1株馬乳源PVL+ST22型金黃色葡萄球菌致病性分析

吳自豪,蔡依龍,陀海欣,陳 偉,*

(1.塔里木大學生命科學與技術學院 新疆生產建設兵團塔里木動物疫病診斷與防控工程實驗室,阿拉爾 843300;2.塔里木大學動物科學與技術學院,阿拉爾 843300)

金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)是一種可在人和動物之間交叉感染的病原菌,ST22、ST5和ST398等譜系的流行性耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(epidemic meticillin-resistantStaphylococcusaureus, EMRSA)已在多個國家和地區報道,可導致人和畜禽的多種疾病,甚至引起死亡[1-3],對世界公共衛生安全和食品生產安全存在威脅。ST22型金黃色葡萄球菌在中國、歐洲、丹麥、馬來西亞和新加坡等國家和地區被相繼報道,尤其是EMRSA-15(ST22-IVh)譜系的傳播最快,有強大的優勢取代其它流行的MRSA譜系[3-5]。Panton-Valentine殺白細胞素(PVL,由lukF調控合成)可破壞宿主白細胞,并且與嚴重的侵襲性皮膚感染高度相關[6-7]。在我國已有PVL+ST22型金黃色葡萄球菌流行株造成的多人皮膚和軟組織感染以及血液感染的報道[8],其也曾在悉尼造成新生兒死亡[9]等。ST22型金黃色葡萄球菌常在貓、狗等小型伴侶動物中發現,也可在馬和馬獸醫中被檢測到[10-14],表明其可能存在人獸交叉感染風險。但目前我國馬源金黃色葡萄球菌的相關報道較少,關于馬源PVL+ST22型金黃色葡萄球菌的相關報道更是寥寥無幾。

隨著我國經濟的快速發展,馬養殖業及其相關產業也在迅猛發展。關于金黃色葡萄球菌在馬的養殖過程中對馬本身的危害,及其可能引發的公共衛生安全問題不容忽視。本研究對從新疆伊犁某馬場分離得到的1株PVL+ST22型馬乳源金黃色葡萄球菌進行毒力基因檢測,并進行藥物敏感性檢測和致病性分析,以期為國內馬源金黃色葡萄球菌的相關研究提供基礎試驗數據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 樣品采集與菌株 在新疆伊犁某馬場隨機抽取哺乳期健康母馬65匹(養殖規模>300匹;每個馬廄養殖15～20匹;樣品采集自8個馬廄,每個馬廄5～10份),使用酒精對乳區進行消毒,然后棄去前三把乳汁,用無菌離心管收集10 mL馬乳[15],共65份乳樣,于-20 ℃保存,10 d內低溫運輸至實驗室進行處理。

小鼠巨噬細胞RAW264.7、金黃色葡萄球菌ATCC 25923(攜帶nuc)、奶牛乳源金黃色葡萄球菌72-1-1[16](攜帶lukF)和表皮葡萄球菌ATCC 35984(強生物被膜形成)由新疆生產建設兵團塔里木動物疫病診斷與防控工程實驗室保存。

1.1.2 主要試劑及儀器 PCR基因擴增引物、Tris-HCl、SDS、EDTA、Easy Taq 2X Mix,均購自上海生工生物工程有限公司;PCR儀、凝膠成像系統、電泳儀購自Bio-Rad公司;藥敏片均購自溫州市泰康生物科技有限公司。DMEM(Dulbecco′s modified eagle medium)和胎牛血清購自于Gibco公司。胰酶購自思拓凡(Cytiva)公司。健康兔血清和去纖維綿羊血由新疆生產建設兵團塔里木動物疫病診斷與防控工程實驗室提供。

1.1.3 培養基 甘露醇高鹽瓊脂培養基(MSA)用于選擇性培養金黃色葡萄球菌,胰蛋白胨大豆瓊脂/液體培養基(TSA/TSB)用于金黃色葡萄球菌的增殖培養,MHA/MHB培養基用于K-B紙片法藥敏試驗,DMEM培養基用于小鼠巨噬細胞的培養。

1.2 方法

1.2.1 葡萄球菌的分離與鑒定 取2 mL乳樣離心(12 000 r·min-1,2 min),用TSB重懸后加入5 mL TSB培養基中富集培養(37 ℃,18～24 h),然后劃線接種到MSA培養基上選擇性培養。觀察菌落形態,挑取表面光滑、邊緣整齊、中度隆起的金黃色或檸檬色菌落,劃線接種于TSA培養基上進行純培養。然后進行革蘭染色鏡檢,將呈葡萄串狀的革蘭陽性球菌于-80 ℃貯存。

參考文獻[17]中的方法,以金黃色葡萄球菌ATCC 25923為陽性對照,無菌水為空白對照,對分離得到的葡萄球菌進行觸酶試驗、凝固酶試驗和甘露醇發酵試驗。然后將革蘭染色鏡檢篩出的葡萄球菌全部進行nuc基因擴增檢測[18](擴增產物大小在279 bp且條帶單一明亮,為陽性菌株)。對nuc基因擴增陽性的菌株進行16S rRNA基因擴增,將PCR擴增產物測序,并將序列在NCBI網站上(https:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/)進行比對。

1.2.2 MLST分型與spa分型 多位點序列分型(multilocus sequence typing,MLST)通過PCR擴增測序金黃色葡萄球菌的7個持家基因(arcC、aroE、glpF、gmk、pta、tpi和yqiL),并將基因序列在MLST官方網站(https:∥pubmlst.org)進行對比,獲得菌株序列型[19]。

spa分型通過PCR擴增spa基因(葡萄球菌蛋白A)的多態X區并進行測序,然后將基因序列在官方網站(https:∥cge.cbs.dtu.dk)進行對比,獲得菌株spa型[19]。

1.2.3 藥物敏感性試驗 根據美國臨床和實驗室標準協會指南(CLSI, 2021)標準操作要求和判斷標準,以ATCC 25923為質控菌株,使用K-B紙片法對金黃色葡萄球菌進行10類12種藥物的敏感性檢測。包括β-內酰胺類的青霉素(P)、頭孢西丁(FOX)和頭孢噻吩(KF);氯霉素類的氯霉素(C);大環內酯類的紅霉素(E);噁唑烷酮類的利奈唑胺(LZD);利福霉素類的利福平(RD);四環素類的四環素(TE);磺胺類的復方新諾明(SXT);喹諾酮類的諾氟沙星(NOR);氨基糖苷類的慶大霉素(CN);林可酰胺類的克林霉素(DA)。

1.2.4 毒力基因檢測 使用PCR技術對分離得到的金黃色葡萄球菌進行20種毒力基因[16]檢測,包括編碼葡萄球菌腸毒素(sea、seb、sec、sed、see、seg、seh、sei和sej)、中毒性休克綜合征毒素(tsst-1)、剝脫毒素(eta和etb)、PVL(lukF)、溶血素(hla和hlb)、纖連蛋白結合蛋白(fnbA和fnbB)、凝聚因子(clfA和clfB)和膠原蛋白黏附素(cna)的基因。擴增程序為:94 ℃預變性5 min;94 ℃變性30 s,50 ℃退火30 s,72 ℃延伸45 s,30個循環;72 ℃最后延伸10 min。

1.2.5 生物被膜形成能力檢測 分別以表皮葡萄球菌ATCC 35984和無菌水為陽性和空白對照,參考文獻[19]中的方法對金黃色葡萄球菌進行生物被膜形成能力檢測與判定。操作步驟為:將過夜培養的金黃色葡萄球菌轉接至TSB培養基中搖床培養4～6 h,至菌液呈云霧狀。再1∶100稀釋后取200 μL加入96孔細胞培養板,37 ℃靜置培養24 h,然后棄去菌液,用PBS沖洗2～3次,置于56 ℃烘箱中烘干。再用1%的結晶紫染色15 min,沖洗、晾干后使用丙酮/乙醇(20%/80%)進行溶解,測定OD570 nm[19]。

1.2.6 溶血能力檢測 取100 μL過夜培養后的細菌上清液(12 000 r·min-1,2 min)與900 μL含3%綿羊紅細胞的磷酸鹽緩沖液(PBS)混合。37 ℃孵育30 min,離心(8 000 r·min-1,2 min)后,在540 nm處測定上清液溶血程度。陽性對照為1 000 μL含3%綿羊紅細胞的ddH2O混合液,陰性對照為1 000 μL含3%綿羊紅細胞的PBS混合液[20]。

1.2.7 小鼠皮膚膿腫模型 用脫毛膏去除小鼠背部被毛,然后試驗組接種100 μL含有5×107CFU·mL-1金黃色葡萄球菌的PBS,對照組接種100 μL無菌PBS。接種24 h后測量小鼠皮膚膿腫的長度(L)和寬度(W)。面積計算公式為A=π(長×寬)/2[2]。

1.2.8 小鼠致病性試驗 將金黃色葡萄球菌于TSA上傳代復蘇(37 ℃恒溫過夜培養),然后挑取單個菌落置于TSB液體培養基中37 ℃,180 r·min-1培養24 h。8 000 r·min-1離心5 min收集菌體,使用PBS洗滌2次,并將菌液濃度分別調整為5×108、5×107和5×106CFU·mL-1。將32只體重為(23±3)g的小鼠隨機分為4組(每組8只),試驗組小鼠分別腹腔注射0.2 mL不同稀釋度的菌液。對照組注射0.2 mL無菌PBS。接種后觀察感染小鼠的臨床狀癥及死亡情況[21]。

1.2.9 金黃色葡萄球菌在小鼠巨噬細胞中的黏附作用 將小鼠巨噬細胞RAW264.7在DMEM培養基(10%胎牛血清)中連續培養三代,然后用胰酶消化分散成單個細胞,按每孔1×105個細胞的密度加至6孔細胞培養板中,置37 ℃,5% CO2細胞培養箱中過夜培養至每孔約含2×105個細胞(單層)。收集對數期OD600 nm=0.6的金黃色葡萄球菌菌液,離心后用無菌PBS洗滌3次后用DMEM重懸,按照細菌細胞MOI比為100∶1侵染細胞,每組做3孔重復。6孔細胞培養板用水平微振蕩儀室溫振蕩10 min,使細菌與細胞充分接觸;置于37 ℃孵育1 h后,用無菌PBS洗3遍,除去非特異性附著的菌。然后每孔加入1 mL 0.2% TritonX-100,37 ℃孵育10 min;吹打孔底,吸出孔內液體,6 000 r·min-1離心5 min,棄上清,PBS重懸并梯度稀釋。取3個合適的稀釋度涂布在高鹽甘露醇瓊脂平板,37 ℃培養過夜,計算黏附率[22]。黏附率=(黏附細菌數/加入總細菌數)×100%。

1.2.10 金黃色葡萄球菌在小鼠巨噬細胞中的侵襲作用 參照“1.2.9”步驟培養細胞,將巨噬細胞用細菌感染置于37 ℃孵育1 h,PBS洗滌后加入含有50 μg·mL-1慶大霉素的DMEM再培養1 h,無菌PBS洗滌并裂解細胞,進行梯度稀釋涂板計數,每組3個重復,測定金黃色葡萄球菌對細胞的侵襲率[22]。侵襲率=(侵襲細菌數/加入總細菌數)×100%。

1.2.11 金黃色葡萄球菌在小鼠巨噬細胞中的存活和增殖能力 參照“1.2.9”步驟培養細胞,將細菌侵染巨噬細胞,在感染1 h后加入含有慶大霉素(50 μg·mL-1)的DMEM繼續培養1 h,PBS洗滌后再加入不含抗生素的DMEM孵育。以此時為0 h,然后在4、8、12、16和24 h后去除培養基,無菌PBS洗滌3次后裂解細胞,進行梯度稀釋涂板計數,每組3個重復,測定金黃色葡萄球菌的細胞內存活和增殖能力[22]。

1.2.12 數據分析 使用GraphPad Prism 7軟件選擇T檢驗方法分析數據,P<0.05表示數據具有顯著性差異。

2 結 果

2.1 金黃色葡萄球菌的分離鑒定

經生化鑒定和分子鑒定從65份馬乳中得到金黃色葡萄球菌1株(命名為282)。生化試驗結果顯示,其觸酶試驗、凝固酶試驗和甘露醇發酵試驗均為陽性。并且nuc基因擴增陽性,如圖1。

M. DL 2 000 DNA marker;泳道1. 陽性對照,金黃色葡萄球菌ATCC 25923;泳道2. 待檢菌株(282);泳道3. 空白對照M. DL 2 000 DNA marker; Lane 1. Positive control, S. aureus ATCC 25923; Lane 2. Strain to be tested (282); Lane 3. Blank control

2.2 MLST分型和spa分型

通過分子分型分析,從馬乳中獲得的金黃色葡萄球菌282的MLST分型為ST22(MLST allele:7-6-1-5-8-8-6),spa分型為t304(Repeats:26-23-05-17-25-17-25-16-28)。

2.3 藥物敏感性試驗與生物被膜形成能力檢測

藥敏試驗結果表明,分離得到的金黃色葡萄球菌僅對青霉素耐藥,對其他藥物均不耐藥,并且無生物被膜形成能力(OD570 nm=0.135),見表1。

2.4 毒力基因檢測

通過PCR擴增檢測,在本研究中的馬乳源金黃色葡萄球菌中不僅檢測到編碼PVL的lukF基因(圖2),還檢測到9種其他毒力基因,包括編碼葡萄球菌腸毒素的sec、seg和seh基因,編碼中毒性休克綜合征毒素的tsst-1基因,編碼溶血素的hla和hlb基因,編碼凝集因子的clfA和clfB,編碼膠原蛋白黏附素的cna基因(圖3)。

M. DL 2 000 DNA marker;泳道1. 陽性對照,金黃色葡萄球菌72-1-1;泳道2. 待檢菌株(282);泳道3. 空白對照M. DL 2 000 DNA marker; Lane 1. Positive control, S. aureus 72-1-1; Lane 2. Strain to be tested (282); Lane 3. Blank control

M. DL 2 000 DNA marker;泳道1～9分別為sec(284 bp)、seg(328 bp)、seh(359 bp)、tsst-1(559 bp)、hla(209 bp)、hlb(309 bp)、clfA(292 bp)、clfB(194 bp)和cna(228 bp);泳道10. 空白對照M. DL 2 000 DNA marker; Lanes 1-9 are sec (284 bp), seg (328 bp), seh (359 bp), tsst-1 (559 bp), hla (209 bp), hlb (309 bp), clfA (292 bp), clfB (194 bp), and cna (228 bp), respectively; Lane 10. Blank control

2.5 溶血性檢測

溶血活性試驗結果表明,金黃色葡萄球菌282具有溶血活性,OD540 nm為2.15(圖4)。

****. P<0.000 1

2.6 皮膚感染試驗

小鼠皮膚感染試驗表明,本研究中的馬乳源金黃色葡萄球菌具有皮膚感染的能力,可在小鼠背部形成A=(99.63±24)mm2的膿腫(圖5)。

圖5 小鼠皮膚感染模型Fig.5 Mouse skin infection model

2.7 小鼠致病性試驗

本研究使用小鼠腹腔感染模型進一步評估金黃色葡萄球菌282的致病性,結果表明,5×108CFU·mL-1注射組在24 h時即有7只小鼠死亡,48 h時全部死亡;5×107CFU·mL-1注射組在24 h時有1只小鼠死亡,其他小鼠出現被毛凌亂、精神沉郁和活動減弱等臨床癥狀,至3 d時開始好轉;5×106CFU·mL-1注射組無小鼠死亡,在24 h時出現嗜睡和活動減弱等癥狀,但輕于5×107CFU·mL-1注射組,并且48 h時好轉(圖6)。說明金黃色葡萄球菌282具有一定的致病風險。

圖6 小鼠生存曲線Fig.6 Survival curve of mouse

2.8 細胞黏附、侵襲和胞內增殖試驗

小鼠巨噬細胞試驗結果表明,馬乳源金黃色葡萄球菌具有黏附和侵襲小鼠巨噬細胞的能力,黏附率、侵襲率分別為4.26%和6.45%(圖7a)。胞內增殖試驗結果也表明,馬乳源金黃色葡萄球菌進入小鼠巨噬細胞后0～4 h未迅速增殖,在4～12 h時增殖迅速,12～24 h時細菌的胞內增殖趨于停止(圖7b)。

a. 細胞黏附與侵襲;b. 胞內增殖;*. P< 0.05;***. P< 0.001;ns. 差異不顯著a. Cell adhesion and invasion; b. Intracellular proliferation; *. P< 0.05;***. P< 0.001;ns. no significance

在熒光倒置顯微鏡下觀察細胞形態可見,培養4 h金黃色葡萄球菌可引起細胞膨大、分化形成偽足(圖8b),8 h細胞出現崩解和凋亡(圖8c),在12～24 h出現細胞出現大規模凋亡(圖8d～e),巨噬細胞基本被破壞(圖8f)。

a～f. 分別為培養0、4、8、12、16、24 h;黑色箭頭. 細胞分化形成偽足;黑色空心箭頭. 細胞脫落;白色箭頭. 細胞崩解a-f. Cultured for 0、4、8、12、16、24 h, respectively; Black arrows. Cell differentiation to form pseudopods; Black hollow arrows. Cell shedding; White arrows. Cell disintegration

3 討 論

不同譜系的金黃色葡萄球菌對特定的物種及其接觸群體有著一定的趨向,例如ST398型金黃色葡萄球菌通常被認為是與豬相關的牲畜譜系,ST5和ST22型金黃色葡萄球菌常在醫院臨床病例中出現等。但隨著相關研究的深入,這些特定譜系的金黃色葡萄球菌也在其他物種中被發現,如ST398型金黃色葡萄球菌在牛、羊和人源均有發現,而ST22型金黃色葡萄球菌也在貓、狗和馬中發現。ST22型金黃色葡萄球菌不僅具有傳播迅速、宿主范圍廣泛的特點,而且具有較強的致病性[1-4,10]。Xiao等[8]研究表明,ST22型MRSA很可能已經取代ST398型成為北京醫院中流行的主要MRSA譜系。目前,國內少有關于馬乳源ST22型金黃色葡萄球菌的報道,本研究在新疆健康馬乳中分離得到1株ST22型金黃色葡萄球菌,并對其致病性進行了評估。

自20世紀60年代以來,金黃色葡萄球菌已成為世界各地醫院的主要醫院病原體之一,可導致皮膚和軟組織感染、腹瀉和中毒性休克綜合征等[23]。在金黃色葡萄球菌的致病過程中多種毒素蛋白發揮重要作用,如葡萄球菌腸毒素是金黃色葡萄球菌導致宿主食物中毒的重要因素[24];中毒性休克綜合征毒素可減弱宿主免疫反應,導致中毒性休克綜合征[25];Panton-Valentine殺白細胞素不僅可破壞宿主白細胞,并且與葡萄球菌性燙傷樣皮膚綜合征高度相關[6-7]等。研究表明,由攜帶lukS/F基因(編碼Panton-Valentine殺白細胞素)的ST22-MSRA引起的感染病例在不斷增加[3],且Chen等[26]報道稱,與中國其他ST型金黃色葡萄球菌相比,ST22型攜帶lukS/lukF基因的比例更高。本研究所獲得的1株ST22型金黃色葡萄球菌不僅檢測到編碼PVL的lukF基因,還攜帶編碼腸毒素的sec、seg和seh基因,編碼中毒性休克綜合征毒素的tsst-1基因,編碼溶血素的hla和hlb基因,以及編碼凝集因子的clfA和clfB基因,還有編碼膠原蛋白黏附素的cna基因,且具有溶血活性。這表明其具有潛在的致病力,可能對公共衛生與食品安全存在威脅。

Jian等[2]對國內臨床分離的ST5型甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌(methicillin susceptibleStaphylococcusaureus, MSSA)和MRSA的對比研究中發現,MRSA對抗菌藥物的耐受性更強,但是MSSA顯示出較高的毒力。MSSA具有較高的溶血能力和黏附上皮細胞能力,在小鼠膿腫模型中引起更嚴重的感染。MSSA菌株可能在致病性方面比MRSA菌株存在更大的隱患[2],其可能原因是,與MRSA菌株相比,MSSA菌株未得到足夠重視,并且MRSA菌株中較大的SCCmec基因盒可降低細菌毒性[27]。研究表明,與CC59型金黃色葡萄球菌相比,ST22型生物被膜形成能力較弱[8]。本研究中,ST22型金黃色葡萄球菌僅對青霉素耐受,并且沒有生物被膜形成能力,但其攜帶多種毒力基因。隨后的溶血試驗、小鼠皮膚膿腫模型和致病性試驗表明,其具有溶血活性、可導致小鼠皮膚膿腫,并且在高劑量感染時可致宿主死亡。細菌在宿主細胞中的黏附、侵襲和胞內增殖是其發揮致病作用非常關鍵的一步,金黃色葡萄球菌作為一種兼性胞內寄生菌,可在宿主細胞內存活和增殖,然后擴散到宿主的其他組織或器官,進而引發全身性感染[23]。Baldan等[28]證明,與ST228型金黃色葡萄球菌相比,ST22型在體外侵襲人類非小細胞肺癌細胞系(A549細胞系)的能力更強,并且在急性肺部感染小鼠模型中具有更高的致病性。本研究對馬乳源ST22型金黃色葡萄球菌進行小鼠巨噬細胞的黏附、侵襲和胞內增殖試驗,結果表明,金黃色葡萄球菌282具有黏附和侵襲小鼠細胞的能力,并且可在胞內增殖,然后引起細胞的崩解和凋亡,表明其可對宿主細胞造成較大的傷害。因此,馬乳源ST22型金黃色葡萄球菌具有較強的致病性,這提示人們應加強對馬乳源金黃色葡萄球菌的檢測與管控。

4 結 論

本研究首次對新疆伊犁1株馬乳源PVL+ST22型金黃色葡萄球菌進行毒力基因檢測、藥物敏感性檢測和致病性評估,發現本研究中分離得到的金黃色葡萄球菌攜帶sec、tsst-1、hla等在內的10種毒力基因,并且對青霉素耐藥以及具有較強的致病性,因此應加強對馬攜帶的金黃色葡萄球菌的調查與防控。