水飛薊賓對哮喘小鼠氣道黏蛋白Muc5ac的影響及機制研究

劉婷婷,黃志豪,楊紅霞,張建勇

(1.遵義醫科大學附屬醫院 呼吸與危重癥醫學科,貴州 遵義 563099;2.四川省自貢市第一人民醫院 感染科,四川 自貢 683000)

支氣管哮喘(bronchial asthma)簡稱哮喘,是一種以慢性氣道炎癥為特征的異質性疾病[1]。目前認為氣道炎癥是哮喘發病的主要機制,但氣道炎癥的確切發病機制并未完全闡明。研究表明,包括氣道炎癥在內的多種因素可導致氣道黏液高分泌,引起氣道黏液栓形成,阻塞氣道,是致死性哮喘發生的重要因素和評估哮喘病情嚴重程度的獨立危險因素[2-3]。水飛薊賓是從水飛薊中提取的一種天然類黃酮物質,研究表明其具有較強的抗炎活性[4]。本研究觀察不同濃度水飛薊賓對氣道黏蛋白Muc5ac表達水平的影響,探討水飛薊賓對哮喘氣道黏液高分泌的影響及其機制,為哮喘的治療探索新的途徑。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 SPF級6～8周齡雌性BALB/c 小鼠40只,購自湖南斯萊克實驗動物有限公司[SCXK(湘)2019-0004]。動物飼養及實驗方案經遵義醫科大學附屬醫院動物倫理委員會批準[NO:KLLY(A)-2020-076]。建模前,所有小鼠適應性喂養 1 周。

1.1.2 主要藥品、試劑 雞卵清白蛋白(ovalbumin,OVA)、水飛薊賓(Silybin,美國Sigma公司);氫氧化鋁凝膠(英國Invitrogen公司);小鼠IL-6、TNF-α ELISA試劑盒(中國依科賽生物公司);阿利新藍-過碘酸雪夫(alcian blue/periodic acid schiff,AB-PAS)染色試劑盒、Masson染色試劑盒(北京索來寶生物科技有限公司);鼠抗細胞外調節蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases,ERK)1/2、磷酸化細胞外調節蛋白激酶(phospho-extracellular regulated protein kinases,pERK)、轉錄因子SP1(transcription factor SP1)單克隆抗體(中國艾菲生物公司);鼠抗Muc5ac單克隆抗體(武漢博士德生物工程有限公司);辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠IgG(H+L)(中國博士德公司);二步法免疫組化檢測試劑盒、二氨基聯苯胺(diaminobenzidine,DAB)顯色試劑盒(北京中杉生物技術有限公司)。

1.1.3 主要儀器 壓縮式霧化器 NE-C900[歐姆龍(大連)有限公司];Multiskan Spectrum酶標儀(美國BIO-RAD公司);Centrifuge 5417R、5415D離心機(德國Eppendorf公司);光學顯微鏡NIKON YS100(日本NIKON公司);IPWin32采圖系統DM4000B(德國Lecia公司)。

1.2 方法

1.2.1 動物模型的建立 將小鼠隨機分為正常組(NS組)、哮喘組(AS組)、水飛薊賓40 mg/kg組(Silybin40組)、水飛薊賓80 mg/kg組(Silybin80組)、地塞米松組(DEX組),每組8只。AS組、DEX組、Silybin40組、Silybin80組于第1、13天予雞卵清白蛋白/氫氧化鋁凝膠溶液(40 μg OVA+1 mg 氫氧化鋁)腹腔注射聯合皮下注射致敏。第19～23天,以10% OVA溶液每次30 min,每天1次霧化激發。NS組致敏用PBS,激發用NS作為對照處理。AS組、DEX組、Silybin40組及Silybin80組分別于每次激發前30 min予PBS、地塞米松(dexamethasone,DEX)2 mg/kg、水飛薊賓40 mg/kg及水飛薊賓80 mg/kg腹腔注射。末次激發后 24 h 收樣。

1.2.2 支氣管肺泡灌洗液(BALF) 炎癥細胞分類及計數 1.25%阿佛丁(2,2,2-三溴乙醇)小鼠麻醉劑充分麻醉處死小鼠后,行氣管插管術,計數細胞總數,剩余予PBS進行支氣管肺泡灌洗以制備支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid, BALF),灌洗液經離心后取細胞沉淀重懸,涂片制片后行瑞士-吉姆薩染色,計數細胞總數及嗜酸性粒細胞(eosinophil,EOS)百分比。

1.2.3 BALF的IL-6、TNF-α水平檢測 按試劑盒說明書操作,在 450 nm 波長下進行讀數,根據標準曲線計算各相應指標的濃度。

1.2.4 肺組織病理切片HE、AB-PAS染色 小鼠肺組織用4%多聚甲醛浸泡固定 24 h,石蠟包埋,以4 μm厚度切片,行 HE、AB-PAS染色。對HE染色切片進行支氣管周圍炎癥細胞浸潤評分,5個評分標準分別為無、少許、較多分布不均勻、大量均勻不成團、大量均勻并成團,分數為0～4分。AB-PAS染色:有酸性、中性及混合黏液物質及細胞表達,分別呈現藍色、紅色及紫紅色。應用Image Pro Plus6.0圖像分析軟件測量氣道黏液物質相對著色面積進行定量分析。

1.2.5 免疫組織化學(IHC)分析 石蠟切片經脫蠟、水化、3%過氧化氫阻斷內源性過氧化物酶、檸檬酸鹽抗原修復、山羊血清封閉、一抗孵育、二抗孵育、滴加辣根酶標記鏈酶卵白素工作液孵育、DAB顯色、蘇木素復染細胞核、鹽酸酒精分化、脫水中性樹膠封片,顯微鏡鏡檢,圖像采集并用Image pro plus6.0軟件測量目標蛋白的陽性面積,以積分光密度(integral optical density,IOD)表示。

2 結果

2.1 水飛薊賓對哮喘小鼠BALF細胞總數及EOS的影響 AS組的BALF細胞總數及EOS百分比較NS組增加(P<0.05);與AS組相比,DEX組、水飛薊賓組BALF細胞總數及EOS百分比均降低(P<0.05),詳見表1。

表1 各組小鼠BALF細胞總數和EOS的變化

2.2 水飛薊賓對哮喘小鼠BALF的細胞因子IL-6、TNF-α的影響 AS組小鼠BALF的細胞因子IL-6、TNF-α水平較NS組升高(P<0.05),且IL-6升高更明顯。與AS組相比,水飛薊賓及地塞米松干預組IL-6、TNF-α水平均下降(P<0.05),詳見表2。

表2 各組小鼠BALF中IL-6、TNF-α水平的變化

2.3 水飛薊賓對哮喘小鼠氣道炎癥的影響 與NS組相比,AS組肺組織表現出明顯的病理改變,包括明顯的炎癥細胞浸潤、氣道上皮黏膜不完整,氣道上皮細胞及杯狀細胞增生,管壁增厚,管腔狹窄,氣道黏液分泌增多,部分管腔內可見黏液栓,將管腔完全阻塞(P<0.05)。而水飛薊賓及地塞米松干預組小鼠肺部炎癥反應、氣道黏液分泌較AS組減輕(P<0.05)。詳見表3、圖1。

A:NS組氣道上皮細胞排列整齊,氣管及肺血管周圍少量炎癥細胞浸潤;B:AS 組氣道大量黏液堵塞,氣管及肺血管周圍大量炎性細胞浸潤;C～E:DEX組、Silybin40組與Silybin80組管腔通暢,氣道周圍少量炎性細胞浸潤;HE×200。

表3 各組小鼠支氣管周圍炎癥細胞浸潤病理評分比較

2.4 水飛薊賓對哮喘小鼠氣道黏液物質分泌的影響 AS組可見大量黏液物質阻塞氣道,氣道上皮杯狀細胞增生,其表達高于NS組、Silybin40組、Silybin80組,而Silybin40組高于Silybin80組,以上組間差異均有統計學意義(P<0.05)。詳見圖2、表4。

A:NS組氣道中見極少杯狀細胞,未見黏液分泌;B:AS組氣道周圍可見大量的杯狀細胞,大量黏液分泌堵塞氣道;C～E:DEX組、Silybin40組與Silybin80組管腔通暢,氣道中見少量杯狀細胞,黏液分泌較少;AB-PAS×200。

表4 各組小鼠氣道黏液物質相對著色面積的變化

2.5 水飛薊賓對哮喘小鼠的ERK、pERK、SP1和Muc5ac蛋白表達的影響 AS組顯示肺組織中pERK蛋白表達較NS組增加(P<0.05)。與AS組相比,水飛薊賓或地塞米松處理組ERK的磷酸化水平均降低(P<0.05)。Muc5ac、SP1蛋白的表達與pERK的變化趨勢一致(P<0.05)。而ERK在各組之間表達無明顯差異(P>0.05)。詳見表5、圖3。

AS組小鼠肺組織中pERK、SP1、Muc5ac 的表達呈強陽性,NS 組表達較弱;水飛薊賓及地塞米松干預后上述蛋白的表達較AS 組進一步減弱;而ERK的表達在各組之間表達無明顯差異;標尺為50 μm,放大倍數為×200。

表5 各組小鼠ERK、pERK、SP1和Muc5ac蛋白表達IOD變化

3 討論

哮喘是一種由T細胞、EOS及肥大細胞等多種炎癥細胞及細胞組分參與的慢性氣道疾病[5]。目前普遍認為氣道炎癥和氣道重塑是哮喘的重要病理特征,兩者可導致氣道黏液高分泌,進一步加重氣道阻塞[2,6-7]。氣道黏液高分泌的病理基礎是氣道上皮杯狀細胞增生、化生及黏液腺增生肥大以及由此導致的氣道黏蛋白Muc5ac水平升高[8-9]。但哮喘氣道黏液高分泌涉及多種細胞及細胞信號轉導通路的參與,其確切的發生與調節機制尚未完全闡明。GINA及我國哮喘防治指南均推薦吸入性糖皮質激素作為一線治療藥物。但部分患者存在激素抵抗、治療效果不佳,且長期大量吸入糖皮質激素可能出現不良反應,因此,尋求新藥及作用靶點,長期穩定控制哮喘癥狀,對提高哮喘患者生活質量具有重要的意義。

水飛薊賓是一種從植物水飛薊中分離出來的多酚類化合物。研究證明,水飛薊賓具有保肝、抗炎、抗氧化、抗纖維化、抑菌、抗病毒、抗腫瘤、免疫調節及神經保護等廣泛的藥理作用[10-15]。Choi等[16]研究發現,水飛薊賓通過抑制NF-κB途徑減少Th2促炎細胞因子的分泌,使OVA誘導的IFN-γ水平升高,從而調節Th1/Th2細胞平衡。EOS是參與哮喘氣道慢性炎癥的重要炎性細胞,其趨化受到Th2輔助細胞因子(如IL-4、IL-13)、促炎因子(如IL-6、TNF-α)以及特定的協調趨化因子(如EOS趨化因子和黏附因子)等多種細胞因子的調控[17]。IL-6和TNF-α可上調EOS趨化因子和黏附因子,引起EOS募集,促進細胞因子釋放,導致氣道慢性炎癥反應及氣道高反應性等[18]。另外,氣道黏液分泌受到ERK/SP1信號通路的調節,SP1轉錄位點的突變時會導致Muc5ac合成降低,當SP1上游的ERK信號通路異常激活時,ERK持續磷酸化,SP1與Muc5ac基因啟動子持續結合,導致Muc5ac高分泌;而抑制ERK磷酸化,可減少Muc5ac分泌和炎性細胞因子、炎性細胞數量的產生,減輕哮喘癥狀,減緩氣道重塑過程[19]。

本研究通過卵清蛋白致敏與激發構建哮喘小鼠動物模型,發現 AS 組小鼠在激發過程中表現出毛發豎起、抓耳撓腮、呼吸急促、大小便失禁,甚至出現躁動不安或活動遲緩等表現,且氣道炎癥評分、BALF 總細胞計數、EOS百分比、促炎細胞因子IL-6、TNF-α水平、氣道黏液物質著色面積及黏蛋白Muc5ac水平均較NS組顯著升高,提示成功建立哮喘小鼠模型。本研究結果表明哮喘小鼠氣道上皮細胞磷酸化ERK和SP1表達水平較NS組升高。而不同濃度水飛薊賓可減輕哮喘小鼠氣道炎癥水平,降低BALF細胞因子IL-6、TNF-α的分泌水平,使氣道上皮細胞磷酸化ERK和SP1表達減少,氣道黏蛋白Muc5ac水平降低。水飛薊賓的治療作用可能與抑制ERK磷酸化和SP1表達有關[20]。即水飛薊賓可能通過抑制ERK/SP1信號通路,減少炎性細胞因子IL-6、TNF-α表達,抑制氣道炎癥和氣道黏蛋白Muc5ac分泌。本實驗地塞米松干預組氣道炎癥與氣道黏蛋白Muc5ac較AS組明顯減低,提示糖皮質激素可能通過多個環節全面抑制哮喘的氣道炎癥及氣道黏液高分泌。

綜上所述,水飛薊賓干預可抑制哮喘小鼠氣道炎癥和氣道黏液高分泌,其機制可能與抑制ERK/SP1信號通路有關。由于哮喘病理生理機制的復雜性及哮喘的藥物治療仍面臨新的挑戰,水飛薊賓在哮喘治療中的作用、確切機制及未來的臨床應用前景尚需更進一步的研究。