膽固醇代謝組學測序篩選肝細胞癌術后復發風險及預后標志物

陳默，朱洪旭，王魯，許蔚起

復旦大學附屬腫瘤醫院 肝臟外科，上海 200032

肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是全球范圍內最常見的癌癥之一，中國HCC的發病率始終處于惡性腫瘤前列，給我國居民生命健康和醫藥衛生事業帶來嚴重威脅與沉重負擔[1-2]。盡管先進的影像學檢查的應用極大提高了HCC的檢出率，但HCC早期轉移、高復發率的特性依然使得影像學檢查滯后于疾病進展狀態，多數患者確診時尚無法明確腫瘤進展階段，缺乏對預后的可靠預測，影響對治療手段的選擇與醫療決策[3-4]。因此，探索與腫瘤生物學行為密切相關且可檢測的生物標志物，對于評估HCC腫瘤進展階段、預測患者預后等具有重要意義。代謝重編程是腫瘤發生發展過程中的必由階段，是腫瘤生物學行為的重要標志[5]。膽固醇代謝重編程是HCC特征性的代謝重塑模式，被多項研究證實通過參與促HCC腫瘤細胞增殖與侵襲、促腫瘤血管生成、重塑HCC抑制性免疫微環境等方式密切調控HCC腫瘤進展的各個階段[5-8]，提示膽固醇代謝底物實時代謝水平對于HCC腫瘤狀態具有潛在的重要提示價值。通過大規模高通量測序分析，篩選與腫瘤生物學行為及HCC患者生存預后密切相關的差異性代謝底物，可能會發現更可靠和精確的預后指標，從而幫助醫師更好地預測HCC患者的預后，制定個體化的治療方案，并提高患者的生存率。

1 資料和方法

1.1 一般資料

對2020年2月1日至2020年3月31日在復旦大學附屬腫瘤醫院行手術治療的46例HCC患者手術病理留取的肝癌組織與癌旁組織進行回顧性研究，患者年齡19～75歲，均經手術病理學檢查確診HCC，臨床資料及隨訪資料完整。

1.2 檢測方法

1.2.1 代謝物提?。?）取樣本100 mg于2 mL管中，加入750 μL氯仿甲醇混合溶液（2∶1，-20 ℃），渦旋振蕩30 s；（2）放入2顆鋼珠，放入組織研磨器中，55 Hz研磨90 s；（3）冰上放置40 min，加入190 μLH2O，渦旋振蕩30 s，冰上靜置10 min；（4）12 000 r/min室溫離心5 min，取下層液300 μL，轉移至2 mL離心管中；（5）再加入500 μL氯仿甲醇混合溶液（2∶1，-20 ℃），渦旋振蕩30 s；（6）12 000 r/min室溫離心5 min，取下層液400 μL，轉移至2 mL離心管中，樣品用真空離心濃縮儀濃縮；（7）用200 μL異丙醇溶解樣品，0.22 μm膜過濾，得到待測樣本，進行液相色譜-質譜（LC-MS）上機檢測。

1.2.2 色譜分析 儀器采用ThermoVanquish，使用ACQUITYUPLC?BEHC 181.7 μm（2.1 mm×100 mm）色譜柱，自動進樣器溫度設為8 ℃，以0.25 mL/min的流速、50 ℃的柱溫、進樣2 μL進行梯度洗脫，流動相為乙腈∶水=60∶40（0.1%甲酸+10 mmol/L甲酸銨）（A2）-異丙醇∶乙腈=90∶10（0.1%甲酸+10 mmol/L甲酸銨）（B2）。梯度洗脫程序為0～5 min，70%～57% A2；5～5.1 min，57%～50% A2；5.1～14 min，50%～30% A2；14～14.1 min，30% A2；14.1～21 min，30%～1% A2；21～24 min，1% A2；24～24.1 min，1%～70% A2；24.1～28 min，70% A2。

1.2.3 質譜分析 儀器使用Thermo Q Exactive，電噴霧離子源（ESI），正負離子電離模式；正離子噴霧電壓為3.5 kV，負離子噴霧電壓為2.5 kV，鞘氣30 arb，輔助氣10 arb。毛細管溫度325 ℃，以分辨率35 000進行全掃描，掃描范圍150～2 000，并采用HCD進行二級裂解，碰撞電壓為30 eV，同時采用動態排除去除無必要的MS/MS信息。

1.3 統計學分析

本研究對于膽固醇代謝組學測序分析均基于R語言，工作平臺為R-studio，肝癌組織與癌旁組織膽固醇代謝底物濃度差異性分析采用配對t檢驗，組間底物濃度聚類分析通過pheatmap包完成。無進展生存期（progression free survival，PFS）及總體生存期（overall survival，OS）分析采用Kaplan-Meier生存分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 HCC癌組織內差異性上調膽固醇代謝物篩選

本研究共納入46例符合標準的HCC患者，性別比例為男∶女=37∶9，年齡大于60歲的老年患者27例，BMI≥22.6 kg/m2的超重患者7例；根據術后病理結果，低分化腫瘤（M 0～2）30例，發生微血管侵犯（microvascular invasion，MVI）28例。通過對比肝癌組織與癌旁組織膽固醇代謝通路各代謝物水平，共篩選出含量在肝癌組織中顯著上調（P＜0.05）的膽固醇通路代謝物12個，分別為ChE（36:6）、ChE（26:1）、ChE（32:5）、ChE（24:0）、ChE（24:1）、ChE（26:2）、ChE（36:3）、ChE（34:5）、ChE（26:3）、ChE（22:0）、ChE（30:4）、ChE（28:5），均屬于膽固醇酯類（圖1、表1）。

表1 HCC瘤內差異性上調膽固醇代謝物定量水平

圖1 HCC病例肝癌組織與癌旁組織對比差異性膽固醇代謝物篩選

2.2 基于組織病理學風險因素對差異性膽固醇代謝物的聚類分析

為了進一步探索與腫瘤生物學行為密切關聯的膽固醇代謝標志物，發現對腫瘤惡性程度和預后預期有重要價值的代謝指標，我們根據病例術后病理結果，以腫瘤分化程度及MVI兩個評價腫瘤生物學行為和提示腫瘤復發風險的重要指標為分組依據，將46例HCC病例分別分為低分化組（未分化、1～2級）和高分化組（3～4級）、有MVI組和無MVI組，對各組肝癌組織與癌旁組織膽固醇代謝底物差異性表達水平進行聚類分析，結果提示腫瘤分化程度與是否發生MVI的HCC瘤內特定膽固醇代謝物濃度存在差異性聚類的傾向（圖2、圖3）。

圖2 基于MVI分組的膽固醇代謝物濃度差異性聚類分析

圖3 基于腫瘤分化程度分組的膽固醇代謝物濃度差異性聚類分析

2.3 結合組織病理學分級對HCC膽固醇代謝標志物的篩選

為了進一步明確HCC瘤內特異性上調的膽固醇代謝通路底物與腫瘤生物學行為的聯系，我們橫向對比了上述12個膽固醇酯類底物在高/低分化組與有/無MVI組的濃度差異，結果提示，膽固醇酯類代謝物ChE（32:5）在低分化肝癌組織、有MVI的肝癌組織均表現出有統計學意義的差異性上調，提示其代謝活動與HCC腫瘤生物學行為密切相關（圖4）。

圖4 基于MVI（A）和腫瘤分化分級（B）分組對肝癌組織中差異性膽固醇代謝物的定量分析

2.4 膽固醇代謝標志物ChE（32:5）對HCC復發與生存預后的提示意義

為了探索ChE（32:5）在與HCC惡性程度相關的同時，是否具有提示HCC患者預后的潛在價值，我們將ChE（32:5）在肝癌組織中顯著高于癌旁組織的病例作為高膽固醇組（n=25），ChE（32:5）在肝癌組織與癌旁組織差異無統計學意義的病例作為低膽固醇組（n=21），并分別將腫瘤復發與生存結局作為結局事件，對比兩組患者PFS和OS，結果提示高膽固醇組中位PFS（6個月vs12個月，P=0.041）與中位OS（14 個月vs16 個月，P=0.049）均低于低膽固醇組，證實肝癌組織中ChE（32:5）水平作為腫瘤復發及患者總體生存預后指標的重要價值（圖5）。

圖5 基于ChE（32:5）水平對HCC無復發生存率（A）及總體生存率（B）的生存曲線

3 討論

作為調節脂質代謝穩態的重要器官，肝臟膽固醇代謝的失調被認為是HCC腫瘤發生發展的驅動因素，與膽固醇調節失常相關的基礎疾?。òǚ逝职Y、糖尿病等）也被普遍認為是HCC的風險因素[9]。膽固醇對于維持細胞膜的完整性和流動性顯得更為重要，對于具有高度增殖性質的癌細胞而言是必需的。多項研究表明血清及瘤內膽固醇通過重塑HCC抑制性免疫微環境、加劇效應免疫細胞線粒體損傷、促進氧化應激、刺激腫瘤細胞活性等多方面影響HCC腫瘤生物學進展[10-12]?；诙囗椗R床隊列的薈萃分析顯示他汀類藥物（降脂藥）的使用在中西方人群中均與HCC的風險降低顯著相關[13]，提示膽固醇與HCC腫瘤發生發展的密切聯系。

膽固醇酯是胞內及血漿游離膽固醇在脂酰輔酶A膽固醇脂酰轉移酶和卵磷脂膽固醇脂酰轉移酶催化下與脂肪酸的結合產物，在HCC發展過程中，脂肪酸是調節代謝的信號前體，同時也是腫瘤細胞侵入和血管生成的能量來源，影響脂肪酸水平膽固醇酯作為膽固醇代謝底物影響HCC進展的重要途徑[14]。清華大學陳立功團隊[15]報道了替代性激活膽固醇合成通路促進脂肪酸剝奪小鼠HCC腫瘤持續進展的機制研究，武漢大學李友軍團隊[16]則報道了P53基因缺失通過調節膽固醇酯化，影響膽固醇酯合成從而促HCC惡化進展的相關研究，提示膽固醇酯代謝水平廣泛參與調節HCC腫瘤生物學行為，具有提示腫瘤進展級別與惡性程度的潛在價值。

MVI指微靜脈內有成團的癌細胞且周圍有明確的內皮細胞環繞，具體程度評估分為三個級別：（1）M0，未發現MVI；（2）M1，近癌旁肝組織中出現且不超過5個MVI；（3）M2，近癌旁肝組織中出現至少6 個MVI。MVI的發生常見于HCC病例，是不良預后的風險因素，也是被廣泛認為的HCC術后復發的高危因素之一[17]。MVI的病理學評估不僅應用于肝移植手術指征判斷、肝切除手術方式選擇、腫瘤R0切除范圍判定，還是術后輔助治療與綜合治療決策的重要證據[18]。但MVI評估必須基于完整手術切除標本，同時需要依靠高水平的病理診斷協作，因此探索與MVI發生顯著相關且簡便易檢測的代謝標志物，一方面可以為MVI的病理學評估提供有價值的輔助參考，同時為HCC患者復發與最終預后、手術干預與綜合治療決策提供潛在的預測標志物。

ChE（32:5）是含32 個碳原子的膽固醇酯（分子量為856.7），既往國內外尚無相關研究證實其與HCC腫瘤生物學及臨床預后的相關性報道。本研究基于對HCC病例的腫瘤組織標本膽固醇組代謝底物檢測分析，篩選出ChE（32:5）在低分化與發生MVI的HCC腫瘤組織內顯著上調，并驗證了ChE（32:5）表達水平對HCC腫瘤復發與總體預后的預測價值，提示其作為簡易可得的臨床指標，具有較好的實用性、推廣性和臨床診斷價值。