基于多功能納米酶的高靈敏金黃色葡萄球菌Apt-LFA檢測方法

李秀萍,孫成棟,王曉瓊,錢志娟,彭池方*

(1 江南大學 食品學院,江蘇 無錫 214122;2 南京海關工業品中心,江蘇 南京210001;3 南京海關輕工產品與兒童用品檢測中心,江蘇 揚州 225009)

食源性疾病尤其是致病菌引起的傳染病,是全球主要公共衛生問題之一,每年造成數百萬人死亡[1-2]。食品和飲用水中常見的金黃色葡萄球菌、單增李斯特菌、大腸桿菌等是大多數食源性疾病的罪魁禍首[3-4]。致病菌的檢測方法眾多,但傳統的致病菌檢測方法操作復雜、檢測時間長、需要專業的操作人員。開發食品中病原菌的快速、高特異性和高靈敏度檢測方法對食品安全具有重要意義[5-6]。

側流層析分析(lateral flow assay,LFA)是一種廣泛使用的紙基生物傳感器。它通常使用比色或熒光試劑作為信號標簽,以發出肉眼、光譜儀或手機可讀的定性信號[7-8]。LFA通?？梢栽趲追昼妰鹊玫綔y試結果且無需專業訓練的操作人員和復雜昂貴的儀器,具有操作簡單、檢測速度快、檢測成本低等優點,在病原菌檢測領域有著廣闊的應用空間[9]。長期以來,LFA的識別元件一直依賴于抗體,但基于抗體的LFA存在批次間差異大、儲存條件高等缺陷[10]。適配體(aptamer,Apt)由于批次間差異較小、熱穩定性高、免疫原性低、成本低,有望成為抗體的良好替代品。近年來,研究人員已經設計出多種基于適配體的側向流動分析試紙條(Apt-LFA),并應用于致病菌的檢測。Fang等[11]建立了一種基于等溫鏈置換擴增的Apt-LFA,并成功應用于沙門氏菌的檢測,其檢測限(limit of detection,LOD)為10 CFU/mL。Ren等[12]用適配體-核酸外切酶Ⅲ輔助擴增與LFA相結合,建立了牛奶中檢測大腸桿菌O157∶H7的方法,其LOD為835 CFU/mL。

然而,到目前為止,Apt-LFA在致病菌的實際檢測應用方面依然發展緩慢。這主要是因為核酸擴增對操作環境要求較高,與核酸LFA平臺集成,很難體現LFA方法的低成本、易操作等優勢?；诩{米酶(nanoenzyme)的高催化活性、高穩定性、低成本等特性,越來越多的研究人員利用納米酶設計LFA新型信號傳感器[13-14]。Wei等[15]開發出一種基于Au-Ir NP的側流層析免疫分析(lateral flow immunoassay,LFIA)方法,并成功應用于2種不同癌癥生物標志物的檢測,其檢測限比傳統基于AuNP的LFIA的靈敏度高2個數量級。Wu等[16]設計出基于Fe3O4@Au核殼納米粒子的Apt-LFA,并成功應用于β-凝血素的檢測,其LOD為8 fmol/L。Lai等[17]通過將Fe3O4、PDA和Pd/Pt整合,合成了Fe3O4@PDA@Pd/Pt多功能納米酶,并將其作為LFIA的探針應用于人絨毛膜促性腺激素和大腸桿菌O157:H7的檢測,其LOD分別低至0.009 4 mIU/mL和90 CFU/mL。

受上述研究的啟發,本研究將合成一種多功能納米酶(Fe3O4@MOF@PtPd)作為信號探針,使其具有磁分離和信號放大2種功能;同時整合致病菌的特異性適配體和萬古霉素(VAN)作為雙重識別單元,進一步提高對革蘭氏陽性細菌的識別能力[18-20]。生物素化的適配體與VAN共同完成對金黃色葡萄球菌的識別,結合LFA平臺,將Fe3O4@MOF@PtPd納米探針在試紙條上捕獲,進一步通過催化顯色,以實現對金黃色葡萄球菌的高靈敏快速檢測。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

氯化鐵(FeCl3·6H2O)、乙酸胺(NH4OAc)、乙二醇(EG)、乙二胺四乙酸二鈉鹽(EDTA-2Na)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、均苯三甲酸(H3btc)、乙醇、碘化鉀(KI)、過氧化氫(H2O2)購于國藥集團化學試劑有限公司;六水合氯鉑酸(H2PtCl6·6H2O)、丙酮、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、四氯鈀酸鉀(Na2PdCl4)、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽(EDC-HCl)、N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)、鹽酸萬古霉素(VAN-HCl)、3,3’,5,5’-四甲基聯苯胺(TMB)、3,3’-二氨基聯苯胺(DAB)、氯金酸(HAuCl4)、檸檬酸三鈉購自Sigma-Aldrich公司;5’-三磷酸腺苷(ATP)、單磷酸腺苷(AMP)、二磷酸腺苷(ADP)、三磷酸鳥苷(GTP)、三磷酸尿苷(UTP)、三磷酸胞苷(CTP)、牛血清白蛋白(BSA)和鏈霉親和素(SA)購自上海生工生物科技有限公司。結合緩沖液(BB)包含50 mmol/L Tris-HCl(pH 7.4)、100 mmol/L NaCl、5 mmol/L KCl和1 mmol/L MgCl2;顯色液包含4 mmol/L DAB、3 mol/L H2O2和0.2 mol/L NaAc緩沖溶液(pH 3.5);緩沖液A包含10 mmol/L Tris-HCl(pH 7.9)、50 mmol/L NaCl和10 mmol/L MgCl2;1×TBE運行緩沖液包含89 mmol/L Tris-硼酸(pH 8.3)和2 mmol/L EDTA。實驗中使用的吸收墊(SX27)、樣品墊(SB06)、共軛墊(VL78)、NC膜(Sartorius CN140)和PVC塑料背膠均購自上海金標生物科技有限公司。所有溶劑均由無菌水配制。

1.2 儀器與設備

XYZ3050三維噴點平臺和KM-3100切割器,美國BioDot公司;ZJ600多通道膠體金閱讀器,無錫中德伯爾生物技術有限公司;GIC-S100-L61便攜式閱讀掃描器,蘇州海邁精密儀器有限公司;UV-1800分光光度計,日本島津公司;Zetasizer Nano ZS納米粒度電位儀,英國馬爾文儀器有限公司;EM-2100透射電子顯微鏡,日本電子株式會社;MicroCal VP-ITC等溫滴定量熱儀,英國馬爾文儀器有限公司;Chirascan v100圓二色光譜儀,英國應用光物理公司;Antaris Ⅱ傅里葉變換紅外光譜儀,賽默飛世爾科技(中國)有限公司;D8 ADVANCE X射線衍射儀,布魯克納集團(德國)有限公司;BDFACS Calibur流式細胞分析儀,美國碧迪醫療器械(上海)有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 細菌培養

本研究中所用微生物包括:金黃色葡萄球菌(ATCC 29213)、單增李斯特菌(ATCC 19115)、大腸桿菌(ATCC 25922)、鼠傷寒沙門氏菌(CICC 10420)、副溶血性弧菌(CICC 21617)和福氏痢疾桿菌(ATCC 12022)。

將菌株轉移到LB瓊脂培養基中,37 ℃過夜活化。調整細菌濃度為1×108CFU/mL,波長600 nm條件下的吸光度值為0.8。細菌原液連續稀釋10倍至測試濃度,4 ℃儲存用于進一步實驗。

1.3.2 羧基功能化Fe3O4納米粒子的制備

通過溶熱反應合成羧基功能化的Fe3O4納米粒子[21],具體步驟如下:將0.8 g FeCl3·6H2O溶解于40 mL乙二醇中,充分攪拌得到透明分散液。將2 g無水NH4OAc和0.5 g EDTA-2Na依次加入分散液,劇烈超聲攪拌直至變均勻。將混合物轉移到有特氟龍襯里的不銹鋼高壓釜中,200 ℃充分反應12 h,所得產物用去離子水和乙醇各洗滌3次,并在60 ℃條件下真空干燥12 h。

1.3.3 Fe3O4@MOF納米顆粒的制備

通過一鍋組裝程序合成Fe3O4@MOF[22],具體步驟如下:將50 mg上述羧基功能化的Fe3O4分散于4 mL的FeCl3·6H2O乙醇中,加入4 mL H3btc乙醇溶液(10 mmol/L),持續攪拌10 min。在70 ℃條件下繼續攪拌2 h后,通過外部磁場分離并收集產物,用乙醇洗滌3次。將產物中繼續加入以上相同量的FeCl3·6H2O乙醇溶液和H3btc乙醇溶液,進一步生長反應,該過程重復5次。最后通過外部磁場回收樣品,乙醇洗滌3次,60 ℃真空干燥12 h。

1.3.4 鉑鈀納米立方的制備

鉑鈀納米立方(PtPd NCs)的制備過程如下[23]:1 mL Na2PdCl4(20 mmol/L)、1 mL H2PtCl6·6H2O (20 mmol/L)、83 mg KI、160 mg PVP與10 mL的DMF混合,混合物超聲2 min,130 ℃加熱5 h,冷卻至室溫并用丙酮洗滌沉淀3次。重懸至DMF中4 ℃儲存。

1.3.5 磁性復合納米酶的制備

Fe3O4@MOF@PtPd、Fe3O4@MOF@Pt、Fe3O4@MOF@Pd磁性復合納米酶的制備參照文獻[24-25]并進行改良,具體步驟如下:分別將200 μL合成的PtPd NCs、Pt NCs和Pd NCs溶液在劇烈攪拌下滴加到2 mL含Fe3O4@MOF的DMF中(10 mg/mL),室溫下攪拌2 h。通過外部磁場回收樣品并用乙醇洗滌,60 ℃條件下真空干燥12 h,保存備用。

1.3.6 磁性納米酶標記VAN和cDNAc探針的制備

探針制備根據文獻[19,26]進行改良。Fe3O4@MOF@PtPd@BSA探針是在EDC的作用下,通過MIL-100(Fe)上殘留的羧基與BSA的氨基之間形成氨基鍵獲得,具體步驟如下:2 mL Fe3O4@MOF@PtPd懸浮液(10 mg/mL)用磷酸緩沖液(PBS,0.01 mol/L,pH 7.4)洗滌3次,重懸于含有5.8 mg EDC和6.5 mg NHS的PBS中?；罨? h后,PBS洗滌3次,并分散在含有24 mg BSA的PBS(8 mL)中。2 h后,通過外部磁場收集BSA修飾的Fe3O4@MOF@PtPd,PBS洗滌3次,分散于PBS中。

為制備Fe3O4@MOF@PtPd@VANcDNAc,室溫下用5 mg/mL EDC和5 mg/mL NHS將10 mg/mL VAN在1.0 mL PBS中活化10 min,得到混合液A。同時,室溫下用5 mg/mL EDC和5 mg/mL NHS將20 μL cDNAc(100 μmol/L)在1 mL PBS中活化10 min,得到混合液B。將混合液A和混合液B加入到上述經BSA修飾的Fe3O4@MOF@PtPd中,37 ℃、180 r/min條件下反應6 h,PBS洗滌3次,分散于2 mL PBS中,其中含10%蔗糖和0.25% Tween-20。將探針儲存于4 ℃備用。

1.3.7 磁性納米酶標記探針對菌的捕獲性能

研究磁性納米酶標記探針對致病菌的捕獲能力,對其進行定量評估。將原菌液以及被探針捕獲后的上清液在LB固體培養基上37 ℃過夜,用于活細胞計數,根據下式計算捕獲效率:

(1)

式中:E表示捕獲效率;O表示原始細菌的數量;R表示被探針捕獲后上清液中的細菌數量。

1.3.8 側流層析裝置的組裝

使用4種材料制備側流層析裝置。將樣品墊、NC膜、吸收墊依次貼在PVC膠背上,每部分重疊2 mm,在PVC膠背下正對NC膜的位置貼上軟磁鐵;將樣品墊、金標墊、NC膜和吸收墊依次貼在PVC底板上,每部分重疊2 mm。用三維噴點平臺在NC膜的測試線(T線)和對照線(C線)上分別噴灑2 mg/mL SA和83 μmol/L SA-Bio-DNAc,并在37 ℃條件下干燥4 h,T線和C線之間的距離是5 mm。最后,將試紙切成寬度為4 mm的試紙條,4 ℃條件下儲存。

1.3.9 致病菌的檢測

首先,將細菌培養液進行預處理,處理方式同流式細胞分析實驗。然后,將6 μL Fe3O4@MOF@PtPd@VANcDNAc(0.5 mg/mL,由Fe3O4確定)和生物素化Apt(40 nmol/L)加入相同濃度致病菌(0、1×10、5×10、1×102、5×102、1×103、5×103、1×104、5×104、1×105、1×106、1×107和1×108CFU/mL)的懸浮液,總體積為200 μL。在37 ℃條件下孵育60 min后,通過磁分離將未結合的致病菌分離,所得沉淀物重新懸浮于200 μL的運行緩沖液(4×SSC,0.5% Tween-20,pH 7)中。取70 μL滴在側流層析裝置的樣品墊上,8 min后在測試條T線和C線處滴加0.8 μL顯色液,催化90 s,用智能手機拍攝測試條的照片。

1.3.10 實際樣品分析

為驗證設計的LFA在實際分析中的適用性,在牛奶中進行加標回收實驗。將已知濃度的細菌(1×102、1×104、1×106和1×108CFU/mL)添加到25 mL牛奶中,根據國標GB 4789.2—2022[27],將加標的25 mL牛奶加入225 mL BB緩沖液中?？瞻讟悠返年幮詫φ找舶聪嗨瞥绦蛑苽?。最后,用設計的LFA對加標樣品進行檢測。

1.3.11 數據收集和處理

使用智能手機拍攝測試條的照片,使用Image J處理獲得灰度值,使用Origin 2021處理數據并繪制圖像,使用相對信號強度作為優化指標。

2 結果與討論

2.1 Fe3O4@MOF@PtPd的合成與表征

Fe3O4納米顆粒的透射電子顯微鏡(TEM)圖像(圖1a)顯示,它具有良好的均勻性和單分散性,粒徑為235±12 nm,與之前報道一致[21]。Fe3O4納米顆粒作為MIL-100(Fe)原位生長的核心,通過組裝形成Fe3O4@MOF納米結構。TEM圖像(圖1b)顯示,獲得的Fe3O4@MOF具有清晰的核殼結構,經過5個生長周期,磁芯周圍具有一層平均厚度為50±5 nm的MIL-100(Fe)殼層,表明MIL-100(Fe)成功包覆在Fe3O4納米顆粒表面。將8 nm的PtPd NCs包覆在Fe3O4@MOF表面,進一步制備出Fe3O4@MOF@PtPd,其TEM圖像(圖1c)顯示,高密度的PtPd NCs分布在Fe3O4@MOF表面,說明PtPd NCs成功負載。

圖1 Fe3O4(a)、Fe3O4@MOF(b)和Fe3O4@MOF@PtPd(c)的TEM圖像

圖2 復合材料的FT-IR光譜(a)及磁滯曲線(b)

2.2 Fe3O4@MOF@PtPd的催化性能

合成的Fe3O4@MOF@PtPd納米酶由Fe3O4納米顆粒、MIL-100(Fe)和鉑鈀納米立方(PtPd NCs)組成。MIL-100(Fe)固有的高過氧化物酶活性可以提高納米酶的催化性能,其作為多孔間隔層還可以較好的保留Fe3O4納米粒子的磁性,也可作為吸附層裝載大量的PtPd NCs。PtPd NCs的雙金屬協同效應可以進一步增強納米酶的催化能力[23,28]。具有納米酶性質的納米復合材料的信號放大能力通常由其過氧化物酶活性決定,為進一步測定其過氧化物酶活性,記錄MIL-100(Fe)、PtPd NCs、Fe3O4、Fe3O4@MOF@PtPd催化氧化TMB前后在450、650 nm處的吸光度,發現4種材料的最低可檢出限分別為5 000、5 000、500、500 fmol/L。在加入H2O2與TMB后,4種納米材料的LOD值出現不同程度的下降,分別為250、500、100、2.5 fmol/L(圖3)。因此,與MIL-100(Fe)、PtPd NCs、Fe3O4相比,Fe3O4@MOF@PtPd具有更好的過氧化物酶活性,選擇其作為納米標記材料進一步用于后續研究。

a、b、c、d分別為MIL-100(Fe)、PtPd NCs、Fe3O4、Fe3O4@MOF@PtPd催化H2O2(0.1 mmol/L)和TMB(1 mmol/L)反應前后的照片,顆粒從左至右物質的量濃度依次為10 000、5 000、2 000、1 000、750、500、250、100、75、50、25、10、7.5、5、2.5和1 fmol/L;e、f、g、h分別為MIL-100(Fe)、PtPd NCs、Fe3O4、Fe3O4@MOF@PtPd催化H2O2-TMB前后,體系在450 nm和650 nm處的吸光度值。

2.3 磁性納米酶標記探針對菌的捕獲性能

由圖4可見,磁性納米酶標記探針對1×102～1×104CFU/mL的金黃色葡萄球菌均具有較高的捕獲效率,探針富集后剩余的細菌數量遠遠小于原菌液中的細菌數量,計數分析顯示捕獲效率均超過90%以上。

圖4 磁性納米酶標記探針對目標菌的富集能力評估

2.4 LFA方法的優化

基于Fe3O4@MOF@PtPd磁性納米酶可增強Apt與病原菌的結合親和力,開發新型側流層析傳感器,通過單因素實驗分析,對顯色液中VTMB∶VH2O2、顯色液體積、顯色時間、Fe3O4@MOF@PtPd信號探針體積4個實驗參數進行優化,以獲得最佳實驗條件,結果如圖5所示?？梢钥闯?LFA的最佳測定參數為:VTMB∶VH2O2=5∶5,顯色液體積為0.5 μL,滴加顯色液30 s后進行數據記錄,Fe3O4@MOF@PtPd(0.5 mg/mL)信號探針的使用體積為1.0 μL。

圖5 LFA方法優化單因素實驗

2.5 側流層析傳感器的性能測定

在上述優化的最佳實驗條件下,對所開發的側流層析傳感器性能進行評估,發現經過多功能Fe3O4@MOF@PtPd納米酶催化后的T線強度隨金黃色葡萄球菌濃度的增加而增大(圖6a)。該LFA的校準曲線(圖6b)顯示,其檢測金黃色葡萄球菌的線性范圍為10～100 000 CFU/mL(R2=0.976),LOD值為2 CFU/mL。

圖6 所開發LFA的性能測定

通過整合致病菌的特異性適配體和VAN作為雙重識別單元,可實現對革蘭氏陽性細菌的高特異性識別。其中,VAN修飾在Fe3O4@MOF@PtPd表面,可與革蘭氏陽性細菌細胞壁上的D-Ala-D-Ala位點結合[26,29-30],實現細菌的富集分離。為了驗證該LFA對金黃色葡萄球菌的特異性,對幾種常見革蘭氏陽性菌(1×106CFU/mL)進行檢測,包括單增李斯特菌(ATCC 19115)、嗜熱鏈球菌(ATCC 19258)、大腸桿菌(ATCC 25922)、鼠傷寒沙門氏菌(CICC 10420)、副溶血性弧菌(CICC 21617)、福氏痢疾桿菌(ATCC 12022)等。如圖7所示,只有靶標是金黃色葡萄球菌時,T線才顯示出強烈的信號,因此,該LFA具有良好的特異性。

圖7 設計的LFA對金黃色葡萄球菌的選擇性

在證實該LFA對金黃色葡萄球菌具有良好的選擇性后,采用經典加標回收實驗評估傳感器的實際應用效果,結果如表1所示。該LFA傳感器表現出優異的回收率(96.9%～103.4%),且相對標準偏差小于6.7%。因此,設計的LFA傳感器可以應用于復雜樣品中金黃色葡萄球菌的檢測。

表1 LFA傳感器對牛奶樣品中加標金黃色葡萄球菌的回收結果

3 結論

本研究合成了多功能Fe3O4@MOF@PtPd磁性納米酶,通過Fe3O4@MOF@PtPd磁性納米酶增強Apt與病原菌的結合親和力,開發出新型LFA傳感器,實現了金黃色葡萄球菌的快速、高靈敏度檢測。該LFA以適配體和萬古霉素作為雙重識別單元,對革蘭氏陽性菌的檢測具有普適性,僅需替換特定的適配體就能實現對其他革蘭氏陽性菌的檢測,為將來開發革蘭氏陽性致病菌的POCT傳感器提供了新的啟示。