CARD蛋白家族在缺血性卒中中的研究進展

胡玉潔綜述， 徐運審校

卒中是全球的第二大死因，也是導致長期殘疾的主要原因。87%的卒中是缺血性卒中，每年全球約有80萬人罹患缺血性卒中［1］。腦血流的突然中斷導致細胞能量耗竭并迅速死亡，繼發嚴重的炎癥反應和組織損傷。缺血性卒中的病理生理機制涉及興奮性毒性、氧化應激、炎癥、細胞凋亡、免疫應答等過程。CARD是由約90個氨基酸組成的蛋白質，在細胞凋亡、炎癥和先天細胞信號傳導中起作用［2］。近年來，CARD蛋白家族已被廣泛證明與缺血性卒中相關。CARD蛋白家族通過激活轉錄因子蛋白家族核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）和絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）等通路調節炎癥和細胞凋亡，從而直接或間接地影響缺血性卒中的發展和預后。本文就CARD蛋白家族調控缺血性卒中進行歸納和分析，進一步闡述CARD蛋白的作用機制，為今后探究CARD蛋白在缺血性卒中中的臨床轉化提供潛在靶點和研究基礎。

1 CARD家族概述

CARD家族屬于死亡結構域超家族，以包含一個6個或7個反平行α螺旋束的結構為特征［3］。CARD能夠通過同型相互作用和與含CARD結構域的蛋白相互作用促進大型寡聚信號復合物的組裝。根據整體結構域的區別可以將CARD蛋白分為四個亞家族：（1）核苷酸結合域（nucleotide-binding domian，NBD）-CARDs：Apaf-1、NOD1、NOD2、CARD7、CARD12；（2）coiled-coil-CARDs：CARD9、CARD11（CARMA1）、CARD14（CARMA2）、CARD10（CARMA3）；（3）bipartite-CARDs：RIPK2（CARD3）、Bcl10、CARDD、PYCARD/ASC、ARC、半胱天冬酶（Caspase）-1、Caspase-2、Caspase-4、Caspase-5、Caspase-9、CARD8；（4）CARD-only proteins（COPs）：PSEUDO-ICE/CARD18、ICEBERG/CARD16［4］。近年來研究發現CARD與多種腫瘤、心血管疾?。ǜ哐獕?、心肌梗死、動脈粥樣硬化）、自身免疫性疾?。◤娭毙约怪祝?、炎癥性疾?。肆_恩?。?、皮膚?。ㄣy屑病、特異性皮炎、真菌感染性疾?。┫嚓P，提示其在多種病理生理過程中具有重要作用［5-7］。

2 NBD-CARDs與缺血性卒中

2.1 Apaf-1 細胞凋亡激活因子-1（Apaf-1）是細胞應激或損傷的傳感器，也是細胞凋亡線粒體通路中激活Caspase的關鍵分子［8］。在細胞凋亡期間，Apaf-1通過CARD-CARD相互作用促進Caspase-9活化，啟動Caspase級聯反應。Apaf-1在腦中動脈栓塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）小鼠中顯著升高［9］。Apaf-1相互作用蛋白AIP是Caspase-9的新型短變體，包含CARD結構域，但缺乏Caspase-9所具有的催化結構域。小鼠體內過表達AIP可以有效抑制MCAO后的細胞凋亡，提示靶向Apaf-1-Caspase-9信號通路可能是一種可行的缺血性卒中的神經保護策略［10］。

2.2 NOD1、NOD2 先天免疫依賴于跨膜Toll樣受體（Toll-like receptors，TLR）和核苷酸結合寡聚結構域樣受體（NOD-like receptors，NLR）來誘導炎癥反應。核酸結合寡聚結構域1（NOD1）是NLR家族的成員。NOD1在MCAO小鼠海馬中顯著上調，NOD1配體DAP顯著增加MCAO小鼠自噬相關蛋白Beclin1、P62和LC3BII的表達，激活NF-κB通路，擴大梗死體積并加重神經功能缺損［11］。NOD2在體外氧糖剝奪的膠質細胞和神經元細胞中升高，通過NOD2/MAPK/NF-κB信號通路介導氧化應激和炎癥［12］。研究表明，NOD2參與腦缺血再灌注損傷后的炎癥反應，NOD2基因敲除能改善缺血性卒中的預后［13］。因此，NOD1/2是減輕缺血再灌注損傷的潛在靶點。

3 coiled-coil-CARDs 與缺血性卒中

3.1 CARD9 在多種細胞，特別是免疫細胞中表達，參與先天免疫和適應性免疫應答，與感染、炎癥、腫瘤、心血管疾病和自身免疫性疾病相關。CARD9是Bcl-10和NF-κB、MAPK信號傳導的上游激活劑，調節炎癥反應和氧化應激［14］。在MCAO小鼠中，骨髓細胞上表達的TREM-1可以通過與SYK相互作用來激活下游促炎途徑CARD9/NF-κB和NLRP3/Caspase-1［15］。CARD9在缺血性卒中的作用機制仍有待進一步研究。

3.2 CARMA CARD10、CARD11、CARD14都屬于CARMA蛋白［16］。在一項基于機器學習的研究中，CARD11被鑒定為缺血性卒中的免疫相關遺傳生物標志物［17］。

黏膜相關淋巴組織淋巴瘤易位蛋白1（mucosaassociated lymphoid tissue lymphoma translocation protein 1，MALT1），是一種參與NF-κB信號通路的多功能蛋白。MALT1在調節協調免疫反應的大量基因的表達中起關鍵作用。MALT1能夠調節先天性自然殺傷細胞，樹突狀細胞和肥大細胞和適應性免疫細胞（T細胞和B細胞）中促炎基因的表達［18］。MALT1與Th1細胞、Th17細胞及其分泌的細胞因子呈正相關，也與急性缺血性卒中的疾病風險、嚴重程度和預后相關［19］。

4種coiled-coil-CARDs都可以與Bcl10和MALT1形成CBM（CARD-Bcl10-MALT1）復合物。CBM復合物是一種控制免疫和炎癥通路的多蛋白信號平臺，調節NF-κB、MAPK信號通路（A20、HOIL1、CYLD、RELB）和mRNA結合蛋白（regnase1、roquin1、roquin2）的降解，在免疫缺陷疾病、炎癥性疾病和免疫系統癌癥中發揮重要作用［16］。CBM復合物參與DNA損傷誘導的NF-κB活化，并阻止細胞凋亡［20］。研究發現，A20可以通過去泛素化RIPK3發揮抗壞死作用，然而在缺血性卒中的大鼠模型中MALT1通過增強A20的降解來促進大腦的壞死［21］。目前CARMA和CBM復合物在缺血性卒中中的研究較少，具體機制有待進一步研究。

4 bipartite-CARDs與缺血性卒中

4.1 RIPK2/CARD3 受體相互作用蛋白2（RIPK2/CARD3）是NOD2下游的信號銜接蛋白，增強IKKγ/NF-κB必需修飾物（NEMO）的泛素化。CARD3水平在小鼠大腦缺血再灌注損傷后的腦組織中以時間依賴性方式顯著上調。敲除CARD3能減少梗死體積，改善神經病理學評分，減輕炎癥反應和神經元凋亡；而神經元特異性的CARD3過表達擴大了腦梗死體積，加重了神經功能缺損并且增強缺血性卒中后的炎癥反應。MAPKs家族成員，如JNK、ERK和p38在缺血性卒中后迅速被激活。值得注意的是，再灌注6 h后，磷酸化的JNK和p38在CARD3敲除小鼠中明顯降低，但在神經元特異性CARD3過表達的小鼠中顯著升高，兩種情況中p-ERK都沒有明顯變化，這提示CARD3可能通過MAPK通路加重缺血再灌注損傷。轉化生長因子β活化激酶1（TAK1）被廣泛認為是3種傳統MAPKs通路的共同調節因子，神經元特異性CARD3過表達小鼠MCAO后TAK1的激活顯著增強，而在CARD3敲除小鼠中則降低。TAK1特異性抑制劑顯著減少了神經元特異性CARD3過表達小鼠MCAO后的梗死體積，減輕了缺血相關的炎癥和細胞凋亡［22］。CARD3不僅可以調節炎癥還可以通過促進神經元凋亡誘導缺血再灌注損傷，提示靶向CARD3具有緩解缺血性卒中的潛力，能否開發一種跨血腦屏障的CARD3拮抗劑仍有待進一步研究。

4.2 PYCARD PYCARD是炎癥小體的重要組成成分，包含N端Pyrin結構域（PYD）和C端CARD結構域。PYCARD與活化的NLRP3寡聚體中的PYD結構域結合，并通過PYD-PYD同源型結構域相互作用形成同源寡聚體纖維，進一步聚集形成PYCARD寡聚體和大的PYCARD斑點，招募并激活pro-Caspase-1，維持長時間的炎癥小體激活［23］。PYCARD寡聚體可以被釋放到細胞間隙，被鄰近的炎性細胞吸收以維持持續的免疫反應。He等［24］研究發現，重組PYCARD激活NLRP3，誘導促炎反應，惡化了復發性缺血性卒中的結局。

4.3 CARD8 CARD8作為一種銜接分子，負調控Caspase-1依賴性IL-1β的產生，并抑制NF-κB的激活［25］。CARD8編碼C10X變異體外顯子5的無意義T30A多形現象（rs2043211）與中國人群大動脈粥樣硬化卒中相關。Gu等［26］研究了中國人群中CARD8在大動脈粥樣硬化卒中患者中的表達和rs2043211的影響。結果表明，rs2043211變異純合子T/T與左心耳卒中風險顯著增加相關，具有T/T基因型的高血壓患者發生左心耳卒中的風險更高，風險等位基因T使CARD8表達增加，提示rs2043211可能是中國人大動脈粥樣硬化性腦卒中的一種新型生物標志物。Bai等［27］研究發現，9p21位點上的非編碼RNA ANRIL可能通過調節CARD8通路增加缺血性卒中的風險。CARD8在缺血性卒中發病機制中的作用仍有待進一步研究。

4.4 免疫信號適配器（Bcl10） Bcl10最初是在黏膜相關淋巴組織的B細胞淋巴瘤中發現的染色體易位t（1； 14）（p22； q32）附近的候選基因，是一種細胞內信號蛋白［28］。Bcl10收到刺激信號后形成細絲并聚集成介導和傳遞信號的高級簇，最終激活MALT1并傳導NF-κB和JNK信號。Bcl10在大鼠皮質局灶性光栓4 h后的缺血半暗帶區表達升高了60%［29］。在一項基于多加權基因共表達網絡分析（WGCNA）和單細胞分析的研究中Bcl10被鑒定為缺血性卒中相關的關鍵基因［30］。Bcl10在缺血性卒中中的研究較少，具體作用機制有待進一步研究。

4.5 Caspase Caspase家族在程序性死亡和炎癥中發揮重要作用，其中Caspase-1、Caspase-2、Caspase-4、Caspase-5、Caspase-9、Caspase-12包含CARD結構域。Caspase根據其功能分為凋亡型和炎癥型。凋亡型Caspase可進一步分為啟動型和效應型。Caspase-2、Caspase-9屬于啟動型，作為蛋白水解信號放大器激活效應型Caspase。Caspase-1、Caspase-4、Caspase-5、Caspase-12屬于炎癥型，激活細胞焦亡，觸發DAMPs的激活和分泌以促進炎癥［31］。

缺血性卒中后Caspase的表達受到嚴格的轉錄調控。在大鼠MCAO造模12 h后Caspase-2則維持相對穩定的水平［32］。Caspase-2基因敲除并不影響永久性局灶性缺血后的神經功能缺損和組織損傷，在小鼠短暫性和永久性動脈閉塞后pro-Caspase-2的量保持不變，表明Caspase-2不是腦缺血導致細胞死亡的重要效應物［33］。然而，研究發現在小鼠MCAO和小鼠腦神經瘤細胞系N2a的氧葡萄糖剝奪/復氧（oxygen and glucose deprivation/reoxygenation，OGD/R）模型中Caspase-2蛋白表達升高［34］。這可能與造模條件有關，也提示Caspase-2經歷復雜的轉錄后調控。

Caspase-1被NLRP3/PYCARD激活后可以引發細胞焦亡。抑制Caspase-1可MCAO以通過抑制焦亡和晚期糖基化終產物受體(receptor for advanced glycation end products, RAGE)/MAPK通路顯著改善大鼠缺血性卒中后血腦屏障的通透性和完整性［35］。

Caspase-4通過激活非規范的炎癥小體、NLRP3炎癥小體以及與TRAF6-IRAK1（tumor necrosis factor receptor-associated factor 6-IL-1R-associated kinase 1）復合物的相互作用，進而影響細胞焦亡、IL-1β的活化和分泌以及NF-κB炎癥通路［36］。

在大鼠MCAO模型中，Caspase-9在再灌注1 h就已經被激活，神經元活化的Caspase-9激活Caspase-6介導缺血性卒中后12 h內的軸突丟失和24 h內的神經元死亡，在再灌注后4 h通過鼻內遞送一種新型細胞膜穿透的高特異性Caspase-9抑制劑可以在缺血后3周持續提供神經保護作用［37］。研究發現多種中藥復方和中草藥提取物，如木香油方、大黃堿、冬凌草素，可以改善Caspase-9介導的缺血性卒中后的細胞凋亡［38-40］。

Caspase-12是內質網應激誘導的細胞凋亡的核心參與者。激活的Caspase-12從內質網易位到胞質，直接裂解Caspase-9，進而激活Caspase-3［41］。Mouw等［42］研究發現Caspase-12在MCAO后的紋狀體和大腦皮質中顯著升高。重組IL-17A還可以通過Caspase-12依賴性途徑加劇缺血性卒中小鼠的神經元凋亡［43］。星形膠質細胞在氧糖剝奪（OGD）處理后出現細胞損傷和凋亡的增加，Caspase-12、裂解的Caspase-3、NLRP3炎癥小體成分和IL-1β的蛋白水平也顯著升高；使用Caspase-12特異性抑制劑ZATAD-FMK預處理可以保護星形膠質細胞免受OGD誘導的細胞死亡，并抑制NLRP3炎癥小體的激活［41］。Caspase-12及其對NLRP3炎癥小體激活的調節可能是治療缺血性卒中的潛在靶點，具體調節機制有待進一步探索。

5 CARD-only proteins

COPs是Caspase-1和炎癥小體NLR家族激活的調節因子［44］。CARD18與含有CARD的激酶RICK/RIP2/CARDIAK相互作用并激活NF-κB［45］。CARD16、CARD17和CARD18通過競爭性結合并取代Caspase-1蛋白之間的CARD相互作用，改善尿酸晶體介導的NLRP3炎癥小體活化和炎癥性疾?。?6］。研究發現抑制ICE可以減少缺血性和興奮性毒性神經元損傷［47］。ICE突變能夠改善缺血誘導的腦損傷程度并保留神經功能［48］。COPs在缺血性卒中中的作用有待進一步研究。

6 其他CARD

CARD6是NF-κB活化的調節因子，通過協同RIPK家族調節NF-κB的活化［49］。在一項基于WGCNA和機器學習鑒定缺血性卒中患者外周血中的免疫相關關鍵基因的研究中，CARD6被認為是缺血性卒中相關的樞紐基因。CARD6與中性粒細胞、單核細胞和M0巨噬細胞呈正相關，與幼稚B細胞、活化的NK細胞、嗜酸性粒細胞和CD8 T細胞呈負相關［50］。

7 小結

CARD蛋白家族參與細胞炎癥和凋亡，在缺血性卒中的病理過程中發揮重要作用，相關蛋白的突變也與缺血性卒中發病風險相關。目前有關CARD蛋白家族在腦缺血中的研究不斷出現，為靶向相關通路的治療提供基礎。本文歸納CARD蛋白在缺血性腦損傷中的研究（見表1）。目前，CARD蛋白家族的研究主要關注MAPK和NF-κB等信號通路，我們希望能更進一步地研究CARD蛋白家族各個成員的功能和具體的調控機制，為臨床轉化發現新的策略和藥物靶點提供可能性。

表1 CARD蛋白在缺血性腦損傷中的研究

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻聲明：胡玉潔負責文獻收集、撰寫論文，徐運負責擬定寫作思路、指導撰寫文章并最后定稿。