西達本胺聯合PD-1抑制劑對結直腸癌小鼠CD8+ T細胞抗腫瘤功能的影響

董亮，李祥，高志濤,3，賈慧婕，趙鐵鎖*

1新鄉醫學院基礎醫學院免疫學系，河南新鄉 453003；2解放軍總醫院第一醫學中心生物治療科，北京 100853；3新鄉醫學院檢驗學院，河南新鄉 453003

結直腸癌是威脅人類健康的惡性腫瘤之一。統計顯示，2022年中國預計新發癌癥病例4 796 996例，其中結直腸癌占12.3%，居第2位[1‐2]，其帶來的健康威脅日趨嚴重。隨著腫瘤免疫治療的興起，以程序性死亡受體‐1(programmed death receptor‐1，PD‐1)及其配體(programmed cell death ligand 1，PD‐L1)為代表的 免 疫 檢 查 點 抑 制 劑(immune checkpoint inhibitors，ICIs)在臨床廣泛應用[3‐4]，可恢復效應T 細胞的活性，增強抗腫瘤免疫應答反應，在多種惡性腫瘤的研究和治療中取得了重大進展[5‐8]。然而研究顯示，PD‐1 抑制劑在實體瘤中的應答率僅為10%～30%，對大多數癌癥仍然無效[9‐10]。因此，采用合理的聯合治療策略優化結直腸癌ICIs 的治療效果是臨床和科研工作者亟待解決的問題。表觀遺傳改變在結直腸癌的發生發展中起著關鍵作用，DNA甲基化、組蛋白修飾及非編碼RNA調節等是表觀遺傳修飾的主要方式[11‐15]。組蛋白乙?；c組蛋白去乙?；^程由組蛋白乙?；D移酶(histone acetyltransferase，HAT)和組蛋白去乙?；?histone deacetylase，HDAC)共同調控并處于動態平衡，而腫瘤細胞中HDACs的活性異常增強或HAT表達降低，導致組蛋白去乙?；饔卯惓?，抑癌基因的轉錄表達受到抑制，從而誘發或促進了腫瘤的生長。HDAC 抑制劑可提高染色質組蛋白的乙?；?，調控腫瘤細胞相關基因的表達，抑制腫瘤細胞增殖、誘導其凋亡等[12,16‐17]。除直接抗腫瘤作用外，HDAC 抑制劑還可作為免疫調節劑發揮抗腫瘤效應。研究顯示，HDAC‐6 去乙?；纱龠MT 細胞耗竭并抑制PD‐1 抑制劑介導的T 細胞效應功能，而乙?；瘎t可增強PD‐1 抑制劑介導的T細胞效應功能[18]。西達本胺作為我國自主研發的苯甲酰胺類HDAC 抑制劑，已被批準用于治療復發難治的外周T 細胞淋巴瘤，具有較好的耐受性、安全性，對多種惡性腫瘤均具有顯著療效[19]。既往研究發現，Ⅰ類HDAC 抑制劑恩替諾特(MS‐275)可促進CD8+T細胞的增殖和殺傷活性，增強其對腫瘤細胞的識別能力，抑制腫瘤細胞增殖[20]。由此推測，西達本胺聯合PD‐1 抑制劑治療腫瘤可能具有協同作用。為此，本研究通過結直腸癌小鼠移植瘤模型及體外細胞實驗，探討了西達本胺聯合PD‐1抑制劑對CD8+T細胞抗腫瘤功能的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器 RMPI 1640培養基、PBS緩沖液、0.25%胰酶、FBS胎牛血清(美國Gibco公司)；流式 細 胞 術anti‐CD45‐BV510、anti‐CD3‐PerCP、anti‐CD8α ‐FITC、 anti‐IFN‐ γ ‐PE、 anti‐CD11b‐BV421、anti‐F4/80‐AF‐488、anti‐Gr1‐DZ594、anti‐CD25‐PC7、anti‐CD4‐APC、anti‐FOX‐p3‐PC5.5、anti‐CD107a‐APC、anti‐Ki‐67‐FITC 抗體及5(6)‐羧基二乙酸熒光素N‐琥珀酰亞胺酯(CSFE) (美國BioLegend 公司)；T‐Select H‐2Kb OVA Tetramer‐SIINFEKL‐APC(日本MBL 公司)；Cell Stimulation Cocktail(美國Ebioscience 公司)；小鼠腫瘤組織解離試劑盒、小鼠Naive CD8+T 細胞分選試劑盒(德國美天旎公司)；Annexin V：FITC Apoptosis Detection Kit(美 國BD 公 司)；西 達 本 胺(美 國MedChemExpress 公司)；anti‐PD‐1(美國Bio‐X‐Cell 公司)。Beckman‐DxFLEX 流 式 細 胞 儀(美 國Beckman公司)。

1.2 實驗動物及細胞 雄性C57BL/6 小鼠80 只，5周齡，體重20 g，購自北京斯貝福實驗動物技術有限公司[動物合格證編號：SCXK(京)2019‐0010]；OT‐1 轉 基 因 小 鼠(C57BL/6‐Tg[TcraTcrb]1100Mjb/J)10只，5周齡，由清華大學藥學院張永輝教授惠贈。MC38‐OVA結腸癌細胞株[表達卵清蛋白(OVA)]由解放軍總醫院第一醫學中心生物治療科實驗室保存。

1.3 動物實驗

1.3.1 小鼠結直腸癌移植瘤模型的建立 將MC38‐OVA結腸癌細胞接種于C57BL/6小鼠背部皮下(接種量2×105個/只)，接種體積為100 μl。將MC38‐OVA荷瘤小鼠隨機分為對照組、西達本胺組、anti‐PD‐1組與西達本胺+anti‐PD‐1組，每組20只，荷瘤第5天開始給藥。西達本胺組灌胃給予西達本胺10 mg/kg[西達本胺懸浮于0.5%羧甲基纖維素鈉(CMC‐Na)中]，100 μl/只，連續給藥3 d，間隔2 d，共3 次；anti‐PD‐1 組腹腔注射anti‐PD‐1，200 μg/只，第10 天開始給藥，每周2 次，共4 次；西達本胺+anti‐PD‐1組灌胃給予西達本胺10 mg/kg(100 μl/只，連續給藥3 d，間 隔2 d，共3 次)，并 腹 腔 注 射anti‐PD‐1(200 μg/只，第10 天開始給藥，每周2 次，共4 次)。對照組給予安慰劑(0.5%羧甲基纖維素鈉，PBS)治療。給藥方式見圖1。本研究通過解放軍總醫院動物福利倫理委員會審查(2018‐X14‐81)，實驗過程符合國家和單位有關實驗動物的管理和使用規定。

圖1 小鼠給藥模式圖Fig.1 Schedule of mouse treatments

1.3.2 腫瘤生長情況觀察 每天觀察荷瘤小鼠腫瘤生長情況，當小鼠腫瘤最長徑≥20 mm，減重超過總體重15%時，脫頸處死，計算腫瘤體積。腫瘤體積(mm3)=長度(mm)×寬度(mm)2/2。

1.3.3 生存分析 各組取10 只小鼠，觀察生存期，觀察終點為荷瘤后第50天。每天隨時觀察，記錄小鼠死亡時間(以天為單位)。計算各組小鼠存活率。

1.3.4 腫瘤組織解離及檢測 荷瘤第22天取各組小鼠腫瘤組織，使用小鼠腫瘤組織解離試劑盒制備單細 胞 懸 液，加 入Cell Stimulation Cocktail 于 孵 箱(37 ℃、5% CO2)中 處 理4～6 h，加 入anti‐CD45‐BV510、anti‐CD3‐PerCP、anti‐CD8α‐FITC、anti‐IFN‐γ‐PE、T‐Select H‐2Kb OVA Tetramer‐SIINFEKL‐APC、anti‐CD11b‐BV421、anti‐F4/80‐AF‐488、anti‐Gr1‐DZ594、anti‐CD25‐PC7、anti‐CD4‐APC、anti‐FOX‐p3‐PC5.5 抗體標記后，采用流式細胞儀檢測CD8+T 細胞(CD45+CD3+CD8+)、調節性T細胞(Treg，CD45+CD4+CD25+FOX‐p3+)、 髓 系 衍 生 抑 制 細 胞(MDSC，CD45+CD11b+Gr1+)、腫瘤相關巨噬細胞(TAM，CD45+CD11b+F4/80+)的比例及功能。

1.4 細胞實驗

1.4.1 CD8+T 細胞的分離與培養 采用小鼠Naive CD8+T 細胞分選試劑盒分離OT‐1 轉基因小鼠脾臟CD8+T 細胞并計數，以RMPI 1640 培養基(含10%FBS、100 U/ml 青 霉 素 與100 μg/ml 鏈 霉 素)按 照3×106個/孔重懸后，鋪于anti‐CD3ε抗體(10 μg/ml)與CD28 抗體(10 μg/ml)包被的24 孔板中，加入小鼠重組白細胞介素‐2(rIL‐2，500 U/ml)進行擴增培養。

1.4.2 流式細胞儀檢測CD8+T 細胞及MC38‐OVA 結腸癌細胞凋亡情況 CD8+T 細胞或MC38‐OVA 結腸癌細胞經0、10、25、50、100、200 nmol/L西達本胺處理48 h(5% CO2、37 ℃)后，1500 r/min 離心5 min，PBS洗滌2次；加入100 μl結合緩沖液重懸細胞，避光加入5 μl Annexin‐V‐FITC 和7‐ADD‐PE，室溫避光孵育15 min；加入400 μl結合緩沖液重懸，采用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

1.4.3 細胞計數法及Ki‐67 抗體標記法流式檢測CD8+T細胞和MC38‐OVA結腸癌細胞凋亡情況CD8+T 細胞和MC38‐OVA 結腸癌細胞經0、10、25、50、100、200 nmol/L 西 達 本 胺 處 理24、48、72、96 h 時，采用細胞計數法及Ki‐67 抗體標記法流式檢測CD8+T細胞和MC38‐OVA細胞的增殖情況。

1.4.4 流式細胞儀檢測CD8+T 細胞對MC38‐OVA 結腸癌細胞的殺傷能力 CD8+T細胞經0、100 nmol/L西達本胺處理48 h 后，加入25 μg/ml anti‐PD‐1，與CSFE標記的腫瘤細胞按預定效靶比于96孔板中共培養24 h。設置對照組、西達本胺組、anti‐PD‐1 組與西達本胺+anti‐PD‐1 組，效靶比為CD8+T 細胞(E：效應細胞)∶MC38‐OVA(T：靶細胞) (E∶T=5∶1、2∶1、1∶1、1∶2)，并設置單獨的MC38‐OVA結腸癌細胞為背景組。共培養24 h 后，采用流式細胞儀檢測殺傷能力(處理方式如圖2)。OT‐1小鼠T細胞殺傷率(%)=[1－實驗組活細胞數量(CSFE+)/背景組活細胞數量(CSFE+)]×100%。

圖2 OT‐1小鼠CD8+ T細胞體外活化及MC38‐OVA細胞共培養模式圖Fig.2 Treatment schedule for in vitro activation of OT‐1 mice CD8+ T cells with MC38‐OVA cells as indicated

1.4.5 流式細胞儀檢測CD8+T 細胞中CD107a 的表達 CD8+T 細胞(E：效應細胞)經0、100 nmol/L 西達 本 胺 處 理48 h 后，取 相 同 數 量 的CD8+T 細 胞、MC38‐OVA 腫瘤細胞(T：靶細胞)(E∶T=1∶1)于96 孔板中，加入3 μl anti‐CD107a 抗體孵育30 min，隨后加入高爾基體阻斷劑共培養4～6 h，采用流式細胞儀檢測CD107a的表達情況。

1.5 統計學處理 采用SPSS 22.0 軟件進行統計分析，GraphPad Prism 5.0軟件作圖。計量資料以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD‐t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組荷瘤小鼠腫瘤生長情況 MC38‐OVA 荷瘤小鼠腫瘤生長曲線顯示，與對照組、西達本胺組、anti‐PD‐1組比較，西達本胺+anti‐PD‐1組腫瘤生長明顯延緩，荷瘤第22 天腫瘤體積減小(P＜0.05)，但西達本胺組、anti‐PD‐1 組與對照組荷瘤第22 天腫瘤體積差異無統計學意義(P＞0.05，圖3)。

圖3 各組MC38‐OVA荷瘤小鼠腫瘤生長情況Fig.3 Tumor growth of MC38‐OVA tumor‐bearing mice in each group

2.2 各組MC38‐OVA 荷瘤小鼠生存分析 生存分析結果顯示，對照組荷瘤小鼠第17 天開始出現死亡，西達本胺+anti‐PD‐1 組第28 天開始出現死亡；對照組、西達本胺組、anti‐PD‐1 組、西達本胺+anti‐PD‐1組50 d 存活率分別為0、20%、30%、50%；與對照組、西達本胺組、anti‐PD‐1 組比較，西達本胺+anti‐PD‐1組荷瘤小鼠存活率最高；西達本胺+anti‐PD‐1組與對照組存活率差異有統計學意義(P＜0.01，圖4)。

圖4 各組MC38‐OVA荷瘤小鼠生存曲線(n=10)Fig.4 Survival curves of MC38‐OVA tumor‐bearing mice in each group (n=10)

2.3 各組MC38‐OVA荷瘤小鼠CD8+T、Treg、MDSC、TAM細胞檢測結果 流式細胞儀檢測結果顯示，西達本胺組、anti‐PD‐1組、西達本胺+anti‐PD‐1組腫瘤浸潤CD3+CD8+T 細胞比例較對照組明顯增高(分別為30.15%±2.12%、 34.33%±1.22%、 35.64%±1.51%vs.18.26%±1.56%，P＜0.05)，每1×106個細胞中CD8+T細胞數量較對照組明顯增加[(29 119±3902)個、(31 363±3312) 個、 (33 661±2012) 個vs.(21 495±3139) 個，P＜0.05]；西達本胺+anti‐PD‐1 組腫瘤浸潤CD3+CD8+T 細胞比例及CD8+T 細胞數量與西達本胺組、anti‐PD‐1組比較差異無統計學意義(P＞0.05)(圖5A、B)。

圖5 各組MC38‐OVA荷瘤小鼠CD8+ T、Treg、MDSC、TAM細胞檢測結果(n=3)Fig.5 Expression of CD8+ T, Treg, MDSC and TAM in MC38‐OVA tumor‐bearing mice in each group (n=3)

與對照組比較，西達本胺組、anti‐PD‐1 組、西達本胺+anti‐PD‐1組荷瘤小鼠腫瘤組織中免疫抑制相關細胞Treg、MDSC、TAM 的比例差異無統計學意義(P＞0.05，圖5C)。

與對照組比較，西達本胺組、anti‐PD‐1 組、西達本胺+anti‐PD‐1組CD8+IFN‐γ+T細胞比例及數量均增加(P＜0.05)，西達本胺+anti‐PD‐1 組CD8+IFN‐γ+T細胞比例及數量均明顯高于西達本胺組、anti‐PD‐1組(P＜0.05，圖6)。

圖6 各組荷瘤小鼠腫瘤浸潤CD8+ T細胞IFN‐γ檢測結果(n=3)Fig.6 IFN‐γ of tumor infiltrating CD8+ T cells of tumor‐bearing mice in each group (n=3)

與對照組比較，西達本胺組、anti‐PD‐1 組、西達本胺+anti‐PD‐1 組OVA 抗原特異性CD8+Tetramer+T細胞比例及數量均明顯增加(P＜0.001)，西達本胺+anti‐PD‐1 組OVA 抗原特異性CD8+Tetramer+T 細胞比例及數量均明顯高于西達本胺組、anti‐PD‐1 組(P＜0.001，圖7)。

2.4 西達本胺對CD8+T細胞活力及功能影響的體外實驗

2.4.1 西達本胺對CD8+T 細胞及MC38‐OVA 細胞增殖及凋亡的影響 流式細胞儀檢測結果顯示，0、10、25、50、100、200 nmol/L 組CD8+T 細胞凋亡率分別 為5.66%±0.23%、5.53%±0.31%、5.80%±0.27%、5.76%±0.31%、 5.76%±0.48%、 6.46%±0.24%， 與0、10 nmol/L 組比較，200 nmol/L 組CD8+T 細胞凋亡率明顯增高(P＜0.05，圖8A)。為了避免西達本胺對CD8+T 細胞活力的影響，選擇100 nmol/L 西達本胺進行后續實驗。

圖8 西達本胺對CD8+ T細胞及MC38‐OVA細胞體外增殖及凋亡的影響(n=3)Fig.8 Effect of chidamide to proliferation and apoptosis of CD8+T cells and MC38‐OVA cells in vitro (n=3)

細胞計數法及Ki‐67抗體標記法流式檢測CD8+T細胞的增殖情況，結果顯示，與0 nmol/L 組相比，100 nmol/L西達本胺組CD8+T細胞數量及Ki‐67的表達在共培養24、48、72、96 h 差異均無統計學意義(P＞0.05，圖8A)。

流 式 細 胞 儀 檢 測0、 10、 25、 50、 100、200 nmol/L 西達本胺對MC38‐OVA 細胞凋亡的影響，結果顯示，各組細胞凋亡率差異均無統計學意義(P＞0.05，圖8B)。細胞計數法及Ki‐67抗體標記法流式檢測MC38‐OVA細胞的增殖情況，結果顯示，0 nmol/L組與100 nmol/L 西達本胺組MC38‐OVA 細胞數量及Ki‐67 的表達在共培養24、48、72、96 h 差異均無統計學意義(P＞0.05，圖8B)。

2.4.2 西達本胺聯合PD‐1抑制劑對CD8+T細胞殺傷功能的影響 流式細胞儀檢測西達本胺對CD8+T細胞中CD107a表達的影響，結果顯示，與0 nmol/L 組比較，100 nmol/L西達本胺組CD8+T細胞的CD107a+表 達 率 明 顯 增 高[19.04%±0.24%vs.14.64%±0.353%，P＜0.05，圖9A)。

圖9 西達本胺聯合PD‐1抑制劑對CD8+ T細胞體外殺傷功能的影響(n=3)Fig.9 Effect of chidamide combined PD‐1 inhibitor with on CD8+ T cells function in vitro (n=3)

流式細胞儀檢測西達本胺聯合PD‐1 抑制劑對CD8+T細胞殺傷能力的影響，結果顯示，與對照組比較，西達本胺組、anti‐PD‐1 組、西達本胺+anti‐PD‐1 組在E∶T=1∶1、1∶2 條件下殺傷效果明顯增加(P＜0.05)；西 達 本 胺+anti‐PD‐1 組 較 西 達 本 胺 組、anti‐PD‐1 組殺傷率進一步增高[E∶T=1∶1：53.31%±1.93%vs.52.46%±2.04%vs.48.60%±1.12%，P＜0.05；E∶T=1∶2：44.21%±1.26%vs.41.21%±2.82%vs.37.68%±1.78%；P＜0.05，圖9B]。表明西達本胺可增加CD8+T 細胞CD107a的表達，西達本胺聯合PD‐1抑制劑對腫瘤細胞的殺傷能力具有協同作用。

3 討 論

免疫檢查點是一系列調控免疫激活程度的信號分子，包括PD‐1、PD‐L1、細胞毒性T淋巴細胞相關蛋 白4(cytotoxic T‐lymphocyte associated protein 4，CTLA‐4)、淋巴細胞活化基因3(lymphocyte activation gene 3， LAG‐3)、 T 細 胞 免 疫 球 蛋 白3(T cell immunoglobulin 3，TIM‐3)等。作為CD28家族中的抑制性受體，PD‐1與位于抗原呈遞細胞表面的配體結合后，可抑制T 細胞的激活，起到免疫“剎車”的作用。然而，腫瘤細胞可利用這一機制，在其表面表達PD‐L1，抑制T 細胞的功能，從而實現免疫逃逸。PD‐1/PD‐L1 抑制劑則可通過結合抑制PD‐1 或PD‐L1而抑制該通路，解除對T細胞的抑制，激活免疫系統，進而發揮抗腫瘤作用。盡管以PD‐1抑制劑為代表的免疫療法取得了矚目的治療效果，但原發性與繼發性抵抗仍是為PD‐1抑制劑等免疫療法的巨大阻礙[21‐22]。研究發現，諸多因素可導致腫瘤對PD‐1 抑制劑的原發性與繼發性抵抗，包括PD‐L1 表達、T 細胞耗竭、浸潤T 淋巴細胞減少、腫瘤突變負荷、介導免疫的關鍵信號通路受損(如IFN‐γ 信號通路)、腫瘤介導免疫抑制和耐藥基因表達、腫瘤表觀遺傳特征異常(如DNA 甲基化、組蛋白調節、核小體重塑、非編碼RNA表達異常等)、腸道微生物菌群以及代謝水平(如膽固醇代謝、鞘糖脂代謝)改變等[23]。有研究發現，聯合療法是克服PD‐1抑制劑抵抗、提高PD‐1抑制劑反應性的重要策略，通過聯合化療、靶向藥物、表觀遺傳藥物、細胞因子(如IL‐2)，以及其他ICIs 可克服PD‐1 抑制劑治療抵抗，從而增強治療效果[24‐25]。本研究結果顯示，HDAC抑制劑西達本胺聯合PD‐1抑制劑能夠明顯增加小鼠結直腸癌模型中腫瘤浸潤CD8+T 細胞及抗原特異CD8+T 細胞的數量，并提高CD8+T 細胞中IFN‐γ 的表達，從而抑制腫瘤細胞增長。生存分析發現，西達本胺+anti‐PD‐1組與西達本胺組、anti‐PD‐1組小鼠的存活率無明顯差異，即使西達本胺+anti‐PD‐1組較西達本胺組、anti‐PD‐1 組CD8+T 細胞浸潤及抑制腫瘤生長的效果強。分析原因可能與觀察時間過短有關，因此后續實驗可延長觀察時間，完善西達本胺聯合PD‐1抑制劑在小鼠結直腸癌中的相關研究。

表觀遺傳基因調控異常是癌癥的重要標志。腫瘤抑制基因或生長調節基因啟動子區域低乙?；透呒谆率够虺聊?，導致腫瘤生長失控。組蛋白乙?；癄顟B是調控基因轉錄的關鍵因素，HDAC作為表觀藥物靶點，有可能重新激活沉默的基因。HDAC 抑制劑(如羅米地辛、伏瑞斯特、帕比斯他等)作為抗腫瘤藥物已被廣泛應用，其作用主要體現在抑制腫瘤細胞增殖、誘導腫瘤細胞凋亡、恢復耐藥細胞對放化療藥物的敏感性等方面[26‐27]。西達本胺是我國自主研發合成的首個泛HDAC口服抑制劑，通過提高組蛋白乙?；揭l染色質重塑，重新激活腫瘤細胞中由于組蛋白去乙?；惓６磉_受阻的基因，誘導腫瘤細胞凋亡[28]。本研究結果顯示，0、10、25、50、100 nmol/L 西達本胺對MC38‐OVA結腸癌細胞和CD8+T 細胞凋亡無明顯影響，而200 nmol/L 西達本胺對MC38‐OVA 結腸癌細胞凋亡無影響，但可影響CD8+T 細胞的凋亡。隨后采用100 nmol/L 西達本胺處理CD8+T 細胞與腫瘤細胞，結果發現西達本胺處理后CD8+T 細胞對MC38‐OVA結腸癌細胞的殺傷作用明顯增強，CD107a的表達明顯增加，進一步證實了西達本胺可增強CD8+T細胞的抗腫瘤功能，且與PD‐1抑制劑聯合使用時可起到協同作用，發揮更顯著的抗瘤活性。

既往研究發現，表觀遺傳藥物HDAC 抑制劑可誘導腫瘤微環境中NK 細胞和CD8+T 細胞的數量和功能增強[29]，同時可增加腫瘤相關抗原的表達，活化免疫相關通路，導致T 淋巴細胞的抗腫瘤反應增強。近年來關于免疫療法聯合表觀藥物治療已開展了大量基礎研究及臨床試驗，并取得了較好的結果[14]。本研究結果顯示，單純使用西達本胺即可增加CD8+T細胞中IFN‐γ的表達，而聯合PD‐1抑制劑可進一步增加CD8+T 細胞中IFN‐γ 的表達。體外實驗證實，100 nmol/L 西達本胺可誘導CD8+T 細胞的殺傷能力增強，但不影響T 細胞及腫瘤細胞的凋亡和增殖；而anti‐PD‐1在體外雖然增強了CD8+T細胞對腫瘤細胞的殺傷能力，但不如西達本胺效果顯著，可能是由于體外不能模擬腫瘤微環境中T 細胞的耗竭狀態。

本研究存在一定局限性。首先，不同腫瘤細胞系間存在較大的異質性，對藥物的敏感性有所不同，本研究只采用了一種細胞進行實驗，西達本胺聯合PD‐1抑制劑的治療效果是否具有普遍性仍需進一步探討；其次，未能在體外實驗中對西達本胺增強CD8+T細胞殺傷功能的作用機制進行深入研究，后續可進一步探索西達本胺增強T 細胞功能的作用機制，為表觀藥物增效免疫治療的策略提供依據。

綜上所述，本研究結果顯示，西達本胺聯合PD‐1抑制劑可協同作用于結直腸癌模型中CD8+T細胞，進而增強抗腫瘤效應，該結果為西達本胺聯合ICIs的臨床應用提供了理論依據。