納米銀對無脊椎動物毒性效應的研究進展＊

陸 浩 孔祥云 侍崇敬 徐冰潔 張文超 秦粉菊 劉恒蔚 袁紅霞

（蘇州科技大學，蘇州，215009）

納米銀（AgNPs）由于優良的物理、化學和生物特性，被廣泛應用到航空、醫學、農業、工業等領域，是目前使用量最多的納米材料.其產量巨大，據估計目前全球AgNPs年產量在500—1000 t 之間[1].隨著AgNPs 產品的大量使用，其在生產、運輸、使用及后期處理中不可避免地會流入環境中，導致環境中AgNPs 含量不斷增加[2].現有分析技術還很難檢測AgNPs 在環境中的真實濃度，Giese 通過建模估算了AgNPs 流入到不同環境中的范圍值（表1）[1]，發現AgNPs 含量在環境中不斷增加.土壤和水體是AgNPs 匯集的主要場所[3?4].Sun 等預計歐盟污水處理廠污泥中AgNPs 含量在（0.008—0.01）mg·kg?1之間，自然和城市土壤中AgNPs 每年增加量為（0.91—1.8）ng·kg?1[5].Deycard 等報道污水中可能檢測出的AgNPs 含量在（6.9±2.0）mg·kg?1[6].環境中的AgNPs 會通過食物鏈進入生物體產生毒害作用，已經在許多動物體中廣泛研究，包括軟體、甲殼、魚類、鳥類和哺乳類動物等.同時如本文中所討論的AgNPs 理化性質、環境、涂層等因素都會影響其毒性作用.

表1 AgNPs 在不同環境中的濃度范圍[1]Table 1 Concentration range of AgNPs in different environments[1]

目前國內外文獻關于AgNPs 毒性的研究進展主要從生物種類（如微生物、植物、動物等）、生物個體（如小鼠、斑馬魚、水蚤、昆蟲等）或者特定環境（如水、土壤等）等角度總結，其中涉及到對無脊椎和脊椎動物的毒性[7?9].而無脊椎動物種類數占動物總種類數的95%，是生態系統的重要組成.由此，AgNPs 的擴大生產和廣泛應用更易對無脊椎動物構成嚴重危害.相較于脊椎動物，蚯蚓、秀麗隱桿線蟲、貽貝、水蚤等無脊椎動物具有生理特征代表性、便于獲取和培養、繁殖周期短、飼養成本低、無倫理限制等特點[10?14]，已被廣泛應用于AgNPs 生態毒性測試.研究性文獻中因實驗對象、暴露時間、毒性指標、AgNPs 的理化性質、暴露濃度等差異，對這些研究結果很難進行比較分析，AgNPs 的毒性機制也仍不清晰.

本文主要從累積效應、急性毒性、生長發育毒性、組織病癥、生殖毒性、遺傳毒性和回避行為等方面總結了AgNPs 對無脊椎動物的影響.除此之外，AgNPs 的理化特性、表面涂層、暴露途徑、環境[15?18]等因素都可以影響AgNPs 對無脊椎動物的毒性.從無脊椎動物所獲得的AgNPs 毒性效應，可用于推測AgNPs 對生態系統的影響以及對脊椎等其他動物體可能產生的毒性.但迄今還未見AgNPs 對無脊椎動物毒性效應的研究綜述.本文通過閱讀大量國內外文獻，較為系統地總結了AgNPs 對無脊椎動物的影響，并對未來研究方向及重點做了進一步展望.

1 AgNPs 對無脊椎動物的影響（Effects of AgNPs on invertebrates）

1.1 累積效應

生物累積是納米材料致毒的前期行為，是對生物產生危害的一種機制[19].AgNPs 在環境和生物之間可以進行遷移轉化，使其在無脊椎動物體內的累積作用研究尤為必要[20?21].由于研究所用的受試生物、培養環境、粒徑、表面涂層、暴露時間以及濃度不同，很難通過生物累積量來判斷各類無脊椎動物對AgNPs 生物累積能力高低.但可以看出，不同無脊椎動物對AgNPs 都具有一定程度的生物累積能力.通常，消化系統是無脊椎動物積累AgNPs 最高的部位.Li 等研究顯示AgNPs 暴露組威廉環毛蚓體內的Ag 主要分布在消化系統，且消化系統中的Ag 含量占整個威廉環毛蚓中總Ag 的68.9%，AgNPs在消化系統中的高積累可能是土壤中釋放的高濃度AgNPs 被腸道上皮細胞吸收所造成，腸粘膜中的一些關鍵受體（如Na+、K+、ATP 酶）、與腸道及其微生物群落相關的特定氧化還原和溶質條件可能會促進AgNPs 的攝??；此外，Ag 在消化系統中的高積累可能還與無脊椎動物的解毒策略有關，AgNPs 在腸細胞中可以與金屬硫蛋白（MT）結合，產生的Ag-MT 復合物被隔離在溶酶體中，阻礙了AgNPs 向機體其他部位的轉移[22].

Cozzari 等研究表明，沙蠶從水溶性銀中累積Ag 的效率高于AgNPs[23].同樣，Bao 等研究了AgNPs及硝酸銀對淡水蝸牛不同組織的銀負荷，結果發現，蝸牛從硝酸銀中累積的銀含量高于AgNPs[24].造成這種現象的原因，可能是由于攝取途徑的不同，硝酸銀主要通過質子耦合通道、質子泵、吞噬和胞飲作用等非特異性攝取途徑大量積累，AgNPs 則主要是通過內吞途徑來積累[25]（圖1），并且由于AgNPs 容易聚集并形成生物電暈，也降低了其生物累積量[26].但是Cong 等研究了硝酸銀和AgNPs 對沙蠶的生物累積，發現沙蠶對于兩種形式的銀負荷沒有差異[27].這表明不同的無脊椎動物，對于兩種形式銀的累積差異，至今仍沒有統一的定論.表2 集中列出了AgNPS 對無脊椎動物的生物累積.

圖1 AgNPs 對無脊椎動物毒性機制Fig.1 Toxicity mechanism of AgNPs in invertebrates

表2 AgNPs 對無脊椎動物的生物累積Table 2 Bioaccumulation of AgNPs in invertebrates

1.2 毒性效應

（1）急性毒性和生長發育毒性

AgNPs 對無脊椎動物的急性毒性結果，可以用來直接快速、直觀的判斷AgNPs 毒性的強弱.急性毒性測試指標主要為半數有效濃度（50% effect concentration，EC50）和半數致死濃度（50% lethal concentration，LC50）（表3）.有研究表明，AgNPs 對無脊椎動物的急性毒性在很大程度上是因為AgNPs 顆粒的溶解[38].Ivask 等將大型溞的EC50標準化為溶解的Ag+，發現AgNPs 的溶解校正EC50值與AgNO3相似，這就表明AgNPs 的急性毒性是由釋放的Ag+引起的，但10 nm 的AgNPs 急性毒性卻高于Ag+，原因可能是由于10 nm 及更小的AgNPs 顆粒與細胞相互作用后在細胞外表面或細胞內部溶解，從而更具生物利用度[39].

表3 AgNPs 對無脊椎動物急性毒性數據Table 3 Acute toxicity data of AgNPs to invertebrates

急性毒性試驗只是初步了解AgNPs 對無脊椎動物的毒性高低.在自然環境中，無脊椎動物會長期暴露在含有AgNPs 的環境中.有研究報道，在長期接觸下，AgNPs 會影響無脊椎動物的生長發育[40].Zhao 等發現，AgNPs 可以顯著抑制大型溞的體長，造成抑制的原因可能是因為食物質量的下降，水中AgNPs 和藻類在大型溞腸道結合，導致大型溞對食物吸收率下降，從而影響大型溞的生長發育[41].Mehennaoui 等研究了不同粒徑AgNPs 對淡水鉤蝦生長發育的影響，結果發現10 nm AgNPs 比60 nm AgNPs 更具有抑制效果，可能因為小粒徑的AgNPs 在動物內部溶解，并釋放出更有抑制效果的Ag+，研究指出對于生長發育的抑制，可能是因為淡水鉤蝦甲殼上有關吸附的感官被破壞；另一種假設是生物體運動量的減少，更加有利于防御機制的能量再分配[30].但AgNPs 并非只對無脊椎動物的生長發育產生抑制效果，Mackevica 等發現，大型溞在低濃度（10 μg·L?1）AgNPs 暴露下，反而促進了其生長發育[42].

（2）組織病癥

組織病癥相較于死亡率和體重的變化對低水平AgNPs 暴露更敏感[22].有研究發現，蝸牛經AgNPs 食物相暴露14 d 后，其胃腸道、腎臟、消化腺以及足出現不同程度組織學形態變化.蝸牛胃腸道出現明顯的黏膜損傷與細胞死亡脫落，腎臟組織細胞出現不規則排列、部分細胞脫落，消化小管排列疏松、細胞質內出現較多圓形空泡、部分基底破損、組織細胞部分糜爛脫落，足組織膠原蛋白原纖維排列疏松、細胞間隙增寬并出現較多嗜堿性顆粒團塊[17].AgNPs 對消化腺的損害，會使蝸牛消化食物的能力下降，從而對蝸牛的生長發育產生影響[55].Chen 等也發現，400 mg·L?1AgNPs 對家蠶組織結構的損害，家蠶的基底膜被破壞，杯狀細胞擴張，柱狀細胞變形，此外還觀察到異常的細胞結構和許多片狀結構的出現，這表明AgNPs 會對組織產生不良影響，并可能對主要靶器官，例如對家蠶的消化器官產生有害影響[56].

（3）生殖毒性

AgNPs 會誘導無脊椎動物生殖細胞的凋亡，從而抑制其繁殖.Luo 等發現秀麗隱桿線蟲捕食暴露于1、5、10 μg·mL?1AgNPs 的大腸桿菌后，其性腺細胞凋亡的數量顯著增加，性腺減數分裂區的生殖細胞死亡率顯著增加[57].但也有研究發現，在低濃度AgNPs 暴露下，大型溞的繁殖得到了促進，推測可能是因為AgNPs 具有優良的滅菌性能；而隨著AgNPs 濃度的提高，大型溞的產溞數顯著減少，則是因為高濃度時AgNPs 毒性較大，對大型溞的機體造成了不可逆的損傷，從而對大型溞的繁殖產生了不良影響[28]；另一種推測是因為AgNPs 抑制了大型溞的攝食，導致其能量儲備減少，進一步影響了大型溞的繁殖[58].氧化應激是AgNPs 誘導生殖毒性的主要機制，Lim 等對秀麗隱桿線蟲中氧化應激及其信號通路進行研究，發現AgNPs 會導致野生型（N2）秀麗隱桿線蟲中活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS）增加，低氧誘導結合蛋白（HIF-1）、谷胱甘肽S 轉移酶（glutathione s-transferase，GST）的激活以及繁殖潛力下降，其中PMK-1 p38 絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）在AgNPs 誘導的氧化應激中起重要作用[59].

（4）遺傳毒性

遺傳毒性是化學毒性測試和風險評估中重要的毒性終點之一[60].AgNPs 的遺傳毒性機制，目前認為主要是以下兩種：第一種是通過誘導ROS 增加，干擾DNA 復制、轉錄、抑制相關蛋白質，還會導致嘧啶和嘌呤衍生的氧化損傷；第二種是AgNPs 直接進入細胞作用于細胞器（例如，紡錘體、著絲粒等）[61]，抑制復制、轉錄，導致染色體丟失，斷裂[62]，見圖1.Choi 等研究了AgNPs 對赤子愛勝蚓的遺傳毒性，發現AgNPs 會引起赤子愛勝蚓DNA 損傷，AgNPs 暴露可以使細胞內ROS 增加，引起細胞氧化應激，最終導致DNA 損傷[63].同樣，Alaraby 等通過彗星實驗發現，AgNPs 對果蠅產生遺傳毒性是因為氧化應激所引起的DNA 損傷[64].Botelho 等研究發現，不同濃度和不同時間AgNPs 暴露增加了片腳甲殼動物Parhyalehawaiensis的微核、核芽和核異常的比例[65].AgNPs 不僅會對親代產生毒性效應，對其子代也會造成損害.目前已有研究觀察到AgNPs 對土壤線蟲繁殖的多代效應，Wamucho 等發現秀麗隱桿線蟲多代暴露于AgNPs 會誘導未暴露子代的表觀遺傳變化[66].同樣，Pakrashi 發現，AgNPs 不僅對大型溞母體產生毒害，而且使母體中AgNPs 約1%—2%的總累積Ag 轉移到新生水蚤中，這就表明AgNPs 可能會對水蚤的繁殖產生更持久的不利影響[67].

（5）回避行為

回避行為是動物遇到不利環境的逃避反應，它是一個生態相關的測量結點，用來快速判斷污染物的毒性強弱.回避試驗裝置簡單，操作便捷，反應快速，周期短，是一種很好地檢測AgNPs 毒性的方法.目前，人們已經做過蚯蚓、秀麗隱桿線蟲、土鱉蟲等無脊椎動物的回避試驗，通過測定一定濃度AgNPs 對無脊椎動物個體行為的影響程度來判定其毒性大小[68].Brami 等研究了蚯蚓對AgNPs 的回避試驗，發現蚯蚓對AgNPs 回避行為比繁殖等傳統終點更為敏感，在最低濃度（12.5 mg·kg?1）時就可以觀察到回避現象，但目前還不清楚回避行為是由AgNPs 釋放的Ag+觸發，還是AgNPs 觸發[10].在現有文獻中主要用以下3 種機制來解釋土壤無脊椎動物的回避行為：第一種是污染物使土壤中微生物群發生變化，導致土壤無脊椎動物適口性的改變（如：AgNPs 以及Ag+會改變微生物群落結構）；第二種是土壤無脊椎動物具有化學和機械感受器，金屬顆粒的神經毒性作用或生物化學感覺器敏感性可以使它們主動避開有害環境或移動到更有利的環境；第三種是由于污染物進入到土壤無脊椎動物體內，引起土壤無脊椎動物的不適，從而引起回避行為[69?71].

2 AgNPs 對無脊椎動物毒性的主要機制（Main mechanism of AgNPs toxicity to invertebrates）

目前，關于AgNPs 對無脊椎動物的毒性機制仍不是十分清晰.根據現有研究總結其可能的機制如圖1 所示.AgNPs 暴露后，釋放Ag+，離子與顆粒通過內吞等方式進入細胞，在細胞內產生大量ROS，ROS 與細胞膜表面蛋白結合，破壞細胞膜的完整性，從而導致細胞膜損傷[72].線粒體是AgNPs 誘導氧化應激的主要靶細胞器之一，線粒體中高水平的ROS 導致線粒體損傷，最終導致細胞凋亡[73].細胞內ROS 的增加，會導致氧化應激并破壞細胞成分，造成氧化型DNA 損傷，鏈斷裂，核酸修飾，脂質過氧化，蛋白質變性，抗氧化酶的激活以及抗氧化分子的消耗；此外，AgNPs 誘導的ROS 通過激活細胞信號傳遞，觸發炎癥反應[72?73].

Bao 等發現，蝸牛暴露于AgNPs 后，足部和消化道在Ag 濃度很低的情況下也會誘發顯著的氧化應激，其中過氧化氫酶（catalase，CAT）和過氧化物酶（peroxidase，POD）活性較對照組酶活顯著增加，這些氧化應激可能是由于AgNPs 與生物體細胞的接觸觸發的[24].Pan 等研究發現，AgNPs 對原生動物嗜熱四膜蟲的毒性是由于高活性氧水平引起的，從而導致了脂質過氧化和線粒體功能障礙，為了對抗氧化脅迫，嗜熱四膜蟲激活了抗氧化系統，增加了谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-PX）和其他抗氧化劑的活性[74].Chen 研究了家蠶中AgNPs 的毒性機制，表明ROS 的增加誘導了肌醇加氧酶（MIOX）基因表達下調，影響線粒體形態并導致氧化損傷，且AgNPs 也會抑制超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性，引起持續的氧化應激，從而誘導細胞凋亡[56].Ahamde 等研究了AgNPs 在果蠅中的毒性機制，發現經AgNPs 暴露后，細胞內產生大量ROS，導致膜損傷、氧化應激以及線粒體損傷，最終導致細胞凋亡；此外，還發現氧化應激導致細胞周期檢查點蛋白p53 和細胞信號蛋白p38 上調，這兩種蛋白參與DNA 損傷和凋亡等多種過程，是評估遺傳毒性的分子標記，說明氧化應激誘導了DNA 損傷[75].

3 影響AgNPs 對無脊椎動物毒性效應的因素（Factors influencing the toxic effects of AgNPs on invertebrates）

AgNPs 的理化性質、表面涂層、環境、暴露途徑等因素都可以影響AgNPs 對無脊椎動物的毒性（圖2）.表4 集中匯總了部分AgNPs 對無脊椎動物毒性的影響因素.

圖2 AgNPs 對無脊椎動物毒性的主要影響因素Fig.2 Main influencing factors of AgNPs toxicity to invertebrates

表4 AgNPs 對無脊椎動物毒性的主要影響因素Table 4 Main influencing factors of AgNPs toxicity to invertebrates

3.1 理化性質

AgNPs 的理化性質，包括AgNPs 的尺寸、形貌、晶型、表面特性等[84].AgNPs 的理化性質對無脊椎動物的毒性有很大影響.目前普遍認為AgNPs 粒徑越小其毒性越強，AgNPs 粒徑在20—80 nm 的毒性效應主要由其溶解釋放的Ag+引起，而粒徑較小的AgNPs 顆粒（10 nm）更容易被生物體利用，毒性效應更大[39].Hou 等使用40 nm 和110 nm AgNPs 對大型溞做了毒性研究，結果發現，40 nm AgNPs 比110 nm AgNPs 的LC50值更低，這可能是由于40 nm AgNPs 的溶解速率比110 nm AgNPs 快，小粒徑AgNPs 顆粒比表面積更高，生成焓更高[44].Moon 等使用AgNPs 顆粒、納米銀線、納米銀板分別對秀麗隱桿線蟲進行毒性測試，結果發現AgNPs 顆粒和納米銀板對秀麗隱桿線蟲的生長和繁殖具有抑制現象，而納米銀線的影響卻微乎其微，其中AgNPs 顆粒毒性最大，從側面也說明AgNPs 顆粒在毒性水平上起著重要作用，AgNPs 顆粒毒性大于納米銀線及納米銀板可能是因為球形更容易在消化道中溶解[79].

3.2 表面涂層

為了提高AgNPs 的性能，可以使用不同的表面涂層.目前比較常用的表面涂層有PVP、CIT、聚乙烯醇（polyvinyl alcohol，PVA）[85?87]等.使用PEG 可以降低AgNPs 顆粒表面能，從而增加其膠體穩定性[88]；CIT 具有低分子量，并通過靜電斥力保護AgNPs；親水性的PVP 具有空間穩定性[89].不同表面涂層AgNPs 對無脊椎動物毒性大小也不一樣.Hou 等通過大型溞的急性毒性實驗，發現CIT-AgNPs 的LC50比PVP-AgNPs 的LC50更低，說明CIT 包覆的AgNPs 毒性更大，這可能是因為PVP 涂層的穩定性使Ag 能夠被完整的封裝，減少了Ag+的釋放，因而AgNPs 毒性降低[44].

3.3 環境

由于生態系統中物理化學等變量的變化，生物體對AgNPs 的可變敏感性正受到越來越多的關注[43].例如環境中不同的光照、鹽度、pH、溫度、暴露介質等，都可能影響AgNPs 對無脊椎動物的毒性.Lish 等研究了AgNPs 在不同環境條件下對鹵蟲無節幼體的急性毒性效應，發現環境條件可以改變AgNPs 的穩定性，使其穩定性下降，導致更多的Ag+釋放，從而導致其毒性的改變[83].Conine 等則是研究了不同湖泊水中AgNPs 對水蚤的毒性效應，發現顆粒物C:N 和C:P 比率、總溶解有機碳（dissolved organic carbon，DOC）、總溶解磷（total dissolved phosphate，TDP），都會影響AgNPs 的濃度，從而對水蚤產生毒性影響，C:N 是影響水蚤存活率的最大因素[43].在土壤暴露中，通過活性污泥的加入，可以使部分AgNPs 轉變成AgS，而AgS 具有高的化學穩定性，從而降低了AgNPs 的毒性；并且由于活性污泥中含有豐富的食物，導致蚯蚓的體重增加了34%—176%[90].

3.4 暴露途徑

AgNPs 不同的暴露途徑對無脊椎動物的毒性也不同.Wang 研究了水體暴露和飲食暴露兩種途徑下AgNPs 對大型溞生長、繁殖、生物累積等指標的影響.發現在生長和繁殖實驗中，水體暴露下的AgNPs 會刺激大型溞的繁殖和蛻皮，在高濃度下會顯著抑制大型溞的繁殖和蛻皮，而飲食暴露下的AgNPs 在所有濃度下都會顯著抑制大型溞的繁殖和生長；在生物累積實驗中，水體暴露下AgNPs 在最低濃度時，在大型溞體內累積量達到最高，之后隨AgNPs 暴露濃度增加而累積量減少；飲食暴露下，大型溞體內Ag+量隨著AgNPs 暴露濃度增加而增加[28].同樣，Qing 研究了土壤相暴露和食物相暴露下AgNPs 對蝸牛毒性的影響，發現食物相中AgNPs 的毒性大于土壤相中AgNPs 的毒性；在相同AgNPs 濃度下，食物相導致蝸牛消化腺中脂質過氧化物（lipid hydroperoxide，LPO）含量，CAT 和SOD 活性極顯著增加，分別是土壤相的1.5、1.7、2.5 倍[17].

4 總結與展望（Conclusions and prospects）

由于AgNPs 材料的優良特性，使其被廣泛應用到農、工、醫等各種領域，而AgNPs 的毒性問題，一直是人們關心的重點.到目前為止，國內外已有很多關于AgNPs 毒性的文獻，相關實驗結果并不一致甚至自相矛盾.本文結合文獻中的相關研究結果，總結了AgNPs 對無脊椎動物的毒性效應及其影響因素.AgNPs 可以在環境和生物鏈中遷移轉化，最終累積到無脊椎動物體內，對無脊椎動物造成毒性損害，影響無脊椎動物的生長發育、破壞無脊椎動物的組織結構以及損害其系統功能.AgNPs 引起細胞氧化應激，會造成無脊椎動物DNA 損傷、線粒體損壞、染色體畸變以及細胞凋亡.此外，AgNPs 的理化性質、表面涂層、環境、暴露途徑等因素，都會影響AgNPs 對無脊椎動物的毒性大小.最后基于目前的研究提出一些展望，為AgNPs 對無脊椎動物毒性的研究提供新的思路.

（1）AgNPs 與AgNPs 溶解Ag+之間的毒性沒有研究清楚，是AgNPs 溶解Ag+所引起的毒性，還是AgNPs 與Ag+共同引起的毒性，這方面在無脊椎動物毒性機制中需要更深層的研究.

（2）生物制備AgNPs 具有反應條件溫和，綠色環保，成本低等優點，已經成為近些年研究的熱點.隨著生物合成法技術的成熟與完善，環境中生物AgNPs日益增多.無脊椎動物是生物類群和生態系統的重要組成部分，后續應加強生物AgNPs 對無脊椎動物的毒性效應研究.

（3）隨著AgNPs 被釋放到環境中，會與環境中其他污染物相互作用.可能會影響AgNPs 在環境中的理化性質和生物學活性.因此有必要加強AgNPs 與其他污染物的聯合效應及其共存特性研究.

（4）盡管目前關于AgNPs 對無脊椎動物毒性的研究在逐漸增多，但大多數研究只考慮了對無脊椎動物的急性毒性試驗.因此，需要更多的研究來確定無脊椎動物體內低濃度AgNPs 顆粒的長期影響，隔代影響，以便進行適當的安全評估和識別生物標志物.

（5）目前AgNPs 的試驗生物以水生無脊椎動物為主，如：水蚤、大型溞、貽貝等，后續應加深對陸生無脊椎動物的影響研究，為AgNPs 在土壤中的評價提供依據.

（6）需要建立評價AgNPs 對無脊椎動物單一和復合污染毒性的標準方法，以完善AgNPs 的生態毒性安全評價系統，進而便于政府規范AgNPs 的生產和使用.