N-(苯基)噻唑酰胺類衍生物的合成及殺菌活性

張 勇, 時錦超, 胡 勇, 廖 燦, 王美美, 朱 祥,3, 余林花*, 李俊凱*

(1.長江大學 農學院,湖北 荊州 434025; 2. 長江大學 農藥研究所,湖北 荊州 434025; 3. 貴州大學 綠色農藥與農業生物工程國家重點實驗室培育基地/教育部重點實驗室,貴州 貴陽 550025)

近年來,由于氣候變化加劇,作物真菌病害在我國的發生越來越嚴重。真菌病害因具有很強的暴發性和傳染性,易使農作物大面積減產,造成嚴重的經濟損失[1-6]。目前,使用化學殺菌劑對作物真菌病害進行防治,仍然是最為經濟、有效的手段。然而,由于傳統殺菌劑的長期使用,在保障糧食產量和品質的同時,化學農藥的殘留、抗性和再猖獗等問題也日益突出。因此,設計以天然產物結構為先導,進行結構修飾改造或將活性結構單元引入天然產物結構中,是開發高效、低毒新型殺菌劑最有效的方式之一。

噻唑(圖1, Thiazole)是同時含有氮、硫原子的五元芳香雜環,易與金屬離子配位,也可同其它有機分子形成氫鍵,因此具有生物活性廣泛的特點。Thiasporine A(圖1)作為一種含有噻唑雜環的天然產物,于2015年[7]首次由MACMILLAN課題組從海洋放線菌ActinomycetosporachloraSNC-032的代謝產物中分離得到。含噻唑結構的化合物具有抗菌、殺蟲和抗腫瘤等生物活性,在農用活性中已被開發為除草劑、殺蟲劑等,如目前已經上市的殺菌劑噻唑菌胺(圖1, Ethaboxam)與殺蟲劑噻蟲嗪(圖1, Thiamethoxam)。本課題在前期的研究中[8]通過對Thiasporine A的殺菌、除草和殺蟲等活性進行篩選發現,該類結構具有較好的殺真菌活性;由初步構效關系發現,無取代的苯基噻唑結構具有更好的殺菌活性,可作為殺菌先導結構進行優化。與此同時,酰胺結構(圖1, Amide)作為具有多種優良生物活性的結構片段,廣泛存在于農藥和醫藥中,尤其在農用殺菌劑領域中廣泛存在,如殺菌劑氟酰胺(圖1, Flutolanil)、呋吡菌胺(圖1, Furametpyr)和啶酰菌胺(圖1, Boscalid)。

圖1 含噻唑環/酰胺化學結構的天然產物和農藥Figure 1 Natural products and pesticides containing thiazole ring/amide chemical structure

基于以上結果,本研究以Thiasporine A中的殺菌活性結構苯基噻唑為先導,設計合成了一系列含酰胺結構的苯基噻唑類衍生物(圖2～3),并測定了化合物對6種植物病原真菌的離體殺菌活性,以期得到具有較高殺菌活性的化合物。通過探討N-(苯基)噻唑酰胺類衍生物的構效關系,旨在為今后苯基噻唑類衍生物的殺真菌活性研究提供理論依據。

圖2 目標化合物的設計思路Figure 2 Design idea of the target compounds

圖3 目標化合物(6a～6l)的合成路線Figure 3 Synthesis route of target compounds(6a～6l)

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

WRR型熔點儀(上海精密科學儀器有限公司); Q Exactive型高分辨質譜儀(德國,賽默飛公司); Bruker AV 400型核磁共振儀(內標為TMS,溶劑為CDCl3和DMSO-d6); Digital water bath SB-1000型旋轉蒸發儀(日本EYELA公司)。

所有化學藥品均為市售國產試劑,除特別注明外,未經進一步處理,直接使用。苯甲腈,上海麥克林生化科技有限公司; 3-溴丙酮酸乙酯,質量分數為80%,上海畢得醫藥科技股份有限公司; 不同取代苯胺,質量分數為99%,上海麥克林生化科技有限公司。薄層和柱層析用硅膠均為青島海洋化工廠產品。

1.2 供試真菌

水稻紋枯病菌Rhizoctoniasolani、白芨白絹病菌Sclerotiumrolfii、水稻稻瘟病菌Magnaportheoryzae、柑橘黑點病菌Phomacitricarpa、油菜菌核病菌Sclerotiniasclerotiorum和煙草赤星病菌Alternariaalternata均由長江大學農學院植物病理實驗室提供。

1.3 化合物的合成

(1) 化合物2的合成

參照文獻[7]方法,將MgCl2·6H2O(21.7 g, 110.0 mmol)和苯甲腈(10.0 g, 100.0 mmol)分別加入250 mL的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液中。室溫攪拌15 min后,將NaHS·H2O(12.0 g, 210.0 mmol)加入反應液,持續室溫攪拌16 h。監測反應完成后,反應液用水(70 mL)和飽和食鹽水(10 mL)稀釋,并用乙酸乙酯(4×50 mL)萃取。合并的有機相用飽和食鹽水(3×50 mL)洗滌并用無水硫酸鈉干燥,得到粗產物化合物2。

(2) 化合物3的合成

參照文獻[9]方法,將硫代苯甲酰胺(15.0 g, 110.0 mmol), 250 mL無水乙醇加入到1000 mL圓底燒瓶,攪拌至完全溶解,室溫下用恒壓滴定管緩慢滴加80% 3-溴丙酮酸乙酯(29.5 g, 120.0 mmol),室溫下反應0.5 h后,加熱回流2 h,監測至反應結束。向反應液中加入飽和NaHCO3調節pH=8～9,減壓蒸餾后加CH2Cl2溶解,加入飽和食鹽水進行交叉萃取,用無水硫酸鈉干燥,脫溶劑得到化合物2的粗產品。隨后通過柱層析純化(洗脫劑:石油醚 ∶乙酸乙酯=4 ∶1,V∶V),得到化合物3。

(3) 化合物4的合成

將化合物2和溶解在水中的NaOH(4.8 g, 120.0 mmol)依次加入圓底燒瓶中,加熱回流反應5 h,監測至反應結束。向反應液中加入稀鹽酸調節pH=4～5,攪拌0.5 h后,加水析出白色固體,抽濾得到濾餅,即化合物3的純品(4)[6]。

(4) 目標化合物6a～6l的合成

參照文獻[10-11]方法,將6.0 mmol化合物3加入含有50 mL CH2Cl2的圓底燒瓶中,用恒壓滴定管緩慢滴加二氯亞砜,隨后滴加2滴DMF,待體系穩定后升溫反應2 h。監測至反應結束后,將反應液旋干并加入20 mL CH2Cl2溶解。冰浴條件下加入不同取代苯胺(6.6 mmol),同時加入三乙胺(6.6 mmol)作為縛酸劑,在室溫下反應6 h。反應結束后,向反應液中加入稀鹽酸調pH=5～6,加入飽和食鹽水和反應液進行交叉萃取,合并有機層,干燥,減壓濃縮得粗品,經柱層析(洗脫劑:乙酸乙酯 ∶石油醚=5 ∶1,V∶V)純化,得到目標化合物6a～6l。

N-(2-乙基苯基)-2-苯基噻唑-4-酰胺(6a):棕色固體,產率56.1%, m.p.124～126 ℃;1H NMR(400 MHz, CDCl3)δ: 9.49(s, 1H), 8.23(m, 2H), 7.99(dd,J=6.8 Hz,J=3.2 Hz, 2H), 7.50(m, 3H), 7.29(m, 2H), 7.14(t,J=8.0 Hz, 1H), 2.80(q,J=7.6 Hz, 2H), 1.38(t,J=7.6 Hz, 3H);13C NMR(101 MHz, CDCl3)δ: 168.15, 158.82, 151.13, 135.21, 133.72, 132.70, 130.80, 129.17, 128.75, 126.92, 126.55, 124.93, 123.32, 121.83, 24.68, 13.98; HR-MS(ESI)m/z: calcd for C18H16N2OS{[M+H]+}309.1056, found 309.1051。

N-(4-乙基苯基)-2-苯基噻唑-4-酰胺(6b):棕紅色液體,產率91.2%;1H NMR(400 MHz, CDCl3)δ: 9.26(s, 1H), 8.17(d,J=12.6 Hz, 1H), 8.00(dd,J=6.8 Hz, 2.8 Hz, 2H), 7.66(d,J=8.4 Hz, 2H), 7.48(m, 3H), 7.22(d,J=8.4 Hz, 2H), 2.66(q,J=7.6 Hz, 2H), 1.25(t,J=7.6 Hz, 3H);13C NMR(101 MHz, CDCl3)δ: 168.21, 158.76, 150.95, 140.50, 135.27, 132.68, 130.76, 129.02, 128.39, 126.96, 126.68, 123.47, 119.91, 28.34, 15.63; HR-MS(ESI)m/z: calcd for C18H16N2OS{[M+H]+}309.1056, found 309.1051。

N-(2-異丙基苯基)-2-苯基噻唑-4-酰胺(6c):棕黃色固體,產率58.1%, m.p.119～121 ℃;1H NMR(400 MHz, CDCl3)δ: 9.50(s, 1H), 8.21(s, 1H), 8.14(d,J=8.0 Hz, 1H), 7.99(dd,J=6.4 Hz, 2.8 Hz, 2H), 7.51(m, 3H), 7.34(d,J=7.6 Hz, 1H), 7.29(d,J=7.6 Hz, 1H), 7.20(t,J=7.2 Hz, 1H), 3.24(dt,J=13.6 Hz, 6.8 Hz, 1H), 1.38(d,J=6.8 Hz, 6H);13C NMR(101 MHz, CDCl3)δ: 168.16, 158.97, 151.13, 138.85, 134.34, 132.71, 130.79, 129.17, 126.55, 125.63, 125.38, 123.34, 122.81, 28.35, 22.79; HR-MS(ESI)m/z: calcd for C19H18N2OS{[M+H]+}323.1213, found 323.1210。

N-(4-異丙基苯胺)-2-苯基噻唑-4-酰胺(6d):棕紅色液體,產率67.3%;1H NMR(400 MHz, CDCl3)δ: 9.26(s, 1H), 8.18(d,J=13.2 Hz, 1H), 8.00(dd,J=6.8 Hz, 2.8 Hz, 2H), 7.67(d,J=8.4 Hz, 2H), 7.50(m, 3H), 7.26(s, 1H), 7.24(s, 1H), 2.92(dt,J=13.6 Hz, 6.8 Hz, 1H), 1.27(d,J=6.8Hz, 6H);13C NMR(101 MHz, CDCl3)δ: 168.24, 158.78, 150.97, 145.17, 132.70, 130.73, 129.04, 126.98, 126.71, 123.50, 119.94, 33.64, 24.03; HR-MS(ESI)m/z: calcd for C19H18N2OS{[M+H]+}323.1213, found 323.1207。

N-(4-叔丁基苯基)-2-苯基噻唑-4-酰胺(6e):黃色液體,產率51.9%;1H NMR(400 MHz, CDCl3)δ: 9.26(s, 1H), 8.19(s, 1H), 8.00(dd,J=6.8 Hz, 3.2 Hz, 2H), 7.67(d,J=8.8 Hz, 2H), 7.50(m, 3H), 7.41(d,J=8.8 Hz, 2H), 1.32(d,J=16.8 Hz, 9H);13C NMR(101 MHz, CDCl3)δ: 168.25, 158.80, 150.96, 147.43, 135.02, 132.70, 130.79, 129.13, 128.33, 126.71, 125.91, 123.53, 119.62, 34.42, 31.37; HR-MS(ESI)m/z: calcd for C20H20N2OS{[M+H]+}337.1369, found 337.1359。

N-(3-氯苯基)-2-苯基噻唑-4-酰胺(6f):白色固體,產率55.6%, m.p.102～103 ℃;1H NMR(400 MHz, CDCl3)δ: 9.32(s, 1H), 8.21(s, 1H), 8.00(m, 2H), 7.86(t,J=2.0 Hz, 1H), 7.62(dd,J=8.0 Hz, 1.2 Hz, 1H), 7.51(m, 3H), 7.31(t,J=8.0 Hz, 1H), 7.14(ddd,J=8.0 Hz, 2.0 Hz, 0.8 Hz, 1H);13C NMR(101 MHz, CDCl3)δ: 168.48, 158.86, 150.41, 138.81, 134.75, 132.53, 130.92, 130.08, 129.16, 126.71, 124.46, 124.04, 119.84, 117.76; HR-MS(ESI)m/z: calcd for C16H11ClN2OS{[M+H]+}315.0353, found 315.0350。

N-(4-氯苯胺)-2-苯基噻唑-4-酰胺(6g):白色固體,產率68.8%, m.p.113～115 ℃;1H NMR(400 MHz, CDCl3)δ: 9.31(s, 1H), 8.21(s, 1H), 8.00(dd,J=6.8, 3.2 Hz, 2H), 7.72(d,J=8.8 Hz, 2H), 7.51(m, 3H), 7.36(d,J=8.8 Hz, 2H);13C NMR(101 MHz, CDCl3)δ: 168.46, 158.84, 150.51, 136.26, 132.56, 130.91, 129.40, 129.14, 126.71, 123.91, 121.02; HR-MS(ESI)m/z: calcd for C16H11ClN2OS{[M+H]+}315.0353, found 315.0349。

N-(3-溴基苯基)-2-苯基噻唑-4-酰胺(6h):白色固體,產率57.0%, m.p.109～111 ℃;1H NMR(400 MHz, CDCl3)δ: 9.31(s, 1H), 8.21(s, 1H), 8.00(d,J=6.6 Hz, 3H), 7.69(m, 1H), 7.51(m, 3H), 7.29(m, 2H);13C NMR(101 MHz, CDCl3)δ: 168.50, 158.85, 150.40, 138.95, 132.53, 130.93, 130.39, 129.17, 127.39, 126.72, 124.05, 122.69, 118.25; HR-MS(ESI)m/z: calcd for C16H11BrN2OS{[M+H]+}358.9848, found 358.9846。

N-(4-溴基苯基)-2-苯基噻唑-4-酰胺(6i):白色固體,產率56.3%, m.p.116～117 ℃;1H NMR(400 MHz, CDCl3)δ: 9.30(s, 1H), 8.20(s, 1H), 7.99(dd,J=6.7 Hz, 2.9 Hz, 2H), 7.67(d,J=8.8 Hz, 2H), 7.50(dd,J=6.2 Hz, 2.8 Hz, 5H);13C NMR(101 MHz, CDCl3)δ: 168.46, 158.84, 150.50, 136.76, 132.55, 132.06, 130.91, 129.16, 126.71, 123.94, 121.34, 117.01, 112.25; HR-MS(ESI)m/z: calcd for C16H11BrN2OS{[M+H]+}358.9848, found 358.9846。

N-(3-氟苯基)-2-苯基噻唑-4-酰胺(6j):白色固體,產率59.6%, m.p.113～114 ℃;1H NMR(400 MHz, CDCl3)δ: 9.35(s, 1H), 8.22(s, 1H), 8.00(m, 2H), 7.72(dt,J=10.8 Hz, 2.2 Hz, 1H), 7.51(m, 3H), 7.35(ddd,J=14.4 Hz, 12.0 Hz, 7.6 Hz, 2H), 6.86(tdd,J=8.4 Hz, 2.4 Hz, 1.2 Hz, 1H);13C NMR(101 MHz, CDCl3)δ: 168.47, 158.88, 150.45, 139.23, 132.55, 130.92, 130.15, 129.17, 126.72, 124.03, 115.10, 111.25, 111.04, 107.40, 107.14; HR-MS(ESI)m/z: calcd for C16H11FN2OS{[M+H]+}299.0649, found 299.0645。

N-(4-硝基苯基)-2-苯基噻唑-4-酰胺(6k):黃色固體,產率67.5%, m.p.129～131 ℃;1H NMR(400 MHz, CDCl3)δ: 8.40(dd,J=7.6 Hz, 2.0 Hz, 2H), 8.06(dd,J=7.6 Hz, 2.0 Hz, 2H), 7.52(m, 7H);13C NMR(101 MHz, CDCl3)δ: 188.12, 173.80, 132.86, 131.92, 130.71, 130.36, 129.27, 128.69, 128.33, 127.48; HR-MS(ESI)m/z: calcd for C16H11N3O2S{[M+H]+}324.0448, found 324.0448。

N-(2-甲氧苯基)-2-苯基噻唑-4-酰胺(6l):白色固體,產率93.6%, m.p.110～111 ℃;1H NMR(400 MHz, CDCl3)δ: 9.96(s, 1H), 8.56(d,J=6.4 Hz, 1H), 8.19(s, 1H), 8.02(dd,J=6.4 Hz, 3.2 Hz, 2H), 7.50(m, 3H), 7.08(m, 2H), 6.95(d,J=8.0 Hz, 1H), 3.99(s, 3H);13C NMR(101 MHz, CDCl3)δ: 168.03, 158.82, 148.47, 130.69, 129.10, 127.55, 126.65, 123.99, 123.34, 121.13, 119.85, 110.09, 55.98; HR-MS(ESI)m/z: calcd for C17H14N2O2S{[M+H]+}311.0849, found 311.0838。

1.4 生物活性測定

采用菌絲生長速率法[12-15]測定化合物6a～6l對6種植物病原真菌的離體殺菌活性,藥劑初篩濃度為0.200 mmol/L。操作方法為:將目標化合物溶解于0.5 mL 二甲基亞砜(DMSO)。用含有0.1%(質量分數)的吐溫80水溶液定容至50 mL,并加入到滅菌后的PDA培養基中,制成含藥培養基。在含藥培養基上接入菌餅,每個藥劑重復3次,以申嗪霉素為對照藥劑,以0.5 mL DMSO處理組為溶劑對照。將接種后的培養基置于生化培養箱中培養,培養溫度為28 ℃。待空白對照菌落長至接近2/3培養皿直徑時,以十字交叉法測定各處理菌落的直徑,并計算供試化合物對病原菌的生長抑制率。選擇在初篩濃度下對病原菌抑制率大于60%的化合物,測定EC50值。同樣采用菌絲生長速率法,操作方法同上,測定各濃度下目標化合物對供試植物病原菌的抑制率。采用軟件DPS計算EC50值和95%置信限。

2 結果與討論

2.1 化合物的合成分析

本研究通過五步反應得到目標化合物6a～6l。以苯甲腈為原料,通過成環,水解反應分別得到化合物2～4;進一步將化合物4與二氯亞砜反應得到相應的酰氯,此過程應保證在無水條件下進行;待反應結束后應迅速以二氯甲烷為溶劑,三乙胺為縛酸劑進行酰胺反應,此過程要求將酰氯緩慢滴加至苯胺溶液中。該反應在低溫條件下對反應有利,高于室溫時副產物增多?；衔锝Y構均經1H NMR,13C MNR和HR-MS(MSI)得到確證。

2.2 目標化合物的殺菌活性

離體殺菌活性測定結果如表1所示,結果表明,目標化合物對6種供試真菌均有一定的殺菌活性。在0.2 mmol/L濃度下,化合物6b、6c、6d、6e、6k和6l對水稻紋枯病菌的抑制率為57.0%～84.0%,其中6b和6k與對照藥劑申嗪霉素抑菌效果相當;化合物6a、6c和6l對水稻稻瘟病菌的抑制率分別為75.8%、 88.8%和91.6%,均略低于申嗪霉素。根據預實驗結果測定了殺菌活性較高化合物的EC50值。從表2數據可以看出,化合物6b對水稻紋枯病菌殺菌活性較強,EC50值為0.041 mmol/L,但殺菌活性低于對照藥劑申嗪霉素;化合物6c和6l對水稻稻瘟病病菌殺菌活性最強,EC50值分別為0.015 mmol/L和0.020 mmol/L,其毒力高于對照藥劑申嗪霉素。初步構效關系分析結果表明,目標化合物對供試病菌的抑制活性與連接酰胺的苯環上取代基(R)的性質有關。當取代基R為烷基(供電子基團)時,對位取代的總體活性要優于鄰位取代的活性;當取代基R為鹵素原子時,其對水稻紋枯的抑制率較優,而總體活性則是對位取代更優于鄰位和間位;對于取代基R為其它基團時,則有不同的抑制效果,如6k(R為吸電子基團)對水稻紋枯病菌具有良好抑制作用。

表1 目標化合物對6種植物病原真菌的抑制作用aTable 1 Inhibitory effects of target compounds on 6 plant pathogenic fungi

表2 部分目標化合物對供試病原菌的EC50值Table 2 EC50 values of partial target compounds against test phytopathogens

本研究以Thiasporine A中的殺菌活性結構苯基噻唑為先導,將酰胺活性亞結構單元引入到苯基噻唑分子骨架,設計合成了12個N-(苯基)噻唑酰胺類衍生物(6a～6l)。殺菌活性結果表明:在0.200 mmol/L時,大部分化合物對水稻紋枯病菌表現出較好的殺菌活性,其中6b和6k抑制作用與對照藥劑申嗪霉素相當;化合物6c和6l對水稻稻瘟病菌表現出良好的殺菌活性,其EC50值均低于對照藥劑申嗪霉素,抑制作用高于對照藥劑,說明將酰胺活性亞結構單元引入到苯基噻唑分子骨架上對生物活性有一定的改善作用,而其結構的改造有待進一步研究。