基于網絡藥理學研究銀丹心腦通軟膠囊調控AKT抑制血管內膜增生的作用機制

羅亞丹,丁瑞雪,鮑宇翔,呂俊遠,楊丹莉

(1.遵義醫科大學 基礎藥理教育部重點實驗室暨特色民族藥教育部國際合作聯合實驗室,貴州 遵義 563099;2.遵義醫科大學 藥學院,貴州 遵義 563099;3.遵義醫科大學附屬醫院 普通外科,貴州 遵義 563099)

心血管疾病是全球范圍內導致死亡和殘疾的主要原因[1],其中,冠狀動脈粥樣硬化疾病(coronary atherosclerosis disease,CAD)的患病率和死亡率占比較大[2]。經皮冠狀動脈介入術(percutaneous coronary intervention,PCI)是治療CAD的有效手段[3],但術后易發生血管內膜增生[4]。目前治療血管內膜增生的藥物有待進一步的發掘。中藥復方制劑銀丹心腦通軟膠囊(yin dan xin nao tong soft capsule,YDXNT)減輕氣滯血瘀引起的胸痹、胸悶、氣短和心悸等癥狀,用于防治冠心病、心絞痛、高脂血癥、腦動脈硬化、中風、中風后遺癥等病癥。YDXNT有抗血管內膜增生作用,但其作用機制尚不完全明確。本研究采用球囊損傷復制大鼠頸動脈血管內膜增生模型,結合網絡藥理學分析方法探討銀丹心腦通軟膠囊對內膜增生的作用機制,將KEGG結果中篩選出的PI3K/AKT信號通路作為驗證其治療血管內膜增生的可能機制,明確YDXNT對血管內膜增生的治療作用與其調控AKT相關,以期為YDXNT在PCI術后血管內膜增生領域的臨床應用推廣提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 網絡藥理學數據庫 藥物相關數據庫:中國知網(https://www.cnki.net/);Pubchem數據庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/);TCMSP數據庫(https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php/);Symmap數據庫(http://www.symmap.org/);Targetnet數據庫(http://targetnet.scbdd.com/);Swiss Target Prediction數據庫(https://www.swisstargetprediction.ch/)。疾病相關數據庫:OMIM數據庫(https://omim.org/);DisGeNET數據庫(https://www.disgenet.org/);GeneCards數據庫(https://www.genecards.org/);網絡藥理學富集分析相關數據庫:Uniprot數據庫(https://www.uniprot.org/);Venny 2.1.0(http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/);STRING數據庫(https://string-db.org/);Metascape數據庫(https://metascape.org/)。軟件:Cytoscape3.7.2;R3.6.0;微生信在線作圖(http://www.bioinformatics.com.cn/);Openbable;autodock tool;autodock vina;Pymol。

1.2 實驗動物與試劑

1.2.1 動物 雄性SD大鼠30只(SPF級),購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司,動物質量合格證號:SCXK(湘)2019-0004,體質量(300±20)g。飼養于遵義醫科大學SPF級動物實驗中心,維持飼料喂養,自由飲食,光照循環條件12 h明/12 h暗,溫度(25±2)℃,濕度(50±10)%。使用許可證號:SYXK(X)2021-0003。動物倫理委員會批準號:ZMU21-2205-036。

1.2.2 藥物與試劑 銀丹心腦通軟膠囊由銀杏葉、丹參、燈盞細辛、絞股藍、山楂、大蒜、三七、艾片組成(貴州百靈企業集團制藥股份有限公司生產,批準文號為國藥準字Z20027144,產品批號為20190228)。免疫組化試劑盒(Elabscience,E-IR-R217);抗體:AKT、p-AKT(Thr308)抗體(affinity公司,AF6259、AF3262)。

1.3 方法

1.3.1 網絡藥理學

1.3.1.1 銀丹心腦通軟膠囊成分查詢 在TCMSP數據庫查詢中藥的成分,符合ADME參數OB≥30%且DL≥0.18[5]的活性物質認為是活性成分,并在中國知網數據庫和PubMed數據庫上通過文獻檢索補充不滿足上述ADME參數但有明顯藥效作用或液相檢測出的含量較高的活性成分。

1.3.1.2 銀丹心腦通軟膠囊活性成分靶點預測 將1.3.1.1項篩選出的活性成分導入TCMSP數據庫,Symmap數據庫得到活性成分的靶點。通過Pubchem數據庫查詢活性成分的Canonical SMILES,導入Swiss Target Prediction數據庫和targetnet數據庫,篩選Prob≥0.9的結果[6]。將預測的活性成分靶點導入UniProt數據庫統一為標準基因名。將獲取的靶點匯總去重得YDXNT的相關靶點。

1.3.1.3 內膜增生相關靶點收集 利用OMIM、DisGeNET 和GeneCards數據庫對“內膜增生”(Neointimal hyperplasia)獲取疾病靶點,去重后即為內膜增生的靶點。將1.3.1.2得到的YDXNT相關靶點與內膜增生的靶點通過Venny 2.1.0取交集,交集靶點即為YDXNT作用于內膜增生的潛在作用靶點,繪制韋恩圖。

1.3.1.4 構建蛋白互作網絡(PPI) 將1.3.1.3所得交集靶點導入STRING數據庫構建PPI,在“multiple proteins”欄目輸入YDXNT抗內膜增生的潛在作用靶點,設定物種為“Homo sapiens”,置信度為0.700,獲取PPI,將此網絡導入Cytoscape可視化,采用CytoNCA插件計算網絡中節點的拓撲參數獲得關鍵靶點。

1.3.1.5 富集分析 將1.3.1.3所得的交集靶點導入至Metascape數據庫,進行GO生物過程、細胞成分、分子功能和KEGG的富集分析。物種選擇“H.sapiens”,富集參數設定為“Min Overlap=3;Pvalue cutoff=0.01;Min Enrichment=1.5”。以P≤0.01且Count值從大到小排序作為篩選條件,選取符合條件的前20的KEGG,繪制GO和KEGG氣泡圖。Cytoscape軟件構建YDXNT抗內膜增生的中藥-活性成分-關鍵靶點-顯著通路網絡。

1.3.1.6 分子對接 將關鍵靶點及其對應的活性成分進行分子對接實驗。自Pubchem數據庫下載活性成分的*sdf格式文件;從PDB數據庫下載蛋白3D結構*pdb格式文件。利用Openbable將*sdf格式轉換*pdb格式。在autodock tool中進行去水、加氫等處理,并進行小分子與蛋白對接。每個小分子和蛋白對接大于60次,選擇結合能最低且氫鍵數大于等于2的小分子構象保存為*pdb格式,在Pymol軟件中進行可視化處理。分子對接的結果用微生信在線做熱圖。

1.3.1.7 免疫組織化學法檢測大鼠頸動脈血管新生內膜中AKT、p-AKT表達,于100倍光鏡下觀察。

1.3.2 體內實驗

1.3.2.1 模型制備、分組及給藥 SD大鼠在術前禁食8 h后采用5%戊巴比妥鈉(50 mg/kg)腹腔注射麻醉后仰臥位固定在手術臺上。大鼠頸部備皮、消毒后,取頸部正中切口約1.5 cm,鈍性分離皮下組織、充分顯露左頸動脈,左頸外動脈的近心端和遠心端用血管夾夾閉,在夾閉的中段剪一呈“V”型的小口以插入2F Fogarty球囊導管,向近心端插入直至主動脈弓后以0.15 mL生理鹽水充盈球囊導管,將充盈的球囊導管回拉至頸內外動脈分叉處后收縮球囊,如此重復抽拉3次后縫合傷口。假手術組不進行球囊置入和擴張損傷,其余步驟與模型組相同。實驗分組:假手術組(Sham,n=10)作為空白對照組,將頸動脈血管內膜增生模型SD大鼠隨機分為模型組(Model,n=10)、YDXNT給藥組(YDXNT,n=10)。造模次日YDXNT組予YDXNT混懸液1.0 g/kg灌胃,Model組和Sham組予等量雙蒸水灌胃,每日1次,持續14 d。

1.3.2.2 大鼠頸動脈組織形態學觀察 按照步驟1.3.2.1的方法分離并取出左頸總動脈,用預冷的PBS沖洗,取血管中部用于固定包埋。切片脫蠟后用蘇木精和伊紅染色,封片后于100倍光鏡下觀察血管組織的形態。

2 結果

2.1 YDXNT相關活性成分查詢結果 檢索YDXNT 中藥所含成分。艾片、山楂、大蒜未篩選到OB≥30%且DL≥0.18的成分,通過文獻檢索這3味藥的有效成分予以統計,詳見表1。去除重復后得到138個YDXNT相關活性成分。

表1 YDXNT藥物-成分-靶點

2.2 銀丹心腦通軟膠囊成分靶點預測及內膜增生相關靶點收集結果 共獲得YDXNT活性成分靶點773個,血管內膜增生相關靶點654個。將YDXNT活性成分靶點與血管內膜增生相關靶點取交集,作為YDXNT干預血管內膜增生的潛在作用靶點,共181個(圖 1)。

2.3 PPI網絡及YDXNT干預內膜增生的關鍵靶點 該網絡的235個靶點存在6 348條相互作用。通過參數度中心性(degree centrality, DC) 、緊密中心性(closeness centrality, CC)和中介中心性(betweenness centrality, BC) 3個參數分別篩選出前10名的基因,去重后得到13個關鍵靶點,分別是AKT1、TNF、IL6、GAPDH、TP53、ACTB、IL1B、INS、JUN、ALB、MAPK3、EGFR、FOS。推測 YDXNT 可能通過這些靶點治療內膜增生,見表2。STRING數據庫中錄入潛在作用靶點,將PPI數據文件導入 Cytoscape 軟件進行可視化分析,圖2。

圖1 YDXNT與內膜增生靶點韋恩圖

圖2 YDXNT作用內膜增生的PPI網絡

表2 關鍵靶點拓撲參數

2.4 功能富集分析 將181個潛在作用靶點導入Metascape 數據庫中進行富集分析,根據P值排序,分別取分析結果的前10名繪制GO富集分析圖(圖3)。KEGG富集分析取前20名繪制氣泡圖(圖4)。KEGG富集分析發現,YDXNT與內膜增生主要與腫瘤信號通路、糖尿病并發癥中的AGE-RAGE信號通路、流體剪切應力和動脈粥樣硬化信號通路、脂質和動脈粥樣硬化信號通路、PI3K/AKT信號通路、HIF-1信號通路等相關。生物過程(biological process, BP)主要與激素、細胞遷移、磷酸化的調節、對肽類激素和脂多糖的反應等。細胞組成(cellular component, CC)主要涉及囊腔、膜筏、膜微區、細胞質、血小板 α 顆粒、分泌顆粒管腔、轉錄調控復合體等。分子功能(molecular function, MF)與調控信號受體調節活性、轉錄因子結合、受體配體活性、蛋白激酶活性、激酶結合、轉錄因子結合、磷酸轉移酶活性等相關。

BP:生物學過程分析;CC:細胞組分分析;MF:生物功能分析。

圖4 KEGG富集分析氣泡圖

2.5 中藥-活性成分-靶點-顯著通路網絡的構建 YDXNT的中藥-活性成分-靶點-顯著通路網絡構建見圖5。YDXNT可通過槲皮素(MOL000098)、木犀草素(MOL000006)、黃芩素(MOL002714)等多個成分作用于多個靶點和通路干預血管內膜增生。

圖5 中藥-活性成分-靶點-顯著通路網絡

2.6 分子對接 將2.5所得的度值排名前3的YDXNT活性物質與2.3所得的 PPI 網絡中排名前5的靶點進行分子對接驗證。結果顯示,AKT1(PDB ID:1UNQ),TNF(PDB ID:2AZ5),IL6(PDB ID:5FUC),GAPDH(PDB ID:6IQ6),TP53(PDB ID:6MXY)均能與槲皮素(MOL000098)、木犀草素(MOL000006)、黃芩素(MOL002714)結合良好(結合能均小于-5 kcal/mol),見圖6。槲皮素與AKT1的TYR-38、ARG-48和ASN-54形成氫鍵;木犀草素與AKT1的TRP-80、GLN-59和GLU-114形成氫鍵;黃芩素和AKT1在GLU-91和GLU-95形成氫鍵,見圖7。3種活性成分與AKT1的PH結構域結合。

圖6 蛋白與活性成分的結合能熱圖

A:槲皮素;B:木犀草素;C:黃芩素。

2.7 YDXNT對球囊損傷所致血管內膜增生的影響 HE結果顯示,Sham組血管管腔光滑,無增生內膜;與Sham組相比,Model組血管管腔狹窄,內膜增生明顯,新生內膜面積增大(P<0.05);YDXNT組血管管腔面積增大,狹窄程度改善,內膜增生減少(P<0.05),詳見圖8。

A:HE染色(×100);B:新生血管內膜面積統計與 Sham比較,P<0.05; *:與 Model比較,P<0.05。

2.8 YDXNT對內膜增生頸動脈組織AKT和p-AKT蛋白表達水平的影響 免疫組化法檢測AKT、p-AKT(Thr308)在各組血管新生內膜中的蛋白表達量。結果顯示,Sham組幾乎無AKT、p-AKT(Thr308)表達;與Sham組相比,Model組血管新生內膜中AKT、p-AKT(Thr308)陽性表達增多(P<0.05);與Model組相比,YDXNT組血管新生內膜中AKT、p-AKT(Thr308)陽性表達量明顯減少(P<0.05),見圖9。

A: AKT的免疫組化(×100);B: p-AKT的免疫組化(×100);C: p-AKT蛋白表達統計 n=5);#:與 Sham比較,P<0.05; *:與 Model比較,P<0.05。

3 討論

冠狀動脈疾病在PCI出現后得到有效防治,但即使在現代的藥物涂層支架時代,以及使用現有防止內膜增生的藥物如西羅莫司或紫杉醇的情況下,PCI術后仍易發生冠脈新內膜增生[7-8]。既往研究表明,對于PCI后的CAD患者,中藥(traditional chinese medicine,TCM)和中西藥聯合使用可降低不良心血管事件的發生[9]。

YDXNT應用于臨床多年,療效安全確定[10]。前期研究發現,YDXNT可以改善球囊損傷所致大鼠頸動脈血管內膜增生[11]。YDXNT為復方制劑,銀杏葉作為君藥,通過藥物中有效成分的體內代謝,其多種化學成分相互作用于多個靶點發揮多種藥效。網絡藥理學具有整體性和系統性的特點,與中醫藥從整體辨證論治的原理相似,在中藥的現代研究中有巨大潛力[12]。本研究結合網絡藥理學和體內實驗探究 YDXNT干預血管內膜增生的藥理機制。

網絡藥理學通過檢索TCMSP數據庫,篩選YDXNT主要活性成分并預測可能的靶點。將TCMSP和文獻檢索篩選出的活性成分與色譜-質譜等手段獲取的YDXNT成分對比發現有重合[13-14]。由于活性成分篩選時采用了普適標準(OB≥30%,DL≥0.18),導致一些研究較多和植物中普遍存在的成分在網絡分析中占據較高權重,而藥材中特有的活性成分一定程度忽略,因此通過檢索相關文獻進行補充。取血管內膜增生疾病基因和活性成分靶點的交集作為潛在作用靶點。對潛在作用靶點進行映射做PPI網絡圖,并應用cytoNCA插件,篩選符合DC、CC、BC參數的靶點視作關鍵靶標。AKT1在關鍵靶標中度值位居第一,AKT1是AKT重要的亞型。AKT對細胞活性與功能有著重要影響[15-16],同其他關鍵靶點如VEGF、TNF-α、IL-6、TP53都可以影響血管平滑肌細胞的遷移和增殖[17]。而血管平滑肌細胞的增殖、遷移和表型轉化在血管內膜增生中起關鍵作用,也是主流的治療靶點[18]。KEGG富集分析顯示,YDXNT可能通過PI3K/AKT信號通路、脂質和動脈粥樣硬化信號通路、流體剪切應力和動脈粥樣硬化信號通路、HIF-1信號通路等發揮抗血管內膜增生的作用。綜上所述,YDXNT抗血管內膜增生是多靶點-多通路協同作用的結果。

分子對接結果顯示,YDXNT的主要活性成分與關鍵靶點具有良好的結合。主要活性成分與核心靶點AKT1的對接顯示活性成分結合在AKT1的PH結構域[19],而PIP3在PH結構結合引起AKT構象變化,使AKT1的Thr308磷酸化從而引發下游反應[20]。體內實驗結果顯示,YDXNT可有效改善球囊損傷所致大鼠頸動脈血管內膜增生,免疫組化法發現YDXNT可下調AKT和p-AKT(Thr308)蛋白表達,YDXNT或通過影響AKT1的PH結構域發揮抗血管內膜增生作用。

本研究從多個角度對銀丹心腦通軟膠囊抗血管內膜增生的潛在作用靶點及分子機制進行預測,并進行驗證,為后續研究提供新的探索思路,及為該藥物后續的臨床應用研究提供理論依據。