溫度和鹽度對長牡蠣“海大1號”二倍體和三倍體幼蟲生長與存活的影響*

張海寧, 徐成勛, 李 琪,2**

(1. 海水養殖教育部重點實驗室(中國海洋大學), 山東 青島 266003;2. 青島海洋科學與技術試點國家實驗室 海洋漁業科學與食物產出過程功能實驗室, 山東 青島 266237)

長牡蠣(Crassostreagigas)作為全球性重要的經濟貝類,具有生長速度快、抗逆性強、肉質鮮美、營養豐富等特點。長牡蠣“海大1號”是以生長速度和殼型為選育目標,通過群體選育培育出的新品種[1]。然而,長牡蠣“海大1號”與其他傳統養殖的二倍體牡蠣一樣,由于夏季繁殖期配子排放導致軟體部消瘦,無法供應市場。與二倍體牡蠣相比,三倍體牡蠣育性相對較差,在繁殖季節也能保持良好的肉質,彌補夏季二倍體牡蠣市場短缺,可以保障全年供應[2]。因此,開展長牡蠣“海大1號”三倍體苗種的規?；庇c產業化應用對推動牡蠣養殖產業的發展具有重要意義。

幼蟲培育是牡蠣苗種生產的重要環節,了解幼蟲對養殖環境的偏好對于最大限度地提高育苗場的產量至關重要,而環境條件在無脊椎動物幼蟲發育中起著至關重要的作用。通常情況下,在探究培育幼蟲適宜條件時,除食物的質量和數量,需要考慮溫度和鹽度的適應性[3-4]。溫度是影響貝類幼蟲生長和存活的重要環境因素,高溫會導致海洋貝類幼蟲大量死亡,而低溫則會導致大部分海洋貝類幼蟲生長緩慢[5-7]。鹽度影響幼蟲的生理反應,雙殼貝類的滲透壓調節功能受海水鹽度的影響,鹽度變化超過其自身調節能力是導致雙殼貝類死亡的重要原因之一[8-9]。有關溫度、鹽度對貝類生長發育的影響已有大量報道,闡明溫度和鹽度對長牡蠣(C.gigas)[6]、巖牡蠣(Crassostreanippona)[10]、櫛孔扇貝(Chlamysfarreri)[9]、菲律賓蛤仔(Ruditapesphilippinarum)[11]、鈍綴錦蛤(Tapesdorsatus)[12]幼蟲及稚貝生長發育的影響,可為優化貝類幼蟲培育條件提供基礎數據。研究幼蟲培育的最佳環境條件有助于提高幼蟲的生長和存活,縮短幼蟲培育周期的同時降低生產成本。本文研究了溫度與鹽度對長牡蠣“海大1號”二倍體和三倍體幼蟲生長和存活的影響,旨在為長牡蠣“海大1號”三倍體苗種規?；瘮U繁提供理論基礎和實踐經驗。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗在煙臺萊州利滔育苗場進行,所用親貝為1齡長牡蠣“海大1號”二倍體和四倍體,均取自山東榮成桑溝灣海區。挑選殼色性狀優良、殼型規則、外表無損傷的個體作為親貝,利用流式細胞儀(Beckman CytoFLEX)檢測親貝倍性。

1.2 實驗設計

實驗設計4個溫度梯度:20、25、30和35 ℃,海水鹽度設置為30;設置5個鹽度梯度:20、25、30、35和40,水溫設置為25 ℃。水溫通過冷水機或加熱器控制,使用水溫計測定水溫。低鹽海水通過向過濾海水中加入曝氣24 h的自來水配制,高鹽海水通過向過濾海水中加入海水晶配制,使用鹽度計(ATAGO)測量鹽度。采用解剖法獲得長牡蠣“海大1號”二倍體精卵和四倍體的精子。取長牡蠣“海大1號”二倍體卵子,260目篩絹過濾后,在砂濾海水中熟化1 h。二倍體和四倍體牡蠣的精子于授精前10 min擠出備用,授精時將卵液平均分為9份,并分別加入長牡蠣“海大1號”二倍體和四倍體的精子。每個實驗組設置3個重復。

1.3 日常管理

授精后放置于60 L聚乙烯桶中孵化。實驗過程中每天換水1次,換水量為總體積的1/3,隨著幼蟲的生長,逐漸增加換水量至1/2。餌料以等鞭金藻(Isochrysisgalban)為主,后期輔助投喂亞心形扁藻(Marinemicroalga)和小球藻(Chlorellavulgaris),每天投喂3次,投餌量根據幼蟲的攝食和水中殘餌情況確定。各實驗組投餌、換水、充氣等操作一致。

1.4 指標測定

幼蟲孵化后每4天取樣一次,每組隨機取30個幼蟲測量。采用五點取樣法取樣,即從每組內的5個不同位置取樣,每個位置取樣20 mL,共取樣100 mL幼蟲,用盧戈氏液固定,在顯微鏡下測量其殼高。同時測定幼蟲密度,每次測定后及時對密度進行均等校正,使各組保持一致,以消減密度效應的影響。根據初始密度、每次調整密度和測定的密度推算幼蟲存活率。受精率為受精后4 h卵裂數占總卵數的百分比,孵化率為受精24 h D形幼蟲占總受精卵數量的百分比,存活率為存活的幼蟲數占初始實驗幼蟲總數的百分比,變態率為變態的幼蟲數占附著基投放時實驗幼蟲總數的百分比。

1.5 數據分析

數據統計分析采用SPSS 24.0軟件處理,顯著性水平設為P<0.05。

2 結果

2.1 受精與孵化

2.1.1 不同溫度對長牡蠣“海大1號”二倍體和三倍體受精率與孵化率的影響 25 ℃實驗組和30 ℃實驗組的長牡蠣“海大1號”二倍體與三倍體的受精率與孵化率均顯著高于20 ℃實驗組和35 ℃實驗組(P<0.05),且溫度為25和30 ℃時二倍體組受精率顯著高于三倍體組(P<0.05)(見圖1)。溫度為25 ℃時,長牡蠣“海大1號”二倍體組與三倍體組的受精率最高,分別為92.67%±2.52%和85.33%±2.52%;溫度為35 ℃時受精率最低,分別為51.67%±2.52%和48.33%±4.16%,且顯著低于其他溫度組(P<0.05)。在相同溫度條件下,二倍體組孵化率高于三倍體組但差異不顯著(P>0.05),溫度為25 ℃時,長牡蠣“海大1號”二倍體組與三倍體組的孵化率最高,分別為81.67%±4.55%和76.41%±5.78%;溫度為35 ℃時孵化率最低,分別為28.80%±4.10%和25.27%±3.91%,且顯著低于其他溫度組(P<0.05)。

(同一指標具有相同字母表示組間差異不顯著(P>0.05),具有不同字母表示組間存在顯著差異(P<0.05)。 Same indicator with the same letter means that the difference between groups is not significant(P>0.05), and with different letters means that there is a significant difference between groups(P<0.05).)

2.1.2 不同鹽度對長牡蠣“海大1號”二倍體和三倍體受精率與孵化率的影響 鹽度為25、30和35時,長牡蠣“海大1號”二倍體組受精率顯著高于鹽度為20和40時(P<0.05);鹽度為25、30、35和40時,長牡蠣“海大1號”三倍體組受精率顯著高于鹽度為20時(P<0.05),鹽度為30和35時二倍體組受精率顯著高于三倍體組(P<0.05)(見圖2)。長牡蠣“海大1號”二倍體組與三倍體組在鹽度為30時的受精率最高,分別為92.67%±2.52%和85.33%±2.52%;鹽度為20時受精率最低,分別為58.00%±3.00%和59.00%±2.00%,且顯著低于其他鹽度(P<0.05)。

(同一指標具有相同字母表示組間差異不顯著(P>0.05),具有不同字母表示組間存在顯著差異(P<0.05)。 Same indicator with the same letter means that the difference between groups is not significant(P>0.05), and with different letters means that there is a significant difference between groups(P<0.05).)

鹽度為25、30和35時,長牡蠣“海大1號”二倍體組和三倍體組孵化率顯著高于鹽度為20和40時(P<0.05)。鹽度為20和35時二倍體組孵化率顯著高于三倍體組(P<0.05)。鹽度為30時“海大1號”二倍體組和三倍體組的孵化率最高,分別為81.67%±4.54%和73.08%±2.07%;鹽度為20時“海大1號”二倍體組和三倍體組孵化率最低,分別為55.46%±8.12%和46.27%±3.16%,且顯著低于其他鹽度組(P<0.05)。

2.2 溫度和鹽度對幼蟲生長的影響

2.2.1 不同溫度對長牡蠣“海大1號”二倍體和三倍體幼蟲生長的影響 各溫度水平下,長牡蠣“海大1號”三倍體幼蟲始終保持生長優勢,其殼高顯著高于二倍體幼蟲(P<0.05),且三倍體和二倍體幼蟲生長最快和最慢的溫度分別為30和20 ℃(見圖3)。當溫度為35 ℃時,第9天二倍體幼蟲全部死亡,第13天三倍體幼蟲全部死亡。第17天,溫度為30 ℃時,二倍體與三倍體幼蟲的殼高達到最大值,分別為(302.17±17.01) μm和(319.67±14.26) μm;而溫度為20 ℃時,二倍體與三倍體幼蟲的殼高最小,分別為(245.51±17.23) μm和(254.05±16.05) μm。

(表示差異顯著(P<0.05)。denotes significant difference(P< 0.05).)

2.2.2 不同鹽度對長牡蠣“海大1號”二倍體和三倍體幼蟲生長的影響 各鹽度水平下,長牡蠣“海大1號”三倍體幼蟲始終保持生長優勢,三倍體幼蟲的殼高顯著高于二倍體幼蟲(P<0.05),生長最快和最慢的鹽度分別為20和40,而鹽度25與30兩組之間無明顯差異(P>0.05)(見圖4)。第17天,二倍體和三倍體幼蟲的殼高均在鹽度20時達到最大值,分別為(271.66±20.43) μm和(320.49±19.83) μm;在鹽度40時出現最小值,分別為(213.46±18.26) μm和(223.51±27.78) μm。

(表示差異顯著(P<0.05)。denotes significant difference(P<0.05).)

2.3 溫度和鹽度對幼蟲存活率的影響

2.3.1 不同溫度對長牡蠣“海大1號”二倍體和三倍體幼蟲存活率的影響 各溫度水平下,長牡蠣“海大1號”三倍體幼蟲始終保持存活優勢,三倍體幼蟲的存活率顯著高于二倍體幼蟲(P<0.05)(見圖5)。當溫度為35 ℃時,第9天二倍體幼蟲全部死亡,第13天三倍體幼蟲全部死亡。第17天,二倍體在25 ℃時存活率最高為32.67%±4.04%,與在20 ℃時無顯著差異(P>0.05);三倍體幼蟲在25 ℃時存活率最高為52.00%±6.56%,與在20 ℃時無顯著差異(P>0.05)。

(表示差異顯著(P<0.05)。 denotes significant difference(P<0.05).)

2.3.2 不同鹽度對長牡蠣“海大1號”二倍體和三倍體幼蟲存活率的影響 長牡蠣“海大1號”二倍體幼蟲存活率在鹽度為25時最高,其次為鹽度20,鹽度40時存活率最低;三倍體幼蟲存活率在鹽度為30時最高,其次為鹽度25,同樣在鹽度40時存活率最低;鹽度為25時,長牡蠣“海大1號”三倍體幼蟲存活率高于二倍體幼蟲,但差異不顯著(P>0.05);鹽度為30、35和40時長牡蠣“海大1號”三倍體幼蟲存活率顯著高于二倍體幼蟲(P<0.05)(見圖6)。

(表示差異顯著(P<0.05)。 denotes significant difference(P<0.05).)

2.4 溫度和鹽度對幼蟲變態率的影響

2.4.1 不同溫度對長牡蠣“海大1號”二倍體和三倍體幼蟲變態率的影響 長牡蠣“海大1號”二倍體和三倍體在不同實驗溫度下的變態率如圖7所示。長牡蠣“海大1號”二倍體與三倍體幼蟲變態率在25 ℃時最高,在30 ℃時最低,不同溫度之間具有顯著性差異(P<0.05)。在相同溫度下,二倍體幼蟲與三倍體幼蟲的變態率無顯著性差異(P>0.05)。

(同一指標具有相同字母表示組間差異不顯著(P>0.05),具有不同字母表示組間存在顯著差異(P<0.05)。 Same indicator with the same letter means that the difference between groups is not significant(P>0.05), and with different letters means that there is a significant difference between groups(P<0.05).)

2.4.2 不同鹽度對長牡蠣“海大1號”二倍體和三倍體幼蟲變態率的影響 長牡蠣“海大1號”二倍體和三倍體幼蟲在不同實驗鹽度下的變態率如圖8所示。長牡蠣“海大1號”二倍體幼蟲和三倍體幼蟲變態率在鹽度為30時最高,在鹽度為40時最低。二倍體和三倍體幼蟲的變態率在鹽度為20、25、30和40時無顯著性差異(P>0.05),在鹽度為35時,三倍體幼蟲的變態率顯著高于二倍體幼蟲(P<0.05)。

(同一指標具有相同字母表示組間差異不顯著(P>0.05),具有不同字母表示組間存在顯著差異(P<0.05)。 Same indicator with the same letter means that the difference between groups is not significant(P>0.05), and with different letters means that there is a significant difference between groups(P<0.05).)

3 討論

3.1 溫度和鹽度對長牡蠣“海大1號”二倍體和三倍體受精率與孵化率的影響

在本研究中長牡蠣“海大1號”二倍體和三倍體的受精率與孵化率隨著溫度和鹽度的升高,呈先升高后降低的趨勢,這與Han等[13]在長牡蠣二倍體中的研究結果一致。在低溫條件下,受精率與孵化率較低可能與溫度影響受精卵內酶的活性有關,低溫對其正常分裂分化產生了不利影響[14]。水溫過高,會導致水中的致病微生物滋生,增加耗氧,這可能是影響受精卵孵化的原因之一[15]。溫度為25～30 ℃,鹽度為30～35時,“海大1號”二倍體組受精率顯著高于三倍體組,表明三倍體組受精卵可能存在一定的“受精卵不育”現象[16],Zhang等[17]研究葡萄牙牡蠣三倍體受精卵與二倍體受精卵的卵裂率時也報道了類似結果。在本研究中,長牡蠣“海大1號”二倍體在受精與孵化方面的表現優于三倍體。在受精和孵化階段,控制水溫在25～30 ℃之間,鹽度在25～35之間能減少兩者之間的差異,提高三倍體的受精率與孵化率。

3.2 溫度和鹽度對長牡蠣“海大1號”二倍體和三倍體幼蟲生長與存活的影響

貝類苗種培育成功的關鍵在很大程度上取決于其生命早期階段的表現,如胚胎和幼蟲階段。隨著溫度升高,“海大1號”二倍體與三倍體幼蟲的生長加快。這可能由于水溫升高使貝類的新陳代謝與攝食消化等能力提高,從而使得幼蟲具有更強的運動能力,生長更迅速[18]。值得注意的是,幼蟲密度沒有作為幼蟲生長速率條件實驗的一個因素進行檢查,幼蟲在高溫下生長最快可能是由溫度和幼蟲密度的綜合作用導致的。在溫度對幼蟲存活影響方面,三倍體幼蟲的存活率顯著高于二倍體幼蟲,這表明三倍體幼蟲的溫度耐受性高于二倍體幼蟲。高溫條件下幼蟲的高死亡率與之前報道的研究一致[13]。溫度升高到一定程度,可能會導致水中致病微生物的滋生以及貝類血細胞和酶活性降低,從而對貝類的生長發育以及存活產生不利影響。在本研究中,在幼蟲發育的整個階段相對于長牡蠣二倍體幼蟲“海大1號”三倍體幼蟲表現出明顯的生長優勢,這可能與基因雜合度增加使得其生長性能得到改良有關[19];長牡蠣“海大1號”三倍體與二倍體相比,染色體組增加可能帶來了劑量效應,即三倍體細胞內可能出現更多與生長相關的基因,使其生長速度加快。這在香港牡蠣(Crassostreahongkongensis)[20]、美洲牡蠣(Crassostreavirginica)[21-22]及扇貝(Argopectenventricosus)[23]等多種雙殼貝類中已經證實。在本研究中,三倍體幼蟲表現出快速生長特性,其有助于在苗種培育階段縮短育苗周期從而降低養殖成本。

鹽度是影響貝類幼蟲環境適應能力的另一個重要的非生物因素,對幼蟲的生長和存活具有較大影響。迄今為止,已經進行了許多關于鹽度對軟體動物生產性能影響的研究[24-25]。在同等環境下,不同物種有不同的適宜鹽度范圍。在我們的研究中,鹽度對生長和存活的影響是顯著的,長牡蠣“海大1號”二倍體與三倍體幼蟲存活率隨著鹽度的升高呈先升高再下降的趨勢;幼蟲的生長速度隨著鹽度的升高呈下降趨勢。在以前對長牡蠣“海大1號”二倍體幼蟲的研究中也發現了類似結果[26]。大量研究表明,鹽度變化會對海洋貝類滲透壓調節產生影響,進而影響個體的生長發育[27-29]。在本研究中高鹽條件下生長速度降低,這可能是由于幼蟲需要消耗大量的能量來進行滲透壓調節,進而導致生長速度減緩。在高鹽條件下,長牡蠣“海大1號”三倍體幼蟲相對于二倍體幼蟲表現出明顯的存活優勢,這可能是由于多倍體的染色體增加,從而進化出了新的功能,使潛在的生態位擴張或對環境變化反應的可塑性增強[30-31]。長牡蠣“海大1號”三倍體幼蟲表現出得對溫度和鹽度的高耐受力,這可能與染色體組增加所引起的環境適應性增強有關。

3.3 溫度和鹽度對長牡蠣“海大1號”二倍體和三倍體幼蟲變態率的影響

在本研究中,長牡蠣“海大1號”三倍體幼蟲相對于二倍體幼蟲具有生長快、變態時間短的特點。在溫度實驗中,長牡蠣“海大1號”三倍體幼蟲與二倍體幼蟲的變態率沒有表現出明顯的差異;而在鹽度實驗中,在高鹽條件下長牡蠣“海大1號”三倍體幼蟲相對于二倍體幼蟲表現出顯著的變態優勢?？傮w來看,長牡蠣“海大1號”三倍體幼蟲與二倍體幼蟲的變態率差異不顯著,這說明三倍體幼蟲可以正常附著,變態形成稚貝。這與在長牡蠣、美洲牡蠣、香港牡蠣中的研究結果一致[22,32-36]。在本研究中,長牡蠣“海大1號”二倍體與三倍體幼蟲的變態率受溫度與鹽度的影響較大,在生產過程中控制溫度在25 ℃左右,鹽度在25～35之間能夠有效提高幼蟲的變態率。

4 結語

為了探究長牡蠣“海大1號”三倍體幼蟲對主要環境因子的適應能力,比較研究了溫度和鹽度對二倍體和三倍體幼蟲生長和存活的影響。研究顯示,長牡蠣“海大1號”三倍體幼蟲培育的適宜鹽度為20～30,適宜溫度為20～25 ℃。相對于長牡蠣二倍體 “海大1號”三倍體在幼蟲階段具有生長快、變態時間短的特點,對溫度和鹽度具有更高的耐受能力。長牡蠣“海大1號”三倍體在幼蟲階段表現出的優勢有助于提高在牡蠣苗種生產中的效率。