HPLC 法測定鮭降鈣素鼻用噴霧劑中有關物質

邢文靜，伏圣青，韓曉捷

天津市藥品檢驗研究院，天津 300070

鮭降鈣素是一種骨代謝調節藥，能調節成骨細胞活性，抑制體內破骨細胞，還能改善患者骨吸收，適用于骨質疏松癥、骨質減少引起的骨痛、畸形性骨炎、高血鈣癥和神經營養不良癥等[1-5]。鮭降鈣素制劑主要有鮭降鈣素注射液、鮭降鈣素鼻用噴霧劑，而鮭降鈣素鼻用噴霧劑比鮭降鈣素注射液更易被患者接受?！吨袊幍洹?020 年版二部收載了鮭降鈣素、鮭降鈣素注射液和注射用鮭降鈣素的質量標準[6]。在已收載的制劑中有關物質檢查項下，對降鈣素C 進行了限定，并未對其他具體雜質做出要求?，F行版《歐洲藥典》（EP11）[7]、《美國藥典》（USP43）[8]和《日本藥典》（JP18）[9]收載了鮭降鈣素，并且EP11 中將N-乙酰半胱氨酰鮭降鈣素、9-D-亮氨酸鮭降鈣素、去-22-酪氨酸鮭降鈣素作為已知雜質進行了控制，明確了其限度。鮭降鈣素作為人工合成多肽類藥物，具有不穩定、易降解的特點，需對鮭降鈣素產品中雜質進行嚴格控制[10]。本實驗采用高效液相色譜-加校正因子的主成分自身對照法測定了鮭降鈣素鼻用噴霧劑中雜質，方法準確、可靠、專屬性強，為鮭降鈣素鼻用噴霧劑的質量控制提供參考依據。

1 儀器與試驗

Waters e2695 高效液相色譜儀，配備2489 紫外檢測器；梅特勒托利多XS205 十萬分之一電子天平。

鮭降鈣素對照品（批號140665-201804，質量分數89.7%，中國食品藥品檢定研究院）；降鈣素C 對照品（批號140808-201802，質量分數88.2%，中國食品藥品檢定研究院）；N-乙酰半胱氨酰鮭降鈣素（雜質A，批號1086210-R06010，質量分數100%，USP）；9-D-亮氨酸鮭降鈣素（雜質B，批號4022-001A1，質量分數96.8%，TLC）；去-22-酪氨酸鮭降鈣素（雜質C，批號4022-061A1，質量分數93.5%，TLC）；鮭降鈣素鼻用噴霧劑樣品來自瑞士Future Health Pharma GmbH 公司，規格2 mL∶4 400 IU，批號分別為DH100102、DH100103、DH 100108；四甲基氫氧化銨25%水溶液（分析純），磷酸（分析純），乙腈（色譜純），超純水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

Macherey-Nagel Nucleosil 100-5 C18AB 色譜柱（250 mm×4.0 mm，5 μm）；以0.04 mol/L 四甲基氫氧化銨溶液（用磷酸調pH 2.5）–乙腈（9∶1）為流動相A，以0.04 mol/L 四甲基氫氧化銨溶液（用磷酸調pH 2.5）–乙腈（4∶6）為流動相B，梯度洗脫（0～30 min，流動相A 從72%降至50%；30～35 min，流動相A 從50%降至5%；35～45 min，流動相A 保持5%；45～49 min，流動相A 從5%增加至72%；49～60 min，流動相A 保持72%）；檢測波長為220 nm；體積流量為1.0 mL/min；進樣量為100 μL；柱溫為65 ℃；樣品室溫度：10 ℃。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品貯備液的制備 精密稱取鮭降鈣素、降鈣素C、雜質A、雜質B、雜質C 對照品各10 mg，分別置20 mL 量瓶中，加流動相A 溶解，分別制成0.5 mg/mL 的對照品貯備液。

2.2.2 雜質定位溶液的制備 分別精密量取降鈣素C、雜質A、雜質B、雜質C 對照品貯備液適量，加流動相A 稀釋，均制成5 μg/mL 雜質定位溶液。

2.2.3 系統適用性溶液的制備 分別精密量取鮭降鈣素、降鈣素C、雜質A、雜質B、雜質C 對照品貯備液各1 mL，置同一個100 mL 量瓶中，加流動相A 稀釋至刻度，即得。

2.2.4 混合對照品溶液的制備 分別精密量取降鈣素C、雜質A、雜質B、雜質C 對照品貯備液各1 mL，置于同一個100 mL 量瓶中，用流動相A 稀釋至刻度，制成含各雜質對照品約5 μg/mL 的混合對照品溶液。

2.2.5 供試品溶液的制備 精密稱取鮭降鈣素鼻用噴霧劑5 mL，置10 mL 量瓶中，加流動相A 稀釋至刻度，即得。

2.2.6 自身對照溶液 精密量取鮭降鈣素鼻用噴霧劑5 mL，置200 mL 量瓶中，用流動相A 稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.7 空白輔料溶液 按鮭降鈣素鼻用噴霧劑的處方稱取各輔料適量，溶解，制備空白輔料溶液。

2.3 專屬性和系統適用性試驗

2.3.1 系統適用性試驗 分別取空白輔料溶液、降鈣素C、雜質A、雜質B、雜質C 雜質定位溶液、系統適用性溶液、鮭降鈣素鼻用噴霧劑供試品溶液（批號DH100102）各100 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，見圖1。結果顯示流動相A 和空白輔料對主峰和雜質測定均無干擾；各成分分離良好，鮭降鈣素主峰與雜質A 分離度為4.0，符合要求。降鈣素C、雜質A、雜質B、雜質C 相對保留時間分別為0.5～0.6、1.15、0.8、0.9。

圖1 空白輔料溶液（A）、系統適用性試驗溶液（B）和鮭降鈣素鼻用噴霧劑（C）HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of pharmaceutical excipients solution (A),system suitability solution (B),and Salmon Calcitonin Nasal Spray (C)

2.3.2 破壞實驗 分別取鮭降鈣素鼻用噴霧劑5 mL，置10 mL 量瓶中，進行高溫（60 ℃放置6 h）、強酸（1 mol/L 鹽酸溶液1 mL 放置1 h，中和）、強堿（1 mol/L 氫氧化鈉溶液1 mL 放置10 min，中和）、強光照（4 500 lx 下照射48 h）、強氧化（加入30%雙氧水1 mL 放置1 h）作用后，分別加流動相A 稀釋至刻度，進樣測定。結果鮭降鈣素鼻用噴霧在光照、強酸、氧化條件下相對穩定；在高溫條件下，降鈣素C、雜質B、雜質C 有明顯增加，雜質A 略有增加；在強堿條件下，雜質B、雜質C 有明顯增加，各主要降解雜質之間、雜質與主峰之間均能有效分離，且物料平衡，說明此方法對雜質能有效分離和檢測。

2.4 校正因子和線性范圍考察試驗

精密量取鮭降鈣素、降鈣素C、雜質A、雜質B、雜質C 對照品貯備液適量，加流動相A 分別均稀釋制成0.20、1.25、2.5、3.75、5、6.25、7.50 μg/mL對照品系列溶液，進樣測定，記錄色譜圖。以質量濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，進行線性回歸，計算回歸方程，用標準曲線法計算雜質的校正因子，結果見表1。結果表明，鮭降鈣素及其雜質均在0.20～7.50 μg/mL 線性關系良好，雜質A、B、C的校正因子均超出0.90～1.10，因此有關物質檢查項下已知雜質可按加校正因子的主成分自身對照法計算。

表1 線性關系和校正因子Table 1 Linear relationship and correction factor

2.5 檢測限和定量限考察

取對照品貯備液，用流動相A 逐步稀釋，進樣測定，記錄色譜圖，以信噪比為3 時對應的質量濃度作為檢測限，以信噪比為10 時對應的質量濃度作為定量限，結果鮭降鈣素、降鈣素C、雜質A、雜質B、雜質C 的檢測限分別為25、26、23、29、25 ng，定量限分別為83、51、46、57、82 ng。

2.6 重復性試驗

取鮭降鈣素鼻用噴霧劑（批號DH100102），平行6 份，制備自身對照溶液和供試品溶液，進樣測定，記錄色譜圖，結果降鈣素C、雜質A、雜質C的平均質量濃度分別為0.80%、0.67%、0.17%，RSD值分別為0.9%、1.1%、1.6%。雜質B 低于定量限。

2.7 精密度試驗

2.7.1 儀器精密度試驗 取系統適用性溶液，連續進樣6 次，計算峰面積，結果鮭降鈣素、降鈣素C、雜質A、雜質B、雜質C 峰面積的RSD 值分別為0.6%、0.7%、1.3%、0.9%、0.8%。

2.7.2 中間精密度試驗 分別以不同人員（2 人）、不同時間、不同儀器按2.6 項下方法分析。結果降鈣素C、雜質A、雜質C 的平均質量濃度的RSD 值分別為1.0%、1.3%、1.5%。雜質B 低于定量限。

2.8 穩定性試驗

取系統適用性溶液于10 ℃放置，分別于0、2、4、8、20 h 進樣測定，結果降鈣素C、雜質A、雜質B、雜質C 峰面積的RSD 值分別為0.5%、1.0%、1.3%、0.8%，表明供試品溶液于10 ℃放置時20 h 內穩定性良好。

2.9 回收率試驗

精密取鮭降鈣素鼻用噴霧劑（批號DH100102）5 mL，置10 mL 量瓶中，分為3 組，分別加入混合對照品溶液80、100、120 μL，加入流動相A 至刻度，制成加標濃度相當于雜質限度80%、100%、120%的溶液，每個質量濃度制備3 份，進樣測定，計算回收率，結果降鈣素C、雜質A、雜質B、雜質C 平均回收率分別為98.1%、98.9%、100.5%、99.7%，RSD 值分別為1.6%、1.5%、1.0%、1.1%。

2.10 耐用性試驗

考察在流動相pH 值±0.2、體積流量變化±0.1 mL/min、柱溫變化±2 ℃、波長變化±2 nm、流動相比例變化±2%的條件下對測定結果的影響。結果在各條件下系統適用性均符合要求，各已知雜質測定結果RSD 值均小于10%，未知雜質總量測定結果的RSD 值小于10%，提示色譜系統參數耐用性良好。

2.11 樣品測定

取鮭降鈣素鼻用噴霧劑3 批，分別制備混合對照品溶液、供試品溶液和自身對照溶液，進樣測定，分別按加校正因子的主成分自身對照法（方法Ⅰ）和主成分外標法（方法Ⅱ）計算有關物質的質量濃度，結果見表2。參考《歐洲藥典》（EP11）、《美國藥典》（USP43）中對已知雜質、單個未知雜質和總雜質的限度要求，對3 批鮭降鈣素鼻用噴霧劑樣品進行了檢測，結果均符合標準規定。

表2 鮭降鈣素鼻用噴霧劑中有關物質測定結果（n=2）Table 2 Determination of related substances in in Salmon Calcitonin Nasal Spray (n=2)

3 討論

根據現行版《歐洲藥典》（EP11）、《美國藥典》（USP43）中鮭降鈣素、鮭降鈣素注射液和注射用鮭降鈣素中有關物質檢查的色譜條件，色譜柱均采用C18柱，流動相均采用四甲基氫氧化銨溶液–乙腈體系，檢測波長均為220 nm，柱溫均為65 ℃。經過色譜條件的篩選和優化，調整流動相比例達到較好的雜質分離效果，并排除輔料干擾，同時分別考察了Vydac C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Macherey-Nagel Nucleosil 100-5 C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Macherey-Nagel Nucleosil 100-5 C18AB（250 mm×4.0 mm，5 μm）3 種不同品牌型號的C18色譜柱，所得圖譜顯示主峰與降鈣素C、雜質A、雜質B、雜質C 以及其他相鄰雜質的分離度均符合要求，方法適用性較強。

《中國藥典》2020 年版二部、《歐洲藥典》（EP11）、《美國藥典》（USP43）中均采用峰面積歸一化法控制鮭降鈣素中有關物質的限量，但由于各雜質與主成分的響應因子不同，采用峰面積歸一化法測定雜質結果會產生誤差。本實驗以鮭降鈣素為對照，以主成分回歸直線斜率與雜質回歸直線斜率的比計算校正因子，用于校正雜質的實測峰面積。結果采用加校正因子的主成分自身對照法可更準確地測定鮭降鈣素鼻用噴霧劑中有關物質。因此，在雜質對照品較難獲得或造價過高的情況下，引入校正因子更便捷準確。

現行版各國藥典中均規定鮭降鈣素中有關物質的限量，《歐洲藥典》（EP11）中明確了已知雜質的限度，《美國藥典》（USP43）收錄了鮭降鈣素鼻用制劑，但并未規定制劑中有關物質限度。本實驗規定了4 種已知雜質，其中雜質A、B、C 為鮭降鈣素固相合成中引入的雜質，而降鈣素C 為鮭降鈣素鼻用噴霧劑中主要降解雜質，降鈣素C 含量變化是表征該制劑穩定性的重要指標。

綜上，本研究建立了鮭降鈣素鼻用噴霧劑中有關物質檢查的HPLC 測定法，測定了已知雜質降鈣素C 和雜質A、B、C，并進行了方法學驗證，結果表明，該方法簡便、快速，可作為鮭降鈣素鼻用噴霧劑中有關物質的檢測方法。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突