奶牛早期妊娠診斷蛋白的研究

張馨蕊,付 予,楊 卓,沈文娟,陶金忠

(寧夏大學動物科技學院,銀川 750021)

奶牛繁殖力高低會影響產奶量與產犢效率,進而影響養殖場經濟效益[1],而奶牛胚胎早期死亡是造成奶牛場經濟損失的重要原因之一。妊娠是一個高度復雜的生物學過程,雖然反芻動物的受精率可達85%～95%[2],但胚胎發育過程中,由于胚胎因素、子宮因素以及胚胎與子宮間相互作用異常,導致相當大比例胚胎無法發育至足月,出現大量胚胎丟失[3];研究顯示,大多數胚胎丟失發生在配種后1周的囊胚形成期和授精后前17 d的母體妊娠識別期[4-5]。配種后第1周內胚胎發育過程包括卵母細胞受精形成受精卵、胚胎基因組激活、胚胎由單個細胞經歷多次增殖分化在第7天形成囊胚[6]。Berg等[7]研究顯示,奶牛第7天的妊娠率為70.9%,其中受精失敗(15.8%)和桑椹胚期前發育停滯(10.3%)是導致第1周妊娠失敗的主要原因。如果這個階段妊娠失敗,母體不能收到妊娠信號,黃體期不延長,奶牛在配種后一個情期內將再次發情[8]。而在配種后8～17 d胚胎伸長和妊娠識別的時期[9],奶牛的胚胎丟失率有40%,其中在妊娠識別期及后期,因為胚胎發育受阻或各種因素引起胚胎死亡,會導致干擾素-τ(IFN-τ)分泌減少,減少的IFN-τ仍能使奶牛黃體期延長,使得再次發情配種的時間間隔延長[10]。因此,在人工授精后一定時間內尋找妊娠差異標志物,對于確定奶牛是否空懷,提高奶牛繁殖效益至關重要。

母體與胎兒之間的相互作用使得早期妊娠母牛與空懷母牛相關代謝存在差異,從而致使其生理和生化指標有所不同[11]。目前已有多種檢測奶牛妊娠的方法,直接方法包括直腸觸診、超聲檢查等。直腸觸診是在奶牛配種后的第20天通過觸摸卵巢的形狀及形態變化進行篩查,受精后第30天以后的檢查準確性超過80%[12];超聲檢查是當在子宮腔內識別到一個形狀不規則、無回聲的黑色斑點時,則初步判斷為奶牛妊娠,在配種后第17天準確性可達到80.4%[13],第33天及以后可達到100%;這兩種方法進行妊娠診斷時只有當胚胎發育至一定階段時才可確定妊娠,配種后間隔時間越長其診斷的準確率越高[14]。

間接方法包括放射性免疫分析法(RIA)、酶聯免疫吸附測定(ELISA)、孕酮乳膠凝集試驗等方法定量分析[15],蘇妮等[16]利用孕酮對配種后21～26 d奶牛進行妊娠檢測準確性達到84.31%。血小板計數法的原理是血小板活化因子致使母體血小板減少,李助南等[17]據此對奶牛進行妊娠診斷,準確性達到86.36%。羅芳和陶金忠[18]利用UHPLC-QTOF-MS代謝組學方法在授精后第17天篩選出丙氨酸-亮氨酸、甘氨酸、脯氨酸、L-正亮氨酸、DL-苯丙氨酸、肌氨酸、吡咯-2-羧酸和纈氨酸-蛋氨酸作為奶牛妊娠識別階段潛在的生物標志物。Forde等[19]研究顯示,與發情期牛相比,妊娠第16天小母牛體內的纈氨酸濃度更高。然而,部分方法仍然存在一定的局限性。

因此,篩選妊娠期間特異的蛋白,用于妊娠檢測變得尤為重要。目前蛋白質分離和鑒定技術領域的不斷更新也加速了用于發現蛋白質生物標志物的生物液體差異蛋白的研究,其相關分子技術在動物研究中高要求應用與重大進展也為確定特定且敏感的早期妊娠診斷的生物標志物打開了新的窗口[20]。本文綜述了國內外有關奶牛早期妊娠中血液、尿液、乳液等生物體液差異蛋白,以期找到能用于早期妊娠識別階段的潛在蛋白生物標志物。

1 早期妊娠診斷相關蛋白研究

目前利用生物體液中的與妊娠相關的蛋白質包括早孕因子(early pregnancy factor, EPF)、妊娠相關糖蛋白(pregnancy associated glycoprotein, PAG)、妊娠特異性蛋白B(pregnancy specific protein B, PSPB),此外還有一些其他相關蛋白在奶牛妊娠早期發生表達變化(表1)。

表1 妊娠相關蛋白在奶牛早孕診斷中的應用

1.1 早孕因子

EPF最早在孕畜體內血清中出現,并在胚胎發育期間具有抑制母體免疫應答、維持妊娠等功能[25]。EPF是一種與妊娠相關的疾病免疫抑制蛋白,在人類[26]、綿羊、牛、豬[27]等動物中均可以檢測到。對于奶牛來說,在受精后24 h可以在乳汁與血清中檢測到EPF。在妊娠結束或胚胎死亡后24～48 h EPF的含量會迅速下降至消失,因此可以檢測奶牛乳汁或是血清中EPF含量的變化以檢測早期胚胎發育狀況與早期妊娠診斷[28]。

目前常用玫瑰花環抑制試驗(RIT)與硫酸銅檢測法測定孕畜EPF濃度。EPF能通過補體抑制奶牛T淋巴細胞和動物紅細胞的結合而形成玫瑰花樣細胞團,利用玫瑰花環抑制滴度(R值)從而間接地測定血清中EPF的含量,其靈敏度較高,在奶牛受精后第7天進行妊娠診斷[29]。Laleh等[30]的研究表明測定的RIT分數高于8可確認為妊娠,低于4可認為未妊娠。張宏剛等[31]采用RIT對17頭人工授精孕牛血清中EPF進行檢測,結果顯示妊娠率為58.82%。Fan等[21]發現,孕婦的血液通過RIT用于超早孕診斷,準確率達到88.6%。硫酸銅檢測法是硫酸根可以與EPF發生凝集反應,當妊娠奶牛乳液中EPF含量較高時,將出現云霧狀沉淀,從而確定牛乳中EPF含量[32]。白云[22]對85頭奶牛進行硫酸銅檢測,在第7天、第16天妊娠準確率分別達到72.41%、80.60%,因此,測定EPF活性對奶牛進行早期妊娠診斷、監測胚胎附植前胚胎早期發育情況、確定預測胚胎生長發育具有重要意義[33]。

1.2 干擾素-τ

IFN-τ是由反芻動物胚胎滋養層細胞分泌產生的I型干擾素,為糖蛋白,含有172個氨基酸,分子量在19～24 ku之間[34]。IFN-τ在奶牛受精后的7～28 d內產生,在妊娠18～20 d是IFN-τ分泌的峰值[35],從第21天開始表達量逐漸下降,直至胚胎與母體子宮建立聯系后不再分泌。在囊胚延長期間,滋養外胚層細胞分泌的IFN-τ進入子宮腔,其在子宮外組織和外周血液循環中的水平非常低。由于IFN-τ通過阻斷PGF2α的釋放,從而抑制黃體的溶解,以維持孕酮的分泌達到維持妊娠的目的[36],因此IFN-τ被認為是母體識別妊娠的信號,為母體識別妊娠的重要關鍵分子[9]。除了抗黃體溶解作用外,IFN-τ還以旁分泌方式作用于子宮內膜,誘導增強干擾素刺激基因(interferon-stimulated genes, ISGs)的表達。此外,IFN-τ還具抗增殖、抗炎、抗病毒、妊娠免疫調節等作用[37-38]。

在未妊娠母牛中,子宮內膜組織IFN-τ基因的轉錄水平較低,故對其在子宮內膜組織中的表達進行蛋白水平檢測意義較低,但在妊娠初期子宮內膜中IFN-τ的表達與未妊娠時相比顯著升高,這可能是由于胚胎滋養層中IFN-τ刺激因子對母體子宮內膜IFN-τ的轉錄產生了一定的影響,但IFN-τ在轉錄后不會被翻譯或表達[39]。

此外,在子宮內膜基質細胞和腺上皮細胞中,IFN-τ還作用于子宮內膜以誘導或增強許多基因的表達,這些基因主要用于調節植入過程中的子宮容受性和胚胎發育,如干擾素刺激基因15(interferon-stimulated gene 15,ISG15)、黏病毒抗性蛋白2(myxovirus resistance 2,MX2)、2-5寡肽-合酶(2,5 oligoadenylates synthetase 1,OAS1)等基因均在奶牛的早期妊娠期出現了差異表達[40],因此在奶牛的外周血白細胞中ISGs的檢測被用作預測妊娠早期IFN-τ的產生以檢測孕體,該推測已在總白細胞[41]、外周血單核細胞[42]、外周血多形核細胞[43]中得到驗證。一般來說,在奶牛妊娠的18～20 d之間發現妊娠和未妊娠母體之間存在顯著差異的陽性妊娠診斷的準確性為70%～90%[39];Yoshino等[44]通過檢測外周血白細胞ISGs的表達量,對受精3周的日本黑牛進行早期妊娠診斷,陽性診斷準確率和陰性診斷準確率分別為80%和94.6%。盡管已有大量試驗利用ISGs作為妊娠診斷進行研究,但高比例的假陽性和假陰性結果顯著降低了該技術的準確性[45]。ISGs作為來自孕體的間接刺激對于早期妊娠診斷至關重要,因此有必要進一步對技術進行調整研究,以提高其準確性和特異性,從而用于監測妊娠早期胚胎存活率。

1.3 妊娠相關糖蛋白

在偶蹄類物種中,PAG是公認的妊娠標志物。PAG是哺乳動物在妊娠期間由胎盤的滋養層雙核細胞所表達出來的一種不太活躍的酶,屬于天冬氨酸蛋白酶家族的非活性成員。其功能包括激活潛在的生長因子、絨毛-子宮內膜邊界的細胞黏附、母體免疫系統調節和黃體營養功能[46]。

在人工授精后15～22 d,一些妊娠奶牛的血清中就可以檢測到PAG[47]。在奶牛妊娠第22天PAG水平高于2 ng·mL-1,這時妊娠奶牛與未妊娠奶牛PAG水平存在顯著差異[48]。但由于該蛋白在奶牛的血液中濃度低,因此可從28～30 d進行早期妊娠診斷以得到更準確的結果[49]?；诖?Green等[24],以及Friedrich和Holtz[50]研究出第一個夾心ELISA用于測定PAG濃度,在定時人工授精后26～58 d,PAG ELISA檢測的靈敏度、特異性、陽性預測值和陰性預測值分別為94%～100%、77%～94.2%、90.7%～97.8%和91.2%～97.1%。Durocher等[51]發現PAG檢測的準確度不受胎次、自上次配種以來的天數和產奶水平的影響。因此,該蛋白的表達水平變化也為奶牛的早期妊娠識別提供了理論依據,PAG成為早期妊娠診斷的重要生物標志物。在定時人工授精后第7天泌乳奶牛循環PAG濃度低于1.4 ng·mL-1,胚胎移植后循環PAG濃度低于1.85 ng·mL-1,以此預測妊娠第31天的胚胎丟失準確率可高達95%[52]。目前市面上存在多種商業化的檢測方法,主要是RIA和ELISA[53],愛德士可視孕檢試劑盒是市面上常用檢測試劑盒之一,當母牛妊娠時陽性對照孔變為藍色,妊娠準確率可高達99.5%,可避免過早與胚胎直接接觸而造成流產的經濟損失[54],但PAG檢測與直接妊娠檢測相比成本較高、試驗條件要求嚴格。另外,現階段利用PAG檢測最早只能達到人工授精后第28天,從而使再次配種時間延長,養殖成本增加,因此利用PAG的檢測時間能否進一步縮短,這也是我國有關學者所要繼續研究的方向。

2 奶牛人工授精后體內蛋白組學研究

蛋白質組學技術涉及對特定細胞、組織、器官或生物體中的蛋白質功能、表達、相互作用和翻譯后修飾的廣泛研究,并且能夠鑒定其中存在的所有蛋白質,關于其最新進展常聚焦于發現更新、更靈敏的特異性蛋白以識別各細胞、組織的生物學階段。奶牛妊娠時由于胚胎與母體之間的相互作用,會導致母體血液、尿液和乳液等某些蛋白表達水平發生改變,而這些變化可作為判斷奶牛是否妊娠的重要指標?？紤]到與動物生產的經濟效益相關,現階段已經通過蛋白質組學方法找尋來自奶牛組織、細胞、乳汁、尿液等中的各差異表達蛋白(表2)。

表2 早期妊娠的潛在蛋白生物標志物

2.1 奶牛人工授精后血液蛋白組學研究

血樣是最常用的奶牛妊娠檢測物質,Bahuguna和Sharma[55]在配種后的第0、12、16、19和22天采集了30頭薩希瓦爾牛的血液樣本,分離血清進行1D SDS PAGE分析與nano-LC-MS/MS檢測,結果顯示顯著上調的蛋白質如乳鐵蛋白、Golgin A4、MYRIP、PKD1具有作為妊娠診斷生物標志物的潛力,有望用于開發妊娠診斷試劑盒。

在所有的免疫細胞中,中性粒細胞是最先識別外來物的細胞,而在所有的血細胞中,中性粒細胞又是對子宮中胚胎最為敏感的細胞[61],其受到IFN-τ誘導后參與母體妊娠識別過程,并且有助于奶牛妊娠的建立和維持。目前有研究顯示,通過測量干擾素刺激基因如MX1、MX2、OAS1、ISG15在中性粒細胞中的表達,可以作為妊娠診斷的一種方法[62]。而為了探究這些分子的mRNA能否翻譯成蛋白且依舊可以作為早期妊娠診斷生物標志物,Panda等[56]采集奶牛人工授精后血樣并分離中性粒細胞,利用LC-MS研究蛋白表達情況,結果發現在人工授精后第18天MX1、MX2、OAS1、ISG15表達增加,同時qPCR也顯示這些分子的相對mRNA表達增加,呈正相關,表明血液中性粒細胞中的ISGs對妊娠的建立至關重要,可作為奶牛妊娠診斷的潛在生物標志物。

2.2 奶牛人工授精后乳汁蛋白組學研究

由于取樣方便且富含蛋白質,乳汁也是常用妊娠檢測物質之一[63]。Johnston等[57]利用LC-MS/MS對奶牛發情當天與妊娠第21天奶牛的乳清與富含細胞外囊泡的乳清進行蛋白組學研究,發現在乳清中APOB、SPADH1、PLIN2表達上調、LPO表達下調,在富含細胞外囊泡的乳清中PIGR、PGD、QSOX1、MUC1、SRPRA、MD2表達上調、GAPDH、FOLR1、GPRC5B和HHIPL2表達下調,因此這些蛋白質可能成為潛在的乳清生物標志物。Han等[64]利用二維凝膠電泳技術分析受精后第35天牛的乳清蛋白和未懷孕牛的乳清蛋白,發現乳鐵蛋白、乳轉鐵蛋白、alpha-1G蛋白表達量較未妊娠奶牛高,其中alpha-1G蛋白在受精后第18天顯著表達,在第39天達到峰值,并在整個妊娠期間持續分泌,因此,在這3種蛋白中,alpha-1G可能是最適合檢測奶牛早期妊娠的指標,推測可以分別在妊娠第18和35天時利用alpha-1G、乳鐵蛋白和乳轉鐵蛋白差異表達量建立相關妊娠診斷技術。

2.3 奶牛人工授精后尿液蛋白組學研究

在蛋白組學研究中,與其他體液相比,尿液被認為是研究發現生物標志物的理想生物材料來源,可用于分析家畜在妊娠、疾病等各種生理變化條件下尿蛋白的差異表達[65]。Rawat等[58]為確定用于早期妊娠檢測的潛在生物標志物,與人工授精當天的奶牛相比,在妊娠16～22 d時觀察到總共11個差異表達蛋白具有1.5倍的變化,其中有9個蛋白上調,差異蛋白包括α2-HS糖蛋白(A2HS)、AMBP、腎素、甘露聚糖結合蛋白等蛋白;同時采用非標記定量技術(LFQ)檢測的結果發現195個差異表達蛋白,其中28個蛋白表達上調,40個蛋白表達下調,篩選出在妊娠早期像性激素結合球蛋白、結合珠蛋白、Serpin B3蛋白、尿調制蛋白、組織蛋白酶抑制素、甘露聚糖結合蛋白、子宮珠蛋白、維生素結合蛋白和胰島素樣生長因子結合蛋白2等重要蛋白的表達量顯著增加,這些蛋白積極參與了與妊娠相關的各種活動,如胚胎著床、妊娠的建立和維持,因此可將其視為妊娠的生物標志物,但后續仍需進一步的驗證。

2.4 奶牛人工授精后輸卵管液蛋白組學研究

在胚胎著床之前,輸卵管液和子宮腔液是早期孕體的唯一營養來源[66],在該時期的胚胎丟失可能是由于組織營養素分泌異常而導致滋養層伸長和胚胎發育的失敗或是延遲。

奶牛胚胎發育的前3～5 d在輸卵管環境中生長,輸卵管液中蛋白質來源于輸卵管上皮分泌細胞合成分泌、從血液中滲出的蛋白質和排卵后期由卵泡或胚胎所誘導表達的蛋白質,在奶牛發情期間輸卵管液成分的變化為精子獲能、卵母細胞成熟、配子運輸、受精和早期胚胎發育提供了合適的微環境[67]。磷酸丙糖異構酶(TIM)是一種代謝酶,在糖異生和糖酵解中將磷酸二羥丙酮轉化為D-甘油醛-3-磷酸,并在胞質溶膠、細胞外間隙和外泌體中發現[68],妊娠第8天和妊娠第16天的輸卵管液中TIM的表達量顯著增加。但也有在肉牛小母牛的研究中顯示,TIM在妊娠第7天擁有活胚或死胚的牛的子宮液中表達沒有差異[69]。而包括胱抑素B、α-1抗胰蛋白酶(SERPINA1)和前列腺素還原酶1(PTGR1)在內的應激反應蛋白則被認為是胚胎發育停滯的潛在生物標志物,它們表達的增加可能與炎癥的代償調節相關[59]。

2.5 奶牛人工授精后子宮液蛋白組學研究

母牛的成功繁殖除了與胚胎本身質量有關外,也和子宮微環境密不可分[70]。子宮內膜通過子宮內膜分泌物在胚胎伸長方面發揮了關鍵作用,其內環境也會影響胚胎質量,進而影響胚胎發育[71]。通常在奶牛配種后1周內,胚胎會進入子宮。與血漿相比,奶牛子宮液中許多蛋白質的表達存在差異。有研究闡明了卵泡液對輸卵管液組成以及在子宮輸卵管交界處輸卵管液和子宮液之間液體交換的作用機制[72],進一步說明整合不同生殖器官分子研究的相關性。與未妊娠奶牛相比,在妊娠第8天和妊娠第16天,妊娠奶牛子宮腔液中TIM、膽紅素原合成酶、SERPINA1表達升高。部分蛋白也與胚胎的發育質量有關,繁殖力高的初產母牛與發情期奶牛、經產奶牛相比,SERPINA1、α2抗纖溶酶(SERPINF2)和絲氨酸蛋白酶抑制劑D1(SERPIND1)在妊娠第17天的牛子宮腔液中含量更高,研究顯示這些蛋白都參與凝血途徑[59]。

朱喆[39]利用qPCR和Western blot技術對妊娠9～20 d的奶牛子宮內膜組織進行分析,發現相較于未妊娠奶牛,妊娠早期奶牛子宮內膜組織的IFN-τ和BoLA-Ⅰ轉錄水平顯著升高,同時BoLA-Ⅰ的蛋白表達量也顯著提高,由此假設IFN-τ能夠使BoLA-Ⅰ上調表達,促進子宮內免疫抑制微環境的形成,提高子宮內膜容受性。也有相關研究利用胚胎移植來研究母體微環境和胚胎之間的關系,Moraes等[60]將第7天的優質胚胎移植到高繁殖力和低繁殖力的奶牛體內,并在第17天對其進行了子宮腔液蛋白組學研究,發現妊娠小母牛和未配種牛相比,胚胎分泌因子(TKDP1、PAG11)、線粒體蛋白(DLD、ACAA1、ACAA2、HSPD1、HSPA9和GLUD1)和谷胱甘肽合酶(GSS)在子宮腔液中表達增加。

3 小 結

目前許多奶牛早期妊娠的診斷技術已經逐漸成熟,但大部分蛋白質檢測的診斷技術仍處于試驗階段,其檢測的可靠性與現代化牧場的奶牛早期妊娠識別要求仍存在著較大的差異與局限,譬如部分體液采取不便、試驗操作繁瑣、成本較高等。妊娠影響母體血液、乳汁和尿液等蛋白質的表達,妊娠期間蛋白質表達的定量差異和特異表達的差異可用于檢測與妊娠相關的生物標志物。高通量質譜靶向蛋白質組學方法的發展,可成為驗證這些潛在生物標志物的理想方法。未來,應不斷地尋找與奶牛妊娠有關的有效蛋白生物標志物,并不斷探尋新的超早期妊娠診斷方法,以便在人工授精后早期對奶牛進行正確的妊娠診斷,提高奶牛的生產效益。