新型N-取代靛紅雜合喹唑啉類化合物的合成及其抗腫瘤活性

王 偉,馮志娟,呂夢嬌,張婭玲,侯佳威,李寶林

(陜西師范大學 化學化工學院,陜西 西安 710119)

近年來,隨著對腫瘤細胞信號傳導途徑研究的不斷深入,以酪氨酸激酶為靶點的治療成為癌癥治療效果較好的方法之一[1]。喹唑啉類化合物,如已上市的抗腫瘤藥物拉帕替尼(Lapatinib,圖1a)[2-3]、吉非替尼(Gefitinib,圖1b)[4-5]和埃羅替尼(Erlotinib,圖1c)[6]等,是活性較高、選擇性較好的一類小分子酪氨酸激酶抑制劑。其中,拉帕替尼是首個可口服的雙靶點小分子酪氨酸激酶抑制劑,它可以同時作用于表皮生長因子受體EGFR和HER-2,抑制其活性,阻止表皮生長因子受體過度表達,抑制癌細胞增殖[7]。然而,上述抗腫瘤藥物在使用一段時間后會產生耐藥性,同時也具有一定的毒副作用,易引發腹瀉、惡心、嘔吐、皮疹及肝損傷等癥狀。

圖1 部分抗腫瘤化合物的結構式

靛紅,又名1-氫-吲哚-2,3-二酮,是人體組織中一種內源性雜環分子[8],也是海洋生物維持生存所必需的一種天然活性物質,具有多種藥理活性[9-10]。目前,對靛紅的研究包括1-位N原子上的取代、2-位和3-位羰基碳修飾以及苯環修飾,其中修飾3-位羰基碳所得化合物的抗腫瘤活性最高,如3-芳基亞甲基靛紅衍生物[11]、靛紅-3-腙衍生物[12]、靛紅-3-亞胺金屬配合物[13]和C3-靛紅螺環衍生物[14-15]等。研究表明,靛紅類化合物可作用于血管內皮細胞生長因子受體VEGFR-2、成纖維細胞生長因子受體FGFR-1等,通過抑制其過度表達而誘導腫瘤細胞凋亡[16]。已上市的含靛紅結構單元的抗腫瘤藥物如舒尼替尼(Sunitinib,圖1d)[17-18]、托西尼布磷酸鹽(Toceranib phosphate)[18]可用于治療腎癌、胃腸道腫瘤等疾病,說明靛紅衍生物在抗腫瘤方面具有藥用價值。

部分靶向藥物服用一段時間后會產生耐藥性,而將2個或2個以上具有不同藥效或互補藥效的生物片段進行雜合,其協同作用能夠增強癌癥治療效果[19]。鑒于上述喹唑啉類化合物和靛紅衍生物在抗腫瘤方面的良好效果,本研究擬采用藥效基團雜合的方式[20],在課題組前期工作的基礎上[21],以拉帕替尼的藥效基團喹唑啉環為母核,4-位分別連接不同的芳氨基結構單元,6-位連接呋喃甲醛基結構單元,并進一步在醛基上連接靛紅腙結構單元?；谝陨显O計思路,進行結構新穎的N-取代靛紅雜合喹唑啉類化合物的合成,并對所合成化合物進行初步的抗腫瘤活性研究。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

核磁共振儀,Bruker Avance 600 MHz,四甲基硅烷作為內標;紅外光譜儀,Bruker Fensor 27;高分辨質譜儀,Bruker Esquire 3000plus;顯微熔點測定儀,X-6,北京泰克儀器有限公司。

所用試劑均為市售分析純。所用受試細胞株人結腸癌細胞SW480、人皮膚鱗狀細胞癌細胞A431、人非小細胞肺癌細胞NCI-H1975和A549均購自中國科學院細胞庫。

1.2 實驗方法

本研究共合成9個結構新穎的N-取代靛紅雜合喹唑啉類化合物(8a～8i),其合成路線如圖2所示。

A:CH3COOH,130 ℃,20 min;B:5% Pd/C,乙二醇二甲醚,MeOH,Et3N,50 ℃,3 h;C:CHCl3,H2O,K2CO3,40 ℃,4 h;D:CH3OH,65 ℃,30 min;E:C2H5OH,N,N-二甲基甲酰胺,CH3COOH,79 ℃,6 h。

1.2.1 化合物3a～3c的合成

稱取N′-(2-氰基-4-碘苯基)-N,N-二甲基甲脒(2.99 g,10.0 mmol)和芳胺化合物2a～2c(11 mmol)于圓底燒瓶中,加入5 mL冰乙酸溶解,130 ℃反應20 min,冷卻至室溫。減壓旋蒸除去冰乙酸,向體系中加入20 mL蒸餾水,并用濃氨水調節pH值為9～10,室溫下攪拌30 min。抽濾,水洗濾餅,所得濾餅經硅膠柱色譜分離(洗脫劑中V乙酸乙酯∶V石油醚=1∶6),得到白色固體即為化合物3a～3c。

4-(3-乙炔基苯氨基)-6-碘喹唑啉(3a)[7],白色固體3.05 g,收率為83%。

4-(3-氯-4-氟苯氨基)-6-碘喹唑啉(3b)[7],白色固體3.48 g,收率為88%。

4-[3-氯-4-(3-氟芐氧基)苯氨基]-6-碘喹唑啉(3c)[7],白色固體4.55 g,收率為91%。

1.2.2 化合物4a～4c的合成

稱取化合物3a～3c(6 mmol)、5-甲?；秽?2-硼酸(1.12 g,8.0 mmol)、5% Pd/C (0.56 g)于圓底燒瓶中,加入40 mL乙二醇二甲醚和20 mL甲醇,并加入三乙胺(2.42 g,24 mmol),50 ℃反應3 h。趁熱抽濾,濾餅用四氫呋喃洗滌,將濾液減壓旋蒸除去溶劑,所得濃縮物經硅膠柱色譜分離(洗脫劑中V乙酸乙酯∶V氯仿=1∶15),得到橘黃色固體即為化合物4a～4c。

4-(3-乙炔基苯氨基)-6-(5-甲?；秽?2-基)喹唑啉(4a)[7],橘黃色固體1.44 g,收率為71%。

4-(3-氯-4-氟苯氨基)-6-(5-甲?；秽?2-基)喹唑啉(4b)[7],橘黃色固體1.85 g,收率為85%。

4-[3-氯-4-(3-氟芐氧基)苯氨基]-6-(5-甲?；秽?2-基)喹唑啉(4c)[22],橘黃色固體2.44 g,收率為86%。

1.2.3 化合物6a～6c的合成

稱取化合物5a～5c(10 mmol)、碳酸鉀(5.53 g,40 mmol)于圓底燒瓶中,加入10 mL氯仿;稱取N,N-二乙氨基氯乙烷鹽酸鹽(3.44 g,20 mmol)于另一個圓底燒瓶中,加入9 mL水。將N,N-二乙氨基氯乙烷鹽酸鹽水溶液加入裝有化合物5a～5c的圓底燒瓶中,室溫劇烈攪拌10 h。反應完全后,用氯仿(30 mL)萃取2次,有機相合并,并用無水硫酸鎂干燥,減壓旋蒸除去溶劑,所得濃縮物經硅膠柱色譜分離(洗脫劑中V甲醇∶V乙酸乙酯=1∶80),得到紅色油狀液體即為化合物6a～6c。

1-(2-二乙氨基乙基)-1-氫-吲哚-2,3-二酮(6a),紅色油狀液體1.55 g,收率為63%。

1-(2-二乙氨基乙基)-5-氟-1-氫-吲哚-2,3-二酮(6b),紅色油狀液體1.79 g,收率為68%。

1-(2-二乙氨基乙基)-5-氯-1-氫-吲哚-2,3-二酮(6c),紅色油狀液體2.34 g,收率為83%。

1.2.4 化合物7a～7c的合成

稱取化合物6a～6c (5 mmol)于圓底燒瓶中,加入15 mL甲醇和6.5 mL水合肼(80%),65 ℃回流30 min。待反應液冷卻后,減壓旋蒸除去溶劑,所得濃縮物經硅膠柱色譜分離(洗脫劑中V甲醇∶V乙酸乙酯=1∶80),得到亮黃色油狀液體即為化合物7a～7c。

(Z)-1-(2-二乙氨基乙基)-3-腙吲哚啉-2-酮(7a),亮黃色油狀液體1.06 g,收率為82%。

(Z)-1-(2-二乙氨基乙基)-5-氟-3-腙吲哚啉-2-酮(7b),亮黃色油狀液體1.12 g,收率為80%。

(Z)-1-(2-二乙氨基乙基)-5-氯-3-腙吲哚啉-2-酮(7c),亮黃色油狀液體1.11 g,收率為76%。

1.2.5 化合物8a～8i的合成

稱取化合物4a～4c(0.3 mmol)、化合物7a～7c(0.3 mmol)于圓底燒瓶中,加入7 mL無水乙醇和0.1 mLN,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶解后,再加入0.3 mL冰乙酸,79 ℃回流6 h。冷卻至室溫,減壓旋蒸除去溶劑,所得濃縮物在甲醇-四氫呋喃(THF)混合物中重結晶,得到紅色固體即為化合物8a～8i。

(Z)-1-(2-(二乙氨基乙基))-3-(((E)-(5-(4-(3-乙炔苯氨基)喹唑啉-6-基)呋喃-2-基)亞甲基)亞肼基)吲哚啉-2-酮(8a),紅色固體0.136 g,收率為78%。熔點:242.0～244.4 ℃; HRMS:C35H32N7O2,[M+H]+:582.261 4(計算值582.261 7);1H NMR (600 MHz,DMSO-d6) δ:10.16 (s,1H),9.05 (s,1H),8.74 (s,1H),8.69 (s,1H),8.48 (d,J=6.4 Hz,1H),8.36 (d,J=8.2 Hz,1H),8.09 (s,1H),8.03 (d,J=7.7 Hz,1H),7.93 (d,J=8.9 Hz,1H),7.66～7.65 (m,1H),7.54～7.49 (m,2H),7.47 (t,J=7.7 Hz,1H),7.29 (d,J=7.3 Hz,1H),7.25 (d,J=7.3 Hz,1H),7.22～7.17 (m,1H),4.26 (s,1H),4.12 (brs,2H),3.49 (brs,2H),3.24 (brs,4H),1.19 (brs,6H);13C NMR (151 MHz,DMSO-d6)δ:164.1,157.7,157.0,155.0,152.3,151.0,150.0,149.2,146.0,144.4,139.4,133.5,129.6,129.3,129.0,126.9,126.7,124.9,123.3,123.1,122.6,121.9,119.2,116.7,115.5,110.6,109.5,83.4,80.7,48.6,46.4,34.8,8.7; IRνmax(KBr) cm-1:3 448,2 929,1 714,1 608,1 533,1 384,1 161,842,746,590。

(Z)-1-(2-(二乙氨基乙基))-3-(((E)-(5-(4-(3-乙炔苯氨基)喹唑啉-6-基)呋喃-2-基)亞甲基)亞肼基)-5-氟吲哚啉-2-酮(8b),紅色固體0.134 g,收率為75%。熔點:253.5～256.2 ℃; HRMS:C35H31FN7O2,[M+H]+:600.252 1 (計算值600.252 3);1H NMR(600 MHz,DMSO-d6) δ:10.11(s,1H),9.08(s,1H),8.77(s,1H),8.67(s,1H),8.32(d,J=8.6 Hz,1H),8.24(dd,J=8.0、2.0 Hz,1H),8.08 (s,1H),7.96(d,J=8.0 Hz,1H),7.90(d,J=8.6 Hz,1H),7.68(d,J=3.5 Hz,1H),7.50 (d,J=3.5 Hz,1H),7.45 (t,J=7.9 Hz,1H),7.41 (td,J=8.7、2.7 Hz,1H),7.29～7.28 (m,2H),4.21 (s,1H),4.14 (brs,2H),3.41 (brs,2H),3.29～3.22 (m,4H),1.22 (t,J=6.7 Hz,6H);13C NMR (151 MHz,DMSO-d6) δ:164.0,159.0,157.8,157.4,157.3,154.1 (d,1JC-F=270 Hz),150.8,149.9,149.1,140.6,139.2,129.1,128.9,128.7,127.1,126.7,125.2,123.7,123.0,121.8,119.6(d,2JC-F=23.4 Hz),119.4,117.3 (d,3JC-F=8.9 Hz),116.4 (d,2JC-F=26.1 Hz),115.5,110.8,110.7 (d,3JC-F=8.2 Hz),83.4,80.6,47.8,46.4,34.7,8.3; IRνmax(KBr) cm-1:3 490,2 974,1 716,1 573,1 533,1 384,1 164,1 028,847,574。

(Z)-1-(2-(二乙氨基乙基))-3-(((E)-(5-(4-(3-乙炔苯氨基)喹唑啉-6-基)呋喃-2-基)亞甲基)亞肼基)-5-氯吲哚啉-2-酮(8c),紅色固體0.141 g,收率為76%。熔點:278.7～281.0 ℃;HRMS:C35H31ClN7O2,[M+H]+:616.221 8(計算值:616.222 8);1H NMR (600 MHz,DMSO-d6)δ:10.13 (s,1H),9.09 (s,1H),8.80 (s,1H),8.67 (s,1H),8.55 (brs,1H),8.37 (d,J=8.6 Hz,1H),8.03 (s,1H),7.91 (d,J=8.2 Hz,2H),7.65 (d,J=3.1 Hz,1H),7.61 (d,J=7.9 Hz,1H),7.50 (d,J=3.1 Hz,1H),7.45 (t,J=8.0 Hz,1H),7.31～7.27 (m,2H),4.23 (s,1H),4.14 (brs,2H),3.40 (brs,2H),3.26 (brs,4H),1.21～1.20 (m,6H);13C NMR (151 MHz,DMSO-d6)δ:163.7,157.8,157.2,155.0,153.2,150.8,148.9,142.9,139.1,132.6,129.0,128.9,128.6,127.1,126.6,125.4,124.3,123.1,121.8,119.6,118.0,115.4,111.2,111.1,110.7,83.3,80.7,47.8,46.4,34.6,8.4; IRνmax(KBr) cm-1:3 490,2 974,1 716,1 573,1 533,1 384,1 164,1 028,847,574。

(Z)-1-(2-(二乙氨基乙基))-3-(((E)-(5-(4-(3-氯-4-氟苯氨基)喹唑啉-6-基)呋喃-2-基)亞甲基)亞肼基)吲哚啉-2-酮(8d),紅色固體0.153 g,收率為83%。熔點:231.5～234.1 ℃; HRMS:C33H30ClFN7O2,[M+H]+:610.213 0(計算值:610.213 4);1H NMR (600 MHz,DMSO-d6) δ:10.21 (s,1H),9.01 (s,1H),8.74 (s,1H),8.68 (s,1H),8.47 (d,J=7.4 Hz,1H),8.36 (d,J=8.4 Hz,1H),8.20 (d,J=4.8 Hz,1H),7.93 (d,J=7.8 Hz,2H),7.65 (d,J=3.2 Hz,1H),7.55～7.47 (m,3H),7.27 (d,J=7.8 Hz,1H),7.19 (t,J=7.5 Hz,1H),4.15 (brs,2H),3.42 (brs,2H),3.29 (brs,4H),1.22 (t,J=6.8 Hz,6H);13C NMR (151 MHz,DMSO-d6)δ:164.1,157.7,156.9,154.9,154.3,152.7,152.2,150.0 (d,1JC-F=263 Hz),149.8,144.3,136.3 (d,4JC-F=1.8 Hz),133.5,129.6,129.4,128.9,126.8 (d,3JC-F=8.8 Hz),123.7,123.3,123.0,122.5 (d,3JC-F=6.8 Hz),119.1,118.9 (d,2JC-F=18.4 Hz ),116.7,116.6(d,2JC-F=21.4 Hz),115.4,110.7,109.6,47.9,46.4,34.5,8.3; IRνmax(KBr) cm-1:3 456,2 925,1 716,1 608,1 496,1 191,1 031,810,752,549。

(Z)-1-(2-(二乙氨基乙基))-3-(((E)-(5-(4-(3-氯-4-氟苯氨基)喹唑啉-6-基)呋喃-2-基)亞甲基)亞肼基)-5-氟吲哚啉-2-酮(8e),紅色固體0.152 g,收率為81%。熔點:249.6～252.1 ℃; HRMS:C33H29ClFN7O2,[M+H]+:628.203 6 (計算值:628.203 9);1H NMR (600 MHz,DMSO-d6)δ:10.12 (s,1H),8.98 (s,1H),8.74 (s,1H),8.64 (s,1H),8.27 (d,J=7.5 Hz,1H),8.23 (dd,J=8.2、2.4 Hz,1H),8.19 (d,J=4.8 Hz,1H),7.90 (d,J=7.8 Hz,1H),7.85 (d,J=8.6 Hz,1H),7.65 (d,J=3.6 Hz,1H),7.47～7.44 (m,2H),7.40 (td,J=9.0、2.7 Hz,1H),7.28 (dd,J=8.5、4.0 Hz,1H),4.13 (t,J=5.3 Hz,2H),3.47 (brs,2H),3.30 (brs,4H),1.23 (t,J=7.1 Hz,6H);13C NMR (151 MHz,DMSO-d6)δ:164.0,158.3 (d,1JC-F=215.4 Hz),157.4,157.2,154.8,153.5 (d,1JC-F=242.2 Hz),153.3,150.9 (d,4JC-F=2.2 Hz),149.8,149.0,140.5,136.2 (d,4JC-F=2.0 Hz),129.0,128.7,126.7,123.8 (d,3JC-F=7.3 Hz),123.7,122.5 (d,3JC-F=6.8 Hz),119.6 (d,2JC-F=23.4 Hz),119.2,118.8 (d,2JC-F=18.1 Hz),117.3 (d,3JC-F=9.2 Hz),116.5 (d,2JC-F=21.5 Hz),116.4,115.3,110.8,110.6 (d,3JC-F=7.4 Hz),48.6,46.4,34.6,8.4; IRνmax(KBr) cm-1:3 431,2 979,1 720,1 614,1 498,1 166,1 029,891,810,547。

(Z)-1-(2-(二乙氨基乙基))-3-(((E)-(5-(4-(3-氯-4-氟苯氨基)喹唑啉-6-基)呋喃-2-基)亞甲基)亞肼基)-5-氯吲哚啉-2-酮(8f),紅色固體0.152 g,收率為79%。熔點:251.6～252.7 ℃; HRMS:C33H29Cl2FN7O2,[M+H]+:644.173 1 (計算值:644.174 4);1H NMR (600 MHz,DMSO-d6)δ:10.05 (s,1H),8.95 (s,1H),8.73 (s,1H),8.61 (s,1H),8.47 (m,1H),8.27 (d,J=8.7 Hz,1H),8.13 (d,J=4.5 Hz,1H),7.84～7.80 (m,2H),7.59 (d,J=3.6 Hz,1H),7.57 (dd,J=8.5、1.8 Hz,1H),7.46 (t,J=9.0 Hz,1H),7.42 (d,J=3.6 Hz,1H),7.27 (d,J=8.4 Hz,1H),4.10 (brs,2H),3.49 (brs,2H),3.27 (brs,4H),1.21 (t,J=6.9 Hz,6H);13C NMR (151 MHz,DMSO-d6)δ:163.8,157.6,157.1,154.9,154.3,153.3,152.7,149.8 (d,1JC-F=278.3 Hz),148.9,142.8,136.1,132.5,129.0,128.9,128.6,127.1,126.6,124.2,124.0,122.8 (d,3JC-F=6.7 Hz),119.4,118.8(d,2JC-F=18.1 Hz),117.9,116.5(d,2JC-F=21.6 Hz),115.3,111.1,110.6,47.8,46.4,34.7,8.8; IRνmax(KBr) cm-1:3 525,2 935,1 722,1 608,1 496,1 365,1 031,804,630,547。

(Z)-1-(2-(二乙氨基乙基))-3-(((E)-(5-(4-(3-氯-4-(3-氟芐氧基)苯氨基)喹唑啉-6-基)呋喃-2-基)亞甲基)亞肼基)吲哚啉-2-酮(8g),紅色固體0.139 g,收率為65%。熔點:174.5～176.9 ℃; HRMS:C40H36ClFN7O3,[M+H]+:716.255 6 (計算值:716.255 2);1H NMR (600 MHz,DMSO-d6)δ:10.23 (s,1H),9.26 (s,1H),9.06 (s,1H),8.74 (s,1H),8.65 (s,1H),8.47 (d,J=7.2 Hz,1H),8.36 (d,J=8.6 Hz,1H),8.04 (s,1H),7.93 (d,J=8.7 Hz,1H),7.83 (d,J=8.8 Hz,1H),7.65 (d,J=2.8 Hz,1H),7.54～7.45 (m,3H),7.35～7.31(m,3H),7.28 (d,J=7.8 Hz,1H),7.19 (t,J=7.0 Hz,2H),5.29 (s,2H),4.16 (brs,2H),3.41 (d,J=4.3 Hz,2H),3.27～3.26(m,4H),1.22 (t,J=6.8 Hz,6H);13C NMR (151 MHz,DMSO-d6)δ:163.8,162.2 (d,1JC-F=243.1 Hz),157.6,157.0,155.0,152.0,151.0,149.9,149.7,149.1,144.7,139.6 (d,3JC-F=7.6 Hz),133.4,133.1,130.5 (d,3JC-F=9.1 Hz),129.6,129.0,128.7,126.6,124.4,123.9,123.3 (d,4JC-F=1.5 Hz),123.1,122.7,122.1,121.1,119.1,116.5,115.4,114.6 (d,2JC-F=21.1 Hz),114.3,114.0 (d,2JC-F=22.6 Hz),110.5,109.8,109.5,69.4,48.4,46.5,35.9,9.9; IRνmax(KBr) cm-1:3 654,2 968,1 714,1 604,1 382,1 267,1 024,794,750,513。

(Z)-1-(2-(二乙氨基乙基))-3-(((E)-(5-(4-(3-氯-4-(3-氟芐氧基)苯氨基)喹唑啉-6-基)呋喃-2-基)亞甲基)亞肼基)-5-氟吲哚啉-2-酮(8h),紅色固體0.141 g,收率為64%。熔點:196.7～197.3 ℃; HRMS:C40H35ClF2N7O3,[M+H]+:734.246 4 (計算值:734.245 8);1H NMR (600 MHz,DMSO-d6)δ:10.00 (s,1H),8.98 (s,1H),8.72 (s,1H),8.60 (s,1H),8.25 (d,J=8.8 Hz,1H),8.18 (d,J=6.4 Hz,1H),8.03 (s,1H),7.83 (d,J=8.6 Hz,1H),7.79 (d,J=8.7 Hz,1H),7.63 (d,J=2.0 Hz,1H),7.52～7.46 (m,1H),7.44 (d,J=2.6 Hz,1H),7.37～7.32 (m,3H),7.28 (d,J=9.0 Hz,1H),7.22～7.17 (m,2H),5.27 (s,2H),3.95 (brs,2H),2.99 (brs,4H),1.06 (brs,6H);13C NMR (151 MHz,DMSO-d6)δ:163.7,162.2 (d,1JC-F=244.6 Hz),158.8 (d,1JC-F=238.6 Hz),157.6,157.2 (d,3JC-F=6.0 Hz),155.1,153.0,150.9 (d,4JC-F=3.0 Hz),149.9,149.8,149.0,145.8,141.0,139.6 (d,3JC-F=7.5 Hz),132.9,130.5 (d,3JC-F=7.5 Hz),128.8,128.7,126.5,124.4,124.1,123.5,123.3 (d,4JC-F=3.0 Hz),122.6,122.3,121.0,119.5 (d,2JC-F=24.2 Hz),119.2,116.4 (d,2JC-F=25.7 Hz),115.3,114.7 (d,2JC-F=21.1 Hz),114.2,114.0 (d,2JC-F=21.1 Hz),110.6 (d,3JC-F=9.1 Hz),69.4,48.4,46.5,36.0,10.0; IRνmax(KBr) cm-1:3 332,2 636,1 710,1 617,1 498,1 417,1 269,1 028,810,518。

(Z)-1-(2-(二乙氨基乙基))-3-(((E)-(5-(4-(3-氯-4-(3-氟芐氧基)苯氨基)喹唑啉-6-基)呋喃-2-基)亞甲基)亞肼基)-5-氯吲哚啉-2-酮(8i),紅色固體0.138 g,收率為61%。熔點:199.3～200.9 ℃; HRMS:C40H35Cl2FN7O3,[M+H]+:750.216 6 (計算值:750.216 2);1H NMR (600 MHz,DMSO-d6)δ:10.16 (s,1H),9.03 (s,1H),8.77 (d,J=4.6 Hz,1H),8.62 (s,1H),8.52 (d,J=5.4 Hz,1H),8.33 (t,J=7.7 Hz,1H),7.97 (s,1H),7.85 (t,J=8.3 Hz,1H),7.73 (d,J=8.3 Hz,1H),7.68～7.56 (m,2H),7.52～7.42 (m,2H),7.33 (dd,J=27.2、8.6 Hz,4H),7.20 (t,J=8.3 Hz,1H),5.28 (s,2H),4.13 (brs,2H),3.40 (brs,2H),3.28 (brs,4H),1.22 (t,J=7.0 Hz,6H);13C NMR (151 MHz,DMSO-d6)δ:163.8,162.2 (d,1JC-F=244.6 Hz),157.9,157.1,154.8,153.2,150.7,150.1,148.9,142.9,139.6 (d,3JC-F=7.5 Hz),132.6,130.5 (d,3JC-F=7.5 Hz),129.0,127.9,127.1,126.7,125.9,124.6,124.3,123.3 (d,4JC-F=3 Hz),122.8,122.6,121.1,119.5,118.0,115.2,114.7 (d,2JC-F=21.1 Hz),114.3,114.0 (d,2JC-F=21.1 Hz),111.5,111.2,110.7,69.4,47.8,46.4,34.6,8.3; IRνmax(KBr) cm-1:3 422,2 640,1 714,1 598,1 382,1 261,1 026,981,798,513。

1.2.6 抗腫瘤活性實驗

利用MTT法測定化合物8a～8i對腫瘤細胞的生長抑制活性。取對數期生長狀態良好的人腫瘤細胞SW480、A431、NCI-H1975和A549,用0.25%的胰酶消化液消化細胞,離心收集,重懸計數后,制備成細胞懸液,并調整細胞懸液濃度為2×104～5×104個/mL。隨后將細胞懸液接種于96孔細胞培養板(100 μL/孔),并將其置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的培養箱中培養24 h。用培養基將受試化合物稀釋至相應濃度,并將其加入上述已接種人腫瘤細胞的96孔細胞培養板中(100 μL/孔),調整二甲基亞砜(DMSO)的最終體積分數為0.5%,隨后將培養板置于培養箱中繼續培養。72 h后,在培養板中加入噻唑藍溴化四唑(MTT,20 μL/孔),混勻后,繼續在培養箱中反應。4 h后取出培養板,棄去孔內上清液,加入DMSO(150 μL/孔),將培養板置于搖床上震蕩10 min。待充分溶解甲臜后,用多功能酶標儀測定570 nm處的吸光度,同時以630 nm處的吸光度作為參比,計算腫瘤細胞生長抑制率。

腫瘤細胞生長抑制率= 1—[(DS-DNC)/

(DPC-DNC)]× 100%。

(1)

其中:DS為樣品孔的吸光度(細胞+待測化合物+MTT);DNC為調零孔的吸光度(培養基DMSO+MTT);DPC為對照孔的吸光度(細胞+DMSO+MTT)。

受試化合物對腫瘤細胞生長的抑制曲線采用Graphpad Prism 5軟件擬合,得到IC50值,每組實驗均重復3次。

2 結果與討論

本研究所述的9個N-取代靛紅雜合喹唑啉類化合物8a～8i的合成路線如圖2所示。先是由化合物N′-(2-氰基-4-碘苯基)-N,N-二甲基甲脒分別與3種不同的芳胺類化合物2a～2c進行Dimroth重排反應生成3種喹唑啉類化合物3a～3c;所得3a～3c在鈀碳的催化下分別與5-甲?；秽?2-硼酸進行Suzuki偶聯生成化合物4a～4c。同時,分別通過3種靛紅衍生物5a～5c與N,N-二乙氨基氯乙烷鹽酸鹽之間的親核取代反應得到靛紅1-位接入親水基團的衍生物6a～6c;而化合物6a～6c與水合肼之間加成消去得到化合物7a～7c。最后,4a～4c分子中的醛基分別與7a～7c分子中的氨基通過先加成再消去反應生成目標產物8a～8i。

2.1 化合物6a～6c的合成

化合物6a～6c的制備參考文獻[23-24]的方法,以5-取代靛紅和N,N-二乙氨基氯乙烷鹽酸鹽為原料通過親核取代反應合成。分別對堿的種類、反應溶劑、反應溫度、反應時間進行優化,結果列于表1。結果表明:1)由實驗1、2可知,當其他條件一定,V氯仿∶V水=1∶1.8時,改變反應溫度與反應時間對產率的影響較小。2)由實驗3、4可知,當其他條件一定,V氯仿∶V水=1∶0.9時,室溫反應10 h,產率明顯提高。3)由實驗4、5可知,以NaH作堿、DMF作反應溶劑,后處理中會有大部分產物溶在DMF中,產率較低;而以K2CO3作堿、氯仿-水作溶劑,后處理用氯仿萃取,產率較高。

2.2 目標化合物8a～8i的合成及結構確定

目標化合物8a～8i參考文獻[25]的方法,以4-芳氨基-6-(5-甲?；秽?2-基)喹唑啉和(Z)-1-(二乙氨基乙基)-3-腙-5-取代吲哚啉-2-酮為原料,通過先親核加成再消去反應得到。選擇冰乙酸作為催化劑而不用鹽酸等強酸,是由于酸給出的氫離子不僅能夠和羰基結合,增加羰基的親電性,也能與氨基結合,使氨基喪失親核能力。冰乙酸為弱酸,其在使羰基親電性增加的同時,能夠避免胺類化合物過度質子化。選擇無水乙醇和DMF作為反應溶劑,后處理只需要旋蒸除去溶劑,用甲醇-四氫呋喃重結晶即可得到目標化合物。該方法操作簡單,處理方便。

圖3 化合物8b的1H NMR譜

2.3 抗腫瘤活性

以上市的抗腫瘤藥物拉帕替尼(Lapatinib)和吉非替尼(Gefitinib)為陽性對照,以SW480、A431、NCI-H1975和A549為受試細胞,用MTT法對合成的目標化合物8a～8i進行抗腫瘤活性測試,結果如表2所示?；衔?a、8b、8e、8g、8h對A431增殖具有明顯抑制作用,化合物8a、8b、8c、8d、8e、8g對A549和NCI-H1975增殖具有明顯抑制作用,化合物8a、8b、8c、8d、8e、8f、8g對SW480增殖具有明顯抑制作用。綜上所述,化合物8a、8b、8e、8g對4種受試細胞均表現出良好的增殖抑制作用,優于陽性對照拉帕替尼和吉非替尼。此外,當喹唑啉4-位引入3-乙炔基苯氨基時,抑制腫瘤細胞增殖的活性較好;引入3-氯-4-氟苯氨基和3-氯-4-(3-氟芐氧基)苯氨基時,抑制腫瘤細胞增殖的活性次之。靛紅5-位無取代基或被F取代時,抑制腫瘤細胞增殖的活性較好;被Cl取代時,抑制腫瘤細胞增殖的活性較差。

表2 目標化合物對4種受試腫瘤細胞的體外抑制活性(IC50)

根據合成化合物的結構及其抗腫瘤活性測試結果,分析出可能存在的構效關系:在喹唑啉4-位引入芳氨基能夠增強化合物對表皮生長因子受體HER-2的親和力,抑制表皮生長因子受體過度表達;且由于與酪氨酸激酶結合的ATP疏水性口袋空間比較大,即使在喹唑啉4-位引入如芳氨基這樣較大的基團,也能夠通過旋轉的方式深入親脂性口袋與激酶結合。此外,4-芳氨基C3、C4位的取代基與激酶表面非常相近,在4-芳氨基C3、C4位上引入—F、—Cl、—C≡CH這樣的小基團可能更有利于化合物與激酶結合[26]。在靛紅1-位引入親水基團N,N-二乙氨基乙基可以調節化合物的水溶性,且通過與前期實驗室抗腫瘤活性數據[21]的比較,證明引入親水基團可以提高化合物對腫瘤細胞增殖的抑制活性。綜上所述,喹唑啉母核上引入的芳氨基、靛紅結構單元和親水基團協同作用,能夠更大程度地發揮喹唑啉類化合物的抗腫瘤作用。

3 結論

本研究在保留上市藥物拉帕替尼、吉非替尼和埃羅替尼結構單元的基礎上,與具有抗腫瘤活性的靛紅結構單元雜合,同時引入親水基團,經5步反應合成了9個結構新穎的N-取代靛紅雜合喹唑啉類化合物。利用NMR、IR和HRMS對反應中間體及目標化合物的結構進行確定,同時以4種人腫瘤細胞為受試細胞,采用MTT法對合成的9個新化合物進行了體外抗腫瘤活性測試。結果表明,9個化合物均具有一定的腫瘤細胞增殖抑制活性。其中,化合物8a、8b、8e、8g對4種受試細胞均表現出較好的增殖抑制作用,優于陽性對照拉帕替尼和吉非替尼;其合成原料易得,步驟較為簡單,路線較為成熟,是具有開發潛力的抗腫瘤化合物。