外源誘導子和溫度對黑果枸杞懸浮細胞花青素積累的影響

曾海濤,仇瑩瑩,徐 皓,唐 琪,陳夢嬌,鄭 濤

(陜西理工大學 生物科學與工程學院,陜西省資源生物重點實驗室,秦巴生物資源與生態環境省部共建國家重點實驗室(培育),陜南秦巴山區生物資源綜合開發協同創新中心,陜西 漢中 723000)

黑果枸杞(Lyciumruthenicum)是茄科(Solanaceae)枸杞屬(LyciumL.)多年生灌木,多在干旱、鹽堿的荒漠與半荒漠地區以群落形式分布[1-2]。黑果枸杞是迄今為止發現的花青素含量最高的天然野生果實,其花青素含量是藍莓的18倍,可作為提取原花青素的理想植物資源,有野生“藍色妖姬”、植物界的“軟黃金”等美稱[3-4]?；ㄇ嗨鼐哂锌寡趸?、保護肝臟和抗癌的藥理作用,藥用價值很高;同時,因其穩定性好、著色性強,花青素含量常被用作評價植物產品質量的關鍵指標[5-6]。

與傳統的整株材料相比,植物細胞懸浮系具有分散性能好、細胞性狀及細胞團大小一致、生長重現性快、易于控制等優點,已成為植物生物技術中最有用的工具之一和植物細胞工程研究的熱點[7-9]。與直接從天然植物中提取或化學合成相比,通過植物細胞培養生產次生代謝產物具有無可比擬的優勢[10],但目前植物細胞培養商業化應用的例子還很少,重要原因之一是目標產物產量過低。為了解決這一問題,對植物懸浮細胞施加外源激素,誘導植物次生代謝產物合成的相關研究備受關注,特別是將調整外源激素誘導條件與優化培養基組分相結合的改良培養方法已被應用于植物懸浮細胞的工廠化生產[11-12]。

外源激素誘導已被廣泛用于葡萄[13]、三七[14]、紅花[15]、樟葉越桔[16]等植物的懸浮培養體系,并在促進細胞增殖或增加細胞活性成分積累等方面發揮重要調控作用。外源激素可用于調控花青素的合成和果實顏色發育,但不同外源激素對花青素合成的作用不同[17]。其中,脫落酸(abscisic acid,ABA)通過參與花青素的生物合成調控,直接影響花青素的積累并促進果實著色。外施1 g/L ABA能加速藍莓果實轉色、成熟和軟化,增加其可溶性固形物的積累,提高果實總花青素含量和抗氧化能力[18]。某些呼吸躍變型水果,如蘋果,其果實被噴施ABA(50、100、150 mg/L)后,基因組中的MYB1和bZIP44轉錄因子編碼基因的表達水平顯著上調,受其調控的下游結構基因表達量也隨之提升,果實氮積累減少的同時碳與糖積累增多,促進了花青素的合成[19]。蘋果果實的色澤發育與蔗糖、果糖含量正相關,尤其是組織內的蔗糖含量對花青素積累的影響最顯著,暗示了蔗糖分子可能參與細胞內花青素的合成。ABA可與蔗糖交互作用,顯著促進草莓果實中與花青素合成相關基因的表達,進而增加果實中花青素的積累[20]。有報道認為,17 ℃的低溫條件能誘導蘋果MdbHLH3表達,還能促進MdbHLH3的磷酸化修飾,進而增強該轉錄因子與MdMYB1、MdDFR、3MdUFGT等基因啟動子區域的結合能力,最終促進花青素的合成[21]。茉莉酸甲酯也對花青素的合成起正向調節作用,其處理橡膠樹體胚可以誘導花青素的合成積累,使樹體胚呈紅色[22]。

目前,關于黑果枸杞中花青素的研究已有較多報道,植物組織培養技術也已被廣泛用于藥用活性成分積累等研究。但黑果枸杞懸浮細胞體系的建立以及外源激素和溫度對黑果枸杞懸浮細胞中花青素積累的影響鮮有報道。本研究以黑果枸杞細胞培養作為模式體系,研究外源激素誘導子、低溫及二者的協同作用對黑果枸杞細胞生長和花青素積累的影響,以期為黑果枸杞懸浮細胞的培養和花青素積累提供參考。

1 材料與方法

1.1 黑果枸杞懸浮細胞培養體系的建立

供試材料源自寧夏農科院的黑果枸杞種子。取適量黑果枸杞種子置于50 mL離心管中,在超凈臺上消毒。加入15 mL無菌水,反復搖晃3 min,倒出無菌水加入15 mL 75%酒精,搖晃30 s,倒掉酒精,用無菌水清洗2次,再加入20 mL 10%次氯酸鈉震蕩搖晃10～15 min,無菌水清洗3次。

將配置的1 L WPM(woody plant medium)培養基平均分裝于20個培養瓶中,密封膜密封。121 ℃條件下高壓蒸汽滅菌18 min,冷卻。

在超凈臺中用槍頭吸取幾顆枸杞種子,點種到WPM培養基上,25 ℃、光(12 h)/暗(12 h)周期性照明條件下培養 25 d。

以黑果枸杞無菌苗的葉片為外植體,在附加0.5 mg/L激動素(KT)+2.0 mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)+20.0 g/L蔗糖+6.0 g/L瓊脂的培養基上誘導愈傷組織。每15～20 d收取白綠色、松脆的愈傷組織在相同培養基上進行繼代培養,將連續繼代3次以上的愈傷組織接種到裝有100 mL液體培養基的三角瓶中,置于恒溫振蕩搖床120 r/min、25 ℃條件下懸浮培養。

1.2 外源誘導劑的制備

用無菌水配制不同質量濃度的蔗糖溶液(6、12、18、20、30 g/L)和茉莉酸甲酯溶液(10、50、100、200、300 mg/L);ABA用少量無水乙醇溶解后,加適量去離子水定容,配置成不同質量濃度的ABA溶液(1、2、3、4、5 mg/L)。配置材料高溫滅菌后于4 ℃冰箱保存備用。

1.3 外源誘導劑的處理

1.3.1 蔗糖對懸浮細胞的誘導處理

將培養至第11天的細胞按照5%～10%的比例接種于含100 mL WPM液體培養基的三角瓶(250 mL)中,將5種質量濃度的蔗糖溶液分別添加到液體培養基中,以含有20 g/L蔗糖的WPM培養基作為對照組。每個處理設置3個重復,誘導培養7 d后取樣,測定細胞生物量(細胞鮮重、干重)及花青素含量。培養條件為:培養液的初始pH值為5.6～6.0,120 r/min、25 ℃恒溫搖床培養。

1.3.2 茉莉酸甲酯和ABA對懸浮細胞的誘導處理

將培養至第11天的細胞按照5%～10%的比例接種于含100 mL WPM液體培養基的三角瓶(250 mL)中,將5種質量濃度的茉莉酸甲酯溶液及5種質量濃度的ABA溶液經0.22 μm微孔濾膜過濾,按每瓶1.0 mL添加到培養基中作為誘導處理組,分別以添加1.0 mL無菌水、1.0 mL無水乙醇的培養基作為對照組。每個處理設置3個重復,誘導培養7 d后取樣,培養條件如1.3.1,測定細胞生物量及花青素含量。

1.3.3 溫度對懸浮細胞的誘導處理

將培養至第11天的懸浮細胞按照5%的比例接種于含100 mL WPM液體培養基的三角瓶(250 mL)中,置于搖床中。在溫度分別為16 ℃、25 ℃、40 ℃,培養液初始pH值為5.6～6.0,搖床轉速為120 r/min的條件下培養細胞,以25 ℃的懸浮細胞液作為對照組。每個處理設置3個重復,誘導培養7 d后取樣,測定細胞生物量以及花青素含量。

1.3.4 外源激素和溫度對懸浮細胞的復合處理

將培養至第11天的細胞按照5%～10%的比例接種于含100 mL WPM液體培養基的三角瓶(250 mL)中,低溫+蔗糖/茉莉酸甲酯/ABA作為誘導處理,以添加1.0 mL無菌水或1.0 mL無水乙醇的培養基作為對照組。每個處理設置3個重復,誘導培養7 d后取樣,測定細胞生物量及花青素含量。

1.4 細胞生物量的測定

細胞鮮重:將懸浮細胞搖勻后倒入抽濾瓶中進行抽濾,期間用超純水沖洗細胞,抽濾至濾紙不再滴水,此時的重量計為細胞鮮重[23]。

細胞干重:將抽濾后的細胞置于60 ℃ 烘箱中烘干24 h,稱重記為細胞干重。

1.5 花青素含量的測定

花青素含量的測定參考Zhang等[7]的方法。稱取鮮重0.15 g的黑果枸杞懸浮細胞,加入50%冰醋酸,旋轉振蕩搖勻后,黑暗條件浸提1 h。提取液在8 000 r/min條件下離心10 min,經0.22 μm微孔濾膜過濾后收集上清液,得到花青素提取液。取1 mL花青素提取液加入3 mL Mcllvaine緩沖液(14.7 g/L Na2HPO4·2H2O 和16.7 g/L無水檸檬酸,pH 3.0),在535 nm波長下測定吸光度,以V50%冰醋酸∶VMcllvaine緩沖液=1∶3的溶液作為空白對照,以色度值代表懸浮細胞的花青素相對含量?；ㄇ嗨叵鄬亢突ㄇ嗨叵鄬Ξa量按如下公式[24]進行計算:

花青素相對含量=0.1×吸光度×稀釋因子,

花青素相對產量=細胞鮮重×花青素相對含量。

式中稀釋因子為80。

1.6 pH值的測定

每隔3 d對黑果枸杞懸浮細胞的pH值進行測定。取5～10 mL培養物于試管,先用蒸餾水清洗電極,再用培養物清洗后,把電極浸入被測溶液中讀取pH值。3次重復測定取平均值。

1.7 數據處理與分析

用Excel 2010、Origin Pro Lab 2023軟件對數據進行整理和作圖,用SPSS 24.0對數據進行統計分析,采用Duncan法比較數據的組間差異,顯著性水平設定為P<0.05。

2 結果與分析

2.1 黑果枸杞愈傷組織的誘導情況

WPM培養基中添加 0.5 mg/L KT+2.0 mg/L 2,4-D+20.0 g/L蔗糖+5.0 g/L瓊脂對誘導黑果枸杞外植體愈傷組織的效果最佳,優化后的繼代愈傷組織誘導最佳培養基為WPM+0.5 mg/L KT+2.0 mg/L 2,4-D+0.1 mg/L萘乙酸(NAA)+20.0 g/L蔗糖+6.0 g/L瓊脂。在該培養條件下,愈傷組織具有旺盛的自我增殖能力,容易散碎且速度快,組織塊大。最初形成的愈傷組織為綠色,先端有紫色。愈傷組織從外植體上剝離后,在繼代培養基上每18～25 d 繼代1次。隨著繼代次數的增加,初代愈傷組織中的紫色逐漸消失。經過3次繼代后,可得到適于懸浮培養的黃綠色、蓬松愈傷組織,接種成活率為100%(圖1)。

圖1 黑果枸杞愈傷組織的誘導

2.2 黑果枸杞懸浮細胞體系的建立

在WPM液體培養基中添加 0.5 mg/L KT+2.0 mg/L 2,4-D+0.01 mg/L NAA+30 g/L蔗糖,該條件下黑果枸杞懸浮細胞的生長曲線呈“S”形,如圖2所示,可分為遲緩期(0～8 d)、對數生長期(8～18 d)和減速期(18～22 d)。在0～8 d期間,細胞生長緩慢,活細胞數量增加較慢;在8～18 d期間,細胞處于對數生長期,活細胞數量迅速增加;18 d后,活細胞數量減少,生長減緩?；罴毎麛盗吭趹腋∨囵B第18天時達到峰值,約為7.93×105個/mL。在后續繼代過程中,每50 mL接種量添加 2～5 g愈傷組織,可快速建立起生長穩定的懸浮細胞培養體系。為保持較高的細胞分裂能力和細胞活性,繼代培養最佳時間為18 d。

圖2 黑果枸杞懸浮細胞生長曲線

2.3 外源誘導子對黑果枸杞懸浮細胞中花青素積累的影響

2.3.1 外源誘導子對懸浮細胞生物量的影響

由圖3所示,不同種類和質量濃度的外源激素對黑果枸杞懸浮細胞生物量具有顯著影響。以含有20 g/L蔗糖的WPM培養基作為對照,6、12、30 g/L蔗糖處理的細胞鮮重分別為102.84±0.23 g、148.39±0.87 g、161.73±0.80 g,較對照組分別顯著降低45.96%、22.02%、15.01%(P<0.05);6、12、30 g/L蔗糖處理的細胞干重分別為2.34±0.14 g、3.38±0.31 g、3.68±0.09 g,較對照組分別顯著降低85.04%、28.23%、17.66%(P<0.05)?？梢?6、12、30 g/L蔗糖誘導能夠顯著抑制黑果枸杞懸浮細胞的生物量。經50、100、200 mg/L 茉莉酸甲酯處理后,懸浮細胞的鮮重分別為204.39±4.52 g、242.13±2.16 g、217.79±2.69 g,較對照組分別顯著升高了10.77%、31.22%、18.03%(P<0.05);懸浮細胞的干重分別為4.68±0.10 g、5.55±0.05 g、4.99±0.06 g,較對照組分別顯著升高了10.72%、31.21%、17.97%(P<0.05)。經1、2 mg/L ABA處理后,懸浮細胞的鮮重分別為235.83±1.77 g和316.46±1.94 g,與對照組相比分別顯著升高18.42%和58.91%(P<0.05);懸浮細胞干重分別為7.40±0.36 g和9.93±0.61 g,與對照組相比分別顯著升高18.38%和58.90%(P<0.05)。經3、4、5 mg/L ABA處理的細胞鮮重與對照組相比分別顯著降低28.68%、33.59%、45.80%(P<0.05),細胞干重與對照組相比分別顯著降低28.63%、33.62%、45.51%(P<0.05)。由此可見,1 mg/L和2 mg/L ABA處理能夠顯著增加黑果枸杞懸浮細胞的生物量,而高濃度ABA會抑制黑果枸杞懸浮細胞的生長。

圖3 不同質量濃度的誘導子對黑果枸杞懸浮細胞生物量的影響

2.3.2 外源誘導子對懸浮細胞花青素積累的影響

如圖4所示,不同質量濃度的外源誘導子對黑果枸杞懸浮細胞花青素含量的積累有顯著影響。在蔗糖處理組,30 g/L蔗糖處理效果最佳,懸浮細胞中花青素相對含量最高,為6.72±0.07,與20 g/L蔗糖組相比提升了53.35%。在茉莉酸甲酯處理組,100、200、300 mg/L 茉莉酸甲酯處理組的花青素相對含量較對照組分別提升14.85%、42.00%、16.47%(P<0.05),200 mg/L茉莉酸甲酯的誘導效果最優。在1 mg/L和2 mg/L ABA處理組,花青素相對含量分別為6.61±0.09和6.55±0.06,與對照組相比分別顯著升高64.02%和62.53%(P<0.05);而在3 mg/L、4 mg/L和5 mg/L ABA處理組,花青素相對含量與對照組相比分別顯著降低42.43%、40.45%和72.95%(P<0.05)?？梢?1 mg/L和2 mg/L ABA處理能夠顯著促進黑果枸杞懸浮細胞中的花青素積累。

圖4 不同外源誘導子對黑果枸杞懸浮細胞中花青素相對含量的影響

如圖5所示,不同外源誘導子對黑果枸杞懸浮細胞中花青素相對產量均具有顯著影響。在30 g/L蔗糖處理組,懸浮細胞的花青素相對產量為1 086.26±34.48,與對照組相比提高30.33%,可見30 g/L蔗糖添加能夠顯著提高黑果枸杞懸浮細胞的花青素產量。在50、100和200 mg/L茉莉酸甲酯處理組,花青素相對產量比對照組分別提升22.08%、50.71%和67.60%,其中,200 mg/L茉莉酸甲酯能顯著促進黑果枸杞懸浮細胞的花青素產量。在1 mg/L和2 mg/L ABA處理組,花青素相對產量分別為 1 558.86±22.24和2 072.84±14.93,與對照組相比分別顯著升高94.23% 和158.27%(P<0.05);而3 mg/L、4 mg/L和5 mg/L ABA處理組的花青素相對產量比對照組顯著降低58.94%、60.45%和582.21%(P<0.05)?？梢?1 mg/L和2 mg/L ABA更有利于黑果枸杞懸浮細胞中的花青素產量提升。

2.4 溫度對黑果枸杞懸浮細胞中花青素積累的影響

如圖6所示,在16 ℃和40 ℃處理組黑果枸杞懸浮細胞的鮮重分別為210.92±8.06 g和192.71±6.07 g,與對照組(25 ℃,207.05±14.36 g)相比分別降低3.03%和8.63%;兩組的細胞干重分別為4.19±0.16 g和3.95±0.10 g,與對照組相比分別降低5.20%和10.63%。實驗結果表明,16 ℃和40 ℃處理會抑制黑果枸杞懸浮細胞的生物量,但抑制效果不顯著。

圖6 溫度對黑果枸杞懸浮細胞生物量及花青素積累的影響

在16 ℃處理組,黑果枸杞懸浮細胞的花青素相對含量為5.15±0.26,較對照組(25 ℃,2.76±0.36)顯著提升86.59%(P<0.05);花青素相對產量為1 086.24±48.88,較對照組提升4.91%。在40 ℃處理組,黑果枸杞懸浮細胞的花青素相對含量為2.38±0.13,較對照組顯著下降15.96%(P<0.05);花青素相對產量較對照組下降55.70%。由此可見,16 ℃處理可顯著增加黑果枸杞懸浮細胞的花青素含量(P<0.05)。

2.5 低溫和外源激素復合處理對花青素積累的影響

復合誘導處理與單一誘導處理相比,具有效果強、產量高、底物選擇性強的特點,為通過植物細胞團培養生產次生代謝活性化合物提供了有效途徑。本研究利用篩選出的最優濃度外源激素(30 g/L蔗糖、200 mg/L茉莉酸甲酯、2 mg/L ABA)和16 ℃的溫度條件對黑果枸杞懸浮細胞進行復合處理,探索復合處理對細胞生物量和花青素積累的影響。

2.5.1 復合處理對懸浮細胞生物量的影響

如圖7所示,16 ℃單獨處理對黑果枸杞細胞生物量影響不顯著,16 ℃+30 g/L蔗糖、16 ℃+200 mg/L茉莉酸甲酯和16 ℃+2 mg/L ABA復合處理均會顯著抑制細胞生長,其中16 ℃+2 mg/L ABA對懸浮細胞的生物量抑制效果最明顯,細胞鮮重由對照組的217.24 g降至90.09 g,細胞干重由4.22 g降至1.75 g。

2.5.2 復合處理對花青素積累的影響

在16 ℃單獨處理組,黑果枸杞細胞的花青素相對含量由4.11增加至5.15,較對照組增加了25.30%;花青素相對產量則由892.86增加至1 086.43,較對照組增加21.68%。在16 ℃+200 mg/L茉莉酸甲酯復合處理組,花青素相對含量由4.11增加至 6.27,提高1.53倍(P<0.05);花青素相對產量由892.86增加至1 223.95,提高1.37倍(P<0.05)。此外,與對照組相比,16 ℃+30 g/L蔗糖復合處理組花青素產量提升3.87%,而16 ℃+2 mg/L ABA復合處理會顯著抑制懸浮細胞的花青素產量(圖7)。

3 討論

植物細胞培養技術已成為工業化生產天然產物的有效途徑之一,建立高效、穩定的懸浮細胞系是植物細胞大規模培養的前提[25]。用于建立懸浮細胞系的愈傷組織要有較好的松散性和再生能力,本實驗的研究結果表明,黑果枸杞的愈傷組織具有旺盛的自我增殖能力,容易散碎且速度快,易誘導培養出黃綠色、蓬松的愈傷組織,適合建立懸浮細胞系。

植物細胞培養過程中次生代謝產物的產率通常較低,這在很大程度上限制了植物細胞培養的產業化。目前,提高植物細胞培養中次生代謝產物產量的方法主要包括優化培養條件、添加前體和外源激素以及改進培養方法等。Hao等研究發現噴施外源ABA能顯著促進銀杏懸浮細胞花青素化合物的合成與積累[26]。在脹果甘草懸浮培養細胞中添加茉莉酸甲酯能顯著誘導甘草總黃酮的合成,其最大產量達到對照的3.39倍[27]。30 g/L的蔗糖能促進葡萄懸浮細胞中花青素積累,而7.5 g/L和15 g/L的蔗糖則抑制花青素的積累[28]。這些研究結果表明添加外源激素可以提高懸浮培養細胞中花青素的含量。本研究建立和優化了黑果枸杞懸浮培養細胞的培養條件,活細胞數量在懸浮培養第18天時達到峰值。30 g/L蔗糖、200 mg/L 茉莉酸甲酯、2 mg/L ABA單一處理均能顯著促進懸浮細胞花青素產量的提升,其中ABA的處理效果最佳,這與前人的研究結果一致,表明有望通過添加外源激素來提升黑果枸杞懸浮細胞中花青素的含量和產量。

此外,許多研究表明,2種或多種提高次生代謝產物產量的外源誘導子復合,在提高次生代謝產物產量方面具有協同或相加效應[29-31]。常志凱等發現在高溫脅迫1 d后再加入茉莉酸甲酯的復合處理對白樺細胞次生代謝產物總三萜合成的誘導作用最強,且三萜合成酶基因的相對表達量都不同程度的高于單獨高溫處理[32]。本研究探究低溫和外源激素復合作用對黑果枸杞懸浮細胞生產花青素的影響。不同外源激素對細胞中花青素積累均具有一定的促進作用,200 mg/L 茉莉酸甲酯、2 mg/L ABA處理能在提高黑果枸杞細胞生物量的同時促進花青素的積累,最高產量為對照的2.32倍。在16 ℃和3種外源激素的復合處理下,16 ℃和茉莉酸甲酯的復合處理能夠顯著促進懸浮細胞花青素的積累,單位鮮細胞花青素含量較對照提高1.53倍,花青素產量較對照提高1.37倍。實驗結果表明在植物細胞培養生產次生代謝產物的過程中,低溫和誘導子的聯合作用對次生代謝物產量的提高具有重要價值。

4 結論

本研究以黑果枸杞無菌苗的葉片為外植體誘導愈傷組織并建立細胞懸浮體系。愈傷組織誘導的最佳培養體系為WPM+0.5 mg/L激動素+2.0 mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸+20.0 g/L蔗糖+6.0 g/L瓊脂,懸浮細胞培養的最優體系為WPM+0.5 mg/L激動素+2.0 mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸+0.01 mg/L萘乙酸+20.0 g/L蔗糖;活細胞數量在第18 d時達到峰值,為7.93×105個/mL。在30 g/L蔗糖、200 mg/L茉莉酸甲酯、2 mg/L脫落酸及16 ℃單一處理下,黑果枸杞懸浮細胞的花青素含量均顯著增加,其中,2 mg/L脫落酸誘導效果最佳;在200 mg/L茉莉酸甲酯+16 ℃的復合誘導處理下,黑果枸杞懸浮細胞的花青素產量顯著增加。今后可通過優化黑果枸杞懸浮細胞的培養體系及添加外源激素進一步調控懸浮細胞花青素的積累,為利用懸浮細胞系等離體培養體系開發黑果枸杞植物資源奠定了基礎。