取時間太久,黃酮類物質受到熱量的影響而分解、聚集等一系列化學反應會影響黃酮得率;另一方面,由于乙醇在提取過程容易揮發,導致黃酮得率降低[23]。因此選取20 min為本試驗的最佳提取時間。

圖2 不同提取條件對沙棘黃酮提取率的影響Fig.2 Effects of different extraction conditions on the extraction rate of sea buckthorn flavonoids注:不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下同。

從圖2B中可以看出,隨著提取溫度的升高,沙棘黃酮得率整體表現出了先升高后下降的趨勢。在提取溫度70 ℃時,得率達到了2.09 mg/g,顯著高于(P<0.05)其他溫度條件。一般來說,溫度越高,化學反應越快,提取效果越好,沙棘黃酮得率也就越高,但試驗結果卻顯示在70 ℃后隨溫度升高黃酮得率反而下降。其原因是提取液在適宜溫度條件下,液體分子運動的增加促使了黃酮分子溶出率增高,但是在過高溫度條件下,沙棘黃酮的結構也可能會被破壞,也更容易被氧化而生產其他物質[24],從而降低沙棘黃酮得率,故選取70 ℃為后續試驗的提取溫度。

如圖2C所示,沙棘黃酮的得率會因乙醇的比例而發生變化,黃酮得率隨乙醇體積分數的增大呈現出先增高后降低的趨勢,在乙醇體積分數為50%時,黃酮得率最高,為1.72 mg/g,顯著高于其他水平(P<0.05)。Munhoz等[25]研究表明,溶劑的極性對黃酮的提取萃取有一定的影響,黃酮類化合物在乙醇溶液中的溶解度比在水溶液中的溶解度高,就是因為水的極性高,而乙醇的極性低,將乙醇溶液和水溶液混合,降低溶劑極性可以提高黃酮類化合物等酚類化合物的提取率,所以乙醇溶液在溶劑中的濃度越高,極性就越低,提取效果就越好,沙棘黃酮得率越高。當乙醇體積分數大于50%時,黃酮得率顯著降低(P<0.05),這可能是沙棘果中其他醇溶性物質的溶出影響了沙棘黃酮類物質的溶出[26],從而導致沙棘黃酮得率降低,故選擇乙醇體積分數為50%條件進行后續試驗。

由圖2D可知,沙棘黃酮得率隨料液比比值的增大總體呈現出增加趨勢,料液比在1∶15～1∶25 g/mL時,沙棘黃酮得率增長最快,而1∶30～1∶35 g/mL時黃酮得率增長速度減緩。一般來說,溶劑量添加越多,沙棘黃酮得率也越高,但當料液比增加到一定的比值后,溶液中的黃酮類成分已經基本被溶出,故沙棘黃酮得率增加非常緩慢[27]。為了節約成本,減少黃酮類化合物干燥過程中的能耗,因此選擇料液比為1∶25 g/mL為最佳料液比。

2.2 沙棘黃酮提取工藝響應面結果

2.2.1 響應面試驗設計及結果 采用Design Expert 8.0.6 軟件,對沙棘黃酮的提取進行Box-Behnken 設計,響應面試驗及結果見表2。

表2 響應面試驗及結果Table 2 Experimental design and results for response surface analysis

表3 響應面結果方差分析Table 3 Analysis of variance for the fitted regression model

2.2.3 各因素之間交互效用分析 圖3為影響沙棘黃酮提取各因素之間的交互效應圖,從圖中可以直觀看出個響應面最大值所對應的因素水平,另外,還可以通過響應面投影的等高線判斷這兩個因素之間是否存在顯著的交互效應[28]。由圖3a可知,當乙醇質量分數和料液比一定時,隨著提取時間(A)和提取溫度(B)的增加,黃酮得率呈現先增加后減小的趨勢,從圖形中各因素邊緣曲線的陡峭程度可以看出,提取時間對沙棘中黃酮得率影響要高于提取溫度,且當提取時間和提取溫度之間有一定的拮抗作用,提取時間會限制提取溫度對沙棘黃酮得率的影響。從圖3c可以看出,提取時間和料液比(D)之間也有一定的拮抗作用,當提取時間較小且料液比過大時,沙棘黃酮得率會明顯增加。圖3f中,乙醇體積分數(C)和料液比之間也存在拮抗作用,隨著乙醇體積分數的過高的乙醇體積分數反而會影響沙棘黃酮得率,限制了料液比增加對沙棘黃酮得率的影響。

圖3 兩因素相互作用對沙棘黃酮提取率影響的響應面圖Fig.3 Response surface diagram of the effect of two factors on the extraction rate of seabuckthorn flavonoids

2.2.4 驗證試驗 結合響應面模型分析結果,利用軟件Design-Expert 8.0.6對所求極值與邊界值分析可得出沙棘總黃酮提取工藝的最佳參數為:提取時間23.16 min、提取溫度79.95 ℃、乙醇體積分數48.62%、料液比1∶20,在此工藝條件下,沙棘黃酮得率為2.329 mg/g?？紤]到提取沙棘黃酮工藝的可操作性,將提取參數修正為:提取時間為23 min、提取溫度為80 ℃、乙醇體積分數為50%、料液比為1∶20。以此工藝條件進行3次驗證試驗,得到沙棘黃酮提取率分別為:2.295 mg/g、2.315 mg/g、2.338 mg/g,與模型所得理論值平均誤差僅為0.5%,說明該數學模型能夠很好的模擬沙棘中黃酮類化合物的提取工藝。

2.3 沙棘黃酮抗氧化能力的測定

2.3.1 DPPH自由基的清除能力 人體機能通過代謝會產生大量自由基,自由基會對生命大分子如蛋白質、核酸等進行攻擊,從而影響身體健康[29]。如果體內的自由基過多,則可引起某些疾病,如腫瘤,心腦血管疾病等等,并且已有科學研究證明人體衰老和自由基引起的氧化損傷有關,其中DPPH自由基,是一個很穩定的自由基,在實驗室研究中常被用于抗氧化成分的體外抗氧化性測定[30]。由圖4可知,沙棘黃酮粗提取物與VC對照品對DPPH自由基的清除作用呈明顯的量效關系,并且呈現出相同的上升趨勢,沙棘黃酮粗提取物和VC的濃度越高,對DPPH自由基的清除效果越佳,當沙棘總黃酮粗提取物濃度達到5 mg/mL時,對羥自由基的清除率達到了87.5%,說明沙棘黃酮有較強的抗氧化能力。

圖4 沙棘黃酮對DPPH自由基清除能力的影響Fig.4 Effect of sea-buckthorn flavonoids on DPPH free radical scavenging ability

2.3.2 羥自由基的清除能力 羥自由基有著極強的毒性,是最活潑的自由基,羥自由基作用于人體內的核酸、蛋白質、脂類等生物大分子,易對其細胞組織結構和功能造成一定的損傷,造成各類疾病的發生以及機體衰老,影響人體的健康[31]。黃酮類物質抗氧化作用的實現主要是通過酚羥基與自由基反應,形成一種穩定共振的半醌式自由基來阻斷氧化鏈式反應[32]。由圖5可知,沙棘黃酮粗提取物和Vc濃度越高,對羥自由基的清除效果越佳,當沙棘總黃酮粗提取物質量濃度達到5 mg/mL時,對羥自由基的清除率達到了77.7%,說明本試驗中得到的沙棘黃酮具有較好的抗氧化作用。

圖5 沙棘黃酮對羥自由基清除能力的影響Fig.5 Effect of sea buckthorn flavonoids on hydroxyl radical scavenging ability

3 結論

采用沙棘粉末作為原料,乙醇溶液作為提取劑,并與超聲波輔助提取技術相結合的方法,分別就提取時間(A)、提取溫度(B)、乙醇體積分數(C)和料液比(D)等4個因素進行單因素試驗,確定最佳因素水平為提取時間20 min、提取溫度70 ℃、乙醇體積分數50%、料液比1∶25 g/mL。響應面試驗結果表明,影響沙棘黃酮得率的因素順序為D>C>A>B,即料液比>乙醇體積分數>提取時間>提取溫度,最優工藝參數為:提取時間為23 min、提取溫度為80 ℃、乙醇體積分數為50%、料液比為1∶20,在此條件下黃酮得率為2.316 mg/g。

沙棘黃酮粗提取物的抗氧化活性研究表明沙棘黃酮對DPPH自由基和羥自由基都具有較好的清除效果,當沙棘總黃酮粗提取物質量濃度達到5 mg/mL時,對DPPH自由基和羥自由基的清除率分別達到87.5%和77.7%。