Secoemestrin C 抗肝癌作用機制研究

席曉明，李楊，邵榮光，司書毅，陳明華，趙午莉

目的 通過驗證 secoemestrin C（Sec C）對肝癌細胞增殖的影響，觀察細胞內脂質過氧化水平，檢測內質網應激（ERS）相關信號通路變化，進而揭示 Sec C 在抑制肝癌增殖過程中的作用機制，為針對肝癌的藥物研發提供新的思路。

方法 四甲基偶氮唑藍（MTT）實驗和平板克隆法測定 Sec C對 HepG2 和 BEL7404 細胞增殖的影響；流式細胞術測定Sec C 對肝癌細胞脂質過氧化和凋亡的影響；Western blot法探究 Sec C 對肝癌細胞內質網應激和細胞凋亡相關蛋白表達的影響。

結果 Sec C 以劑量依賴性方式抑制 HepG2 和 BEL7404細胞增殖，IC50 分別為 1.556 和 3.489 μmol/L；平板克隆實驗結果顯示，1 μmol/L Sec C 處理 7 d 后，肝癌細胞的克隆數目和大小顯著降低，表明 Sec C 顯著抑制肝癌細胞增殖且呈現濃度依賴。流式結果顯示，與對照相比，Sec C 處理后，Bodipy 的陽性率增加且呈現濃度依賴，表明 Sec C促進肝癌細胞內脂質過氧化，且流式結果顯示 Sec C 以劑量依賴性的方式誘導肝癌細胞凋亡。Western blot 結果表明，Sec C 會引起內質網應激相關蛋白免疫球蛋白結合蛋白、1 型內質網轉膜蛋白激酶、活化轉錄因子 4 和磷酸化的真核生物起始因子 2 表達增多，其作用呈現濃度依賴性；同時 Western blot 結果顯示，凋亡相關蛋白多聚腺嘌呤二核苷酸核糖聚合酶的表達顯著降低，以及凋亡剪切產物聚腺苷二磷酸核糖聚合酶、活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3 和活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶 7 的表達顯著增多，其作用呈現濃度依賴性。

結論 Sec C 能夠顯著抑制肝癌細胞的增殖，其作用機制可能通過誘導細胞內質網應激導致細胞凋亡。

肝癌是癌癥死亡的前五大常見原因之一[1-2]。在中國，肝癌病例數和死亡數占全球比例的一半以上，誘導因素主要為乙型肝炎病毒或丙型肝炎病毒等慢性感染[3]。肝細胞癌（HCC）是肝癌的主要類型，約占所有肝癌的 75%[4]。肝癌的預后較差且在發病早期不易被發現，因此僅有少數特定患者適合手術切除、肝移植和消融的治療策略，然而術后并發癥風險高，化療藥物如索拉非尼伴有耐藥性、毒性等副作用[5]，因此急需尋找新的治療藥物。

Secoemestrin C（Sec C）是從真菌發酵液中篩選出的一種多硫代二酮哌嗪類化合物，具有抗腫瘤活性。根據文獻報道，Sec C 對胰腺癌及肺腺癌具有很強的抑制增殖作用，通過促發癌細胞內質網應激通路誘導凋亡發揮抗腫瘤功效[6-7]，該分子中的硫橋結構是發揮其生物活性的關鍵基團，膠質毒素是多硫代二氧哌嗪基團的一種真菌代謝產物，可以通過硫橋結構與膜上的硫醇發生反應，誘導產生ROS[8]，ROS 過度積累會導致 DNA 損傷、脂質過氧化、蛋白質變性。內質網（ER）是細胞內蛋白質合成和加工的主要場所，細胞內環境發生紊亂會破壞內質網中蛋白質的折疊效率，導致錯誤折疊的蛋白質積累，引起內質網應激，細胞會啟動未折疊蛋白信號傳導途徑（UPR）來維持穩態，否則持續的ERS 會導致細胞發生凋亡。脂質過氧化在快速增殖的組織中是完全缺失或者非常低，肝細胞具有較高的脂質過氧化水平，但在肝癌中脂質過氧化水平與其分化程度成正比[9]。

目前為止，Sec C 的抗肝癌活性還未見報道。本研究進一步探討 Sec C 發揮抗肝癌作用的機制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 細胞 人肝癌細胞 BEL7404 和 HepG2細胞由醫藥生物技術研究所腫瘤室保存。

1.1.2 實驗試劑 細胞培養用 1640 培養基、DMEM 培養基、胎牛血清均購于美國 Gibco 公司；10 000 IU/ml 青霉素及 10 000 μg/ml 鏈霉素、0.25% 胰蛋白酶-EDTA、磷酸鹽緩沖液均購于中科邁晨科技有限公司；Annexin V-FITC 細胞凋亡檢測試劑盒、SDS-PAGE 蛋白上樣緩沖液（5 ×）、RIPA裂解液、BCA 蛋白濃度測定試劑盒均購于上海碧云天生物技術有限公司；無水甲醇、DMSO 均購于北京化工精細有限股份公司；Western blot 所用一抗均購于美國 Cell Signaling Technology 公司；辣根過氧化物酶標記的二抗均購于北京中杉金橋生物技術有限公司；HRP 底物化學發光液購于美國Millipore 公司；MTT 購于美國 Sigma-Aldrich 公司；N-乙酰半胱氨酸（NAC）購于美國 Selleck Chemical 公司；Bodipy 581/591 C11、DAPI 均購于美國 Invitrogen 公司。

1.1.3 實驗儀器 倒置顯微鏡為日本 Olympus公司產品；流式細胞儀為美國 BD 公司產品；酶標儀為美國 BioTek 公司產品；細胞培養箱為美國Thermo Fisher 公司產品；化學發光檢測儀為美國SpectraMax 公司產品。

1.2 方法

1.2.1 MTT 法檢測 Sec C 對 HepG2 和BEL7404 細胞的殺傷活性 取對數生長期的HepG2 和 BEL7404 細胞，按照每孔 7 × 103個/200 μl 的密度接種于 96 孔板中，于 37 ℃、5%CO2的培養箱中培養 24 h 后，每孔加入用相應培養基配置的不同濃度的藥物 200 μl。48 h 后，按照培養基:MTT（5 mg/ml）為 4:1 的比例配制溶液，棄掉孔中藥物，加入配制好的 MTT 溶液于培養箱中繼續培養 3.5 h。棄掉孔中溶液，加入 DMSO 150 μl，在振蕩器上振蕩 5 min。用酶標儀測定在490 nm 處的光密度值（OD490）。使用 SigmaPlot 軟件計算 Sec C 對 HepG2 和 BEL7404 的半數抑制率（IC50），并繪制濃度-生存率曲線。細胞存活Sec C 濃度的選擇根據其對 HepG2 和 BEL7404細胞的 IC50，NAC 濃度的選擇根據其在 MTT 實驗中逆轉 Sec C 殺傷能力的結果。

1.2.2 平板克隆實驗 HepG2 和 BEL7404 細胞分別按 1000 個/孔接種于 6 孔板中，第二天，采用不同濃度的藥物處理細胞。7 d 后，棄掉上清并使用 PBS 清洗，使用甲醇室溫固定 15 min，加入結晶紫染色 15 min，棄掉染液，PBS 清洗至背景透明，自然風干并拍照。

1.2.3 檢測脂質過氧化水平 取對數生長期的HepG2 和 BEL7404 細胞，按照 2.5 × 105個/孔的密度接種于 6 孔板。次日，加入不同濃度的藥物處理 24 h，用 PBS 清洗 3 次。在 6 孔板中加入PBS 配制的 Bodipy 581/591 C11，避光在培養箱中孵育 30 min。隨后 PBS 清洗 3 次去除殘留染料。Bodipy 581/591 C11 進入細胞后其多不飽和丁二烯片段被氧化，導致 Bodipy 581/591 C11 最大發射熒光從 590 nm 遷移到 510 nm 附近，與脂質過氧化活性氧的產生成正比，通過流式細胞儀 FITC 通道檢測[10]。

1.2.4 Western blot 檢測 細胞以 2.5 × 105個/孔的密度接種于 6 孔板，細胞貼壁后，用不同濃度的藥物處理 24 h，同時設置對照組。收集細胞，用 RIPA 裂解液提取細胞中的總蛋白，冰上裂解20 min，4 ℃、12 000 r/min 離心 20 min 后小心吸取上清，并采用 BCA 法對蛋白進行定量。隨后待測樣品進行 SDS-PAGE 電泳，電泳完成后，將凝膠中的蛋白轉印至 PVDF 膜上，然后使用含 5%脫脂奶粉的封閉液室溫封閉 2 h；PBST 清洗，采用適宜濃度的一抗 4 ℃ 過夜孵育。次日，PBST 清洗 3 次，每次 5 min，使用適宜濃度的二抗室溫孵育 2 h，PBST 清洗，采用增強型 HRP 底物化學發光液顯色，凝膠成像儀成像并拍照[7]。

1.2.5 流式細胞術檢測細胞凋亡 按照 Annexin V-FITC 細胞凋亡檢測試劑盒說明書進行。收集6 孔板中藥物處理后的細胞，離心，棄上清。加入PBS 清洗一次，離心并棄去 PBS，加入 195 μl Annexin V-FITC 結合液重懸細胞。避光加入 10 μl碘化丙啶（PI）和 5 μl Annexin V-FITC 染色液混勻。避光室溫孵育，20 min 后，細胞過篩，避光置于冰上，立即進行流式細胞儀檢測。

1.3 統計學處理

2 結果

2.1 Sec C 能夠顯著抑制肝癌細胞增殖

檢測了不同濃度 Sec C 對肝癌細胞的殺傷活性。MTT 實驗結果顯示，Sec C 對 HepG2 細胞和BEL7404 細胞的 IC50分別為（1.556 ± 0.031）和（3.489 ± 0.085）μmol/L（圖 1A），能夠有效殺傷肝癌細胞。

圖1 Sec C 顯著抑制肝癌細胞增殖（A：MTT 法檢測不同濃度 Sec C 處理 48 h 后HepG2 和 BEL7404 細胞的存活率；B：平板克隆實驗指定濃度的 Sec C 作用 7 d 后 HepG2 和 BEL7404 的克隆形成能力；**P ＜ 0.01，***P ＜ 0.001）Figure 1 Sec C significantly inhibited the proliferation of hepatocellular carcinoma cells (A: The survival rate of HepG2 and BEL7404 cells treated with different concentrations of Sec C for 48 h by MTT; B: Cloning capacity of HepG2 and BEL7404 after 7 days of treatment with Sec C at specified concentration in plate cloning experiment; **P ＜ 0.01, ***P ＜ 0.001)

采用平板克隆實驗進一步驗證 Sec C 對肝癌細胞增殖的抑制作用，HepG2 和 BEL7404 細胞使用不同濃度的 Sec C 處理 7 d，結果表明，Sec C抑制肝癌細胞集落的形成，且隨著 Sec C 濃度的增高，抑制作用顯著增強（圖 1B）。

2.2 Sec C 誘導肝癌細胞脂質過氧化和內質網應激并促進細胞凋亡

使用流式細胞術檢測 Sec C 對細胞內脂質過氧化的影響，實驗結果表明 Bodipy 581/591 C11 入胞后其不飽和丁二烯片段被細胞內 ROS 氧化，與Sec C 的濃度呈現劑量依賴性（圖 2A、2B）。

Western blot 結果顯示，Sec C 能夠促進HepG2 和 BEL7404 細胞中內質網應激相關蛋白免疫球蛋白結合蛋白（BIP）、活化轉錄因子 4（ATF4）、磷酸化的真核生物起始因子 2（p-eIF2α）和 1 型內質網轉膜蛋白激酶（IRE1α）表達增加，并呈濃度依賴（圖 2C、2D）。

圖2 Sec C 誘導肝癌細胞脂質過氧化及內質網應激相關蛋白表達（A：流式檢測不同濃度 Sec C 處理后 HepG2 細胞內脂質過氧化水平；B：流式檢測不同濃度 Sec C 處理后 BEL7404 細胞內脂質過氧化水平；C：Western blot 法檢測 HepG2 細胞經 2、3 μmol/L Sec C 處理后內質網應激相關蛋白表達；D：Western blot 法檢測 BEL7404 細胞經 4、5 μmol/L Sec C 處理后內質網應激相關蛋白表達；**P ＜ 0.01，***P ＜ 0.001）Figure 2 Sec C induced lipid peroxidation and endoplasmic reticulum stress-related protein expression in hepatocellular carcinoma cells（A: The level of lipid peroxidation in HepG2 cells treated with Sec C at different concentrations was determined by flow cytometry; B: The level of lipid peroxidation in BEL7404 cells treated with Sec C at different concentrations was determined by flow cytometry; C: The expression of endoplasmic reticulum stress-related proteins in HepG2 cells treated with 2 and 3 μmol/L Sec C was detected by Western blot; D: The expression of endoplasmic reticulum stress-related proteins in BEL7404 cells treated with 4 and 5 μmol/L Sec C was detected by Western blot; **P ＜ 0.01, ***P ＜ 0.001）

流式細胞術結果顯示，Sec C 促進了肝癌細胞凋亡（圖 3A、3B），同時，Western blot 結果表明，Sec C 促進聚腺苷二磷酸核糖聚合酶（PARP）表達降低，cleaved-PARP、活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶 3（cleaved-caspase3）和活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶 7（cleaved-caspase7）蛋白表達升高（圖 3C、3D）。

2.3 NAC 部分逆轉 Sec C 引起的增殖抑制、脂質過氧化、內質網應激和細胞凋亡

MTT 實驗和平板克隆實驗證明，同時使用Sec C 和 NAC 處理細胞，NAC 可以部分逆轉Sec C 對 HepG2 和 BEL7404 細胞的增殖抑制（圖 4）；流式實驗表明，NAC 可以部分逆轉 Sec C 引起的 HepG2 和 BEL7404 細胞脂質過氧化（圖 5A、5B）；Western blot 證明，NAC 可以逆轉 Sec C 誘導的 HepG2 和 BEL7404 細胞內質網應激（圖 5C、5D）和 caspase 家族凋亡通路相關蛋白的表達（圖 5E、5F）。

圖4 NAC 部分逆轉 Sec C 誘導的增殖抑制 （A：MTT 實驗測定 HepG2 和 BEL7404 細胞分別經 2 μmol/L 和 4 μmol/L Sec C 處理不同濃度 NAC 的逆轉效果；B：HepG2 和 BEL7404 細胞經 1 μmol/L Sec C 和 100 μmol/L 的 NAC 共同處理7 d 后克隆形成能力；*P ＜ 0.05，**P ＜ 0.01，***P ＜ 0.001）Figure 4 NAC partially reversed Sec C-induced proliferation inhibition (A: MTT assay was used to determine the reverse effect of 2 μmol/L Sec C and 4 μmol/L Sec C treatment on HepG2 and BEL7404 cells with different concentrations of NAC; B: Clonal formation ability of HepG2 and BEL7404 cells after co-treatment with 1 μmol/L Sec C and 100 μmol/L NAC for 7 days; *P ＜ 0.05,**P ＜ 0.01, ***P ＜ 0.001)

圖5 NAC 部分逆轉 Sec C 引起的脂質過氧化、內質網應激和細胞凋亡（A：HepG2 細胞經 3 μmol/L Sec C 和 100 μmol/L NAC 共同作用 24 h 后細胞內脂質過氧化水平；B：BEL7404 細胞經 4 μmol/L Sec C 和 100 μmol/L NAC 共同作用 24 h 后細胞內脂質過氧化水平；C：HepG2 細胞經 3 μmol/L Sec C 和 100 μmol/L NAC 共同作用 24 h 后細胞中內質網應激有關蛋白的表達；D：BEL7404 細胞經 5 μmol/L Sec C 和 100 μmol/L NAC 共同作用 24 h 后細胞中內質網應激相關蛋白的表達；E：HepG2 細胞經 3 μmol/L Sec C 和 100 μmol/L NAC 共同作用 24 h 后，細胞中凋亡有關蛋白的表達；F：BEL7404細胞經 5 μmol/L Sec C 和 100 μmol/L NAC 共同作用 24 h 后細胞中凋亡有關蛋白的表達）Figure 5 NAC partially reversed Sec C-induced lipid peroxidation, ER stress and apoptosis (A: The level of intracellular lipid peroxidation in HepG2 cells after being treated with 3 μmol/L Sec C and 100 μmol/L NAC for 24 h; B: Intracellular lipid peroxidation levels of BEL7404 cells after being treated with 4 μmol/L Sec C and 100 μmol/L NAC for 24 h; C: Expression of endoplasmic reticulum stress-related proteins in HepG2 cells after being treated with 3 μmol/L Sec C and 100 μmol/L NAC for 24 h;D: The expression of endoplasmic reticulum stress-related proteins was observed in BEL7404 cells after being treated with 5 μmol/L Sec C and 100 μmol/L NAC for 24 h; E: Expression of apoptosis-related proteins in HepG2 cells after being treated with 3 μmol/L Sec C and 100 μmol/L NAC for 24 h; F: The expression of apoptosis-related proteins in BEL7404 cells was observed after being treated with 5 μmol/L Sec C and 100 μmol/L NAC for 24 h)

3 討論

天然藥物來源廣泛，具有強效的抗腫瘤活性和較低的毒副作用，并且其化學結構可以作為開發新藥的模型[11]。在微生物發酵液中，我們篩選出了一種能夠顯著抑制腫瘤生長的天然化合物 Sec C，本研究首次探究了 Sec C 抑制肝癌的作用機制，發現Sec C 可以顯著抑制肝癌 HepG2 和 BEL7404 細胞的增殖，并促進細胞內脂質過氧化和內質網應激，進而誘導癌細胞凋亡。

在內質網應激的早期，BIP 作為內質網伴侶蛋白，可以結合在未應激細胞 IRE1α 蛋白的內質網腔結構域上，阻止 IRE1α 的信號傳導[12]，細胞受到外界刺激時，伴侶蛋白 BIP 從 IRE1α 上脫落，錯誤折疊的蛋白質與 IRE1α 跨膜結構的腔結構域結合，激活下游信號通路[13]。IRE1α 是一種內質網跨膜蛋白，具有 RNase 的活性，促發 X-盒結合蛋白 1（XBP1）的 mRNA 剪接，進而促進基因轉錄來維持穩態[14]。內質網持續應激，真核生物翻譯起始因子 2α（eIF2α）亞基的絲氨酸 51 位發生磷酸化來減弱翻譯起始。eIF2α 磷酸化水平增加，會促進 ATF4 蛋白質的表達來緩解內質網應激[15]，ERS持續存在或加重，癌細胞無法通過 UPR 重建 ER穩態，ER 應激從促生存狀態轉變為促凋亡狀態[16]。半胱氨酸蛋白酶家族可以誘導細胞凋亡，其中，效應半胱天冬酶 caspase3 和 caspase7 是無活性的同源二聚體[17]，無活性的酶原被激活時，被切割形成具有水解酶活性的蛋白水解酶如cleaved-caspase3 和 cleaved-caspase7，靶向并切割含有 Asp-Glu-Val-Asp 序列基序的蛋白質，最終導致細胞死亡[18]。

本研究結果表明，與對照組相比，Sec C 處理后細胞脂質過氧化水平增高，多硫代二酮哌嗪類化合物中的硫橋結構是 Sec C 發揮活性的主要基團，該類化合物可以利用硫橋結構和細胞中的半胱氨酸殘基形成二硫鍵，誘導細胞發生氧化應激，產生活性氧[19]。ROS 過度積累會使膜結構的通透性發生改變，進而導致具有膜結構的細胞器如內質網損傷，干擾 ER 功能[20]，導致錯誤折疊蛋白質的積累，并觸發 ERS[21-22]，誘導細胞凋亡[23]。Western blot結果顯示內質網應激相關蛋白 BIP、ATF4、IRE1α、p-eIF2α 表達水平顯著升高，凋亡相關蛋白cleaved-caspase3、cleaved-caspase7、cleaved-PARP蛋白表達水平顯著升高。據文獻報道，乙酰半胱氨酸具有還原活性，發揮破壞二硫鍵或代替蛋白質中的半胱氨酸殘基的功能[24]，在 Sec C 處理的同時加入半胱氨酸衍生物 NAC，與 Sec C 組相比，細胞的增殖抑制作用得到部分逆轉，且隨著 NAC 的濃度增高逆轉作用增強。內質網應激相關蛋白和凋亡相關蛋白表達水平顯著降低。揭示了 Sec C 誘導細胞內持續的內質網應激激活 UPR 信號通路中IRE1α 和 p-eIF2α-ATF4 通路，導致細胞凋亡。

綜上所述，Sec C 顯著抑制肝癌 HepG2 和BEL7404 細胞的增殖，引起細胞凋亡，其機制可能與誘導細胞內脂質過氧化，擾亂內質網正常功能，使 IRE1α、p-eIF2α 蛋白激活，誘導 ATF4 高表達，引起細胞內質網應激有關。因此，Sec C 作為一種有前景抗腫瘤天然化合物，有望成為治療肝癌的候選化合物。