一株銅綠假單胞菌噬菌體全基因組分析及與抗生素體外聯合應用效果

王晉宇,張凱川,王芮杰,高 鐸,蔣祺豐,賈 坤

(華南農業大學獸醫學院,廣州 510642)

銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa,PA)是一種革蘭陰性專性需氧菌,也稱綠膿桿菌,廣泛存在于土壤、空氣、海河以及人類和動植物生活的環境中,能夠引起動物機體的各種感染,例如皮膚感染、子宮內膜炎、乳腺炎和腸道感染等。銅綠假單胞菌也是醫院內一種常見的機會性致病菌,當宿主防御系統受到損傷,導致機體免疫功能下降時,易發生銅綠假單胞菌感染[1]。由于該致病菌引發的感染病癥反復,治療時間長,所以難以徹底治愈[2]。同時,銅綠假單胞菌引起的呼吸機相關性肺炎(VAP)占能夠造成VAP的細菌的10%～20%[3],也是導致尿路感染的主要病因之一[4]。銅綠假單胞菌在潮濕環境中更易感染燒傷患者,引發各種并發癥[5],由于其引起的菌血癥死亡率高達43.2%～58.8%,應得到廣泛關注[6]。

噬菌體是一種能夠感染細菌、真菌以及放線菌等微生物的病毒,在地球上儲量豐富,可達到1031[7],能夠從土壤、海洋、污水以及廢品中分離得到。而且噬菌體對細菌的殺滅作用是獨特的,具有高宿主特異性和低毒性,幾乎不影響正常菌群[8]。此外,噬菌體在各種環境下有較強的適應性和對多重耐藥(MDR)病原體的有效活性,也被視為抗生素的潛在替代品[9-10]。近年來,應用噬菌體治療MDR細菌感染的案例屢見不鮮,一項動物試驗結果顯示,與陰性對照組相比(無感染組愈合率為97.43%),被MDR肺炎克雷伯菌感染的傷口經噬菌體處理過表現出最高為99%的愈合效率,證明了應用噬菌體治療的可能性[11]。與此同時,銅綠假單胞菌噬菌體全基因組的測序工作也得到快速發展,2019年3月,NCBI數據庫中登錄的假單胞菌噬菌體全基因組序列有357株,其中93%的噬菌體具有雙鏈DNA結構[12],截至2023年5月,上傳到NCBI數據庫中的全基因組序列已經達到773株,在此期間還發現一株新型巨型銅綠假單胞菌噬菌體vB_PaeM_MIJ3[13]。因此,對噬菌體的研究還需要更加深入,探索其治療耐藥菌的潛力。本研究分離鑒定出醫院源銅綠假單胞菌噬菌體,研究其生物學特性、基因組信息以及與不同抗生素體外聯合應用,以期為噬菌體應用于實際奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

29株不同種銅綠假單胞菌菌株(28株臨床分離銅綠假單胞菌和1株標準銅綠假單胞菌CMCC 10104),來自于華南農業大學獸醫學院外科教研室保存菌株。噬菌體樣本分離自南方醫科大學南方醫院污水。LB營養瓊脂、瓊脂粉、PEG8000、NaCl購自廣州生工科技有限公司,頭孢曲松購自北京悅康藥業集團股份有限公司,恩諾沙星購自河南白云牧港生物科技有限公司,慶大霉素購自山西芮城科龍獸藥有限公司,脫氧核糖核酸酶、核糖核酸酶、綠豆核酸酶均購自北京索萊寶生物技術有限公司,病毒基因組DNA提取試劑盒購自天根生化科技有限公司,透射電鏡(型號FEI/Talos L 120C,廠家捷克/FEI)。

1.2 噬菌體的分離鑒定

1.2.1 噬菌體分離純化 采集100 mL醫院污水,使用0.22 μm濾膜過濾除菌,將濾液12 000 r·min-1離心15 min,收集上清液。將29株銅綠假單胞菌菌株分別培養至對數生長期備用。將30 mL LB液體培養基、500 μL銅綠假單胞菌菌液和1 mL樣品上清液加入到50 mL離心管內,置于37 ℃,200 r·min-1的搖床中培養12 h。培養結束后將混合液過濾離心,收集上清液即為待測的噬菌體樣品。

采用雙層瓊脂平板法分離噬菌體,選擇菌株PA18作為宿主菌,之后進行噬菌體純化:用鑷子選取平板上單噬菌體斑塊,放入裝有1 mL生理鹽水的EP管中,攪碎斑塊后置于42 ℃水浴鍋浸出,再以12 000 r·min-1離心10 min,取上清液通過雙層瓊脂平板法分離噬菌體。重復操作直至瓊脂板上的噬菌斑大小形態一致,即為純化后的單一噬菌體。

1.2.2 噬菌體增殖、濃縮 分別將純化后的噬菌體和宿主菌按照最佳MOI加入到LB液體培養基中,置于37 ℃,200 r·min-1的搖床中富集培養,然后離心過濾得到噬菌體富集液。參照郭楊毅君文中的PEG沉淀噬菌體顆粒的方法[12],對噬菌體進行濃縮。濃縮后的噬菌體效價達到1011PFU·mL-1以上,就可以用作噬菌體核酸類型鑒定、透射電鏡觀察和全基因組測序。

1.3 噬菌體生物學特性研究

1.3.1 噬菌體裂解譜測定 使用點樣法測定噬菌體裂解譜。將29株銅綠假單胞菌分別在LB液體培養基中培養12 h,然后將100 μL菌液均勻涂布在LB固體培養基表面,同時取10 μL經過純化的噬菌體滴在LB固體培養基上,另外滴10 μL生理鹽水做對照。待噬菌體液滴干燥之后將平板倒置,培養10 h后觀察液滴所在處是否透明,確定噬菌體對菌株的裂解性。

1.3.2 噬菌體透射電鏡觀察 將純化濃縮后效價為1011PFU·mL-1的噬菌體顆粒加載到銅網上1 min,然后用等量2%醋酸鈾進行負染1 min并吸掉多余液體。待其干燥后使用TEM Talos L 120C觀察噬菌體形態并采集圖像。

1.3.3 最佳感染復數測定 將銅綠假單胞菌培養至對數生長期(菌液濃度為108CFU·mL-1),按照感染復數(MOI)為100、10、1、0.1、0.01、0.001以及0.000 1的比例在離心管中分別加入500 μL噬菌體和500 μL菌液,震蕩混勻后在37 ℃溫箱中孵育,4 h后將混合物以12 000 r·min-1離心10 min,取上清液通過雙層瓊脂平板法測定噬菌體效價。

1.3.4 一步生長曲線測定 取1 mL對數生長期的銅綠假單胞菌菌液到離心管中,再以最佳MOI為0.001的比例加入1 mL噬菌體,置于37 ℃溫箱中孵育20 min,然后8 000 r·min-1離心10 min,棄掉上清后,使用37 ℃預熱的LB肉湯重懸沉淀,重復離心操作一次,將沉淀轉移到預熱的10 mL LB肉湯中,重懸沉淀后置于37 ℃,200 r·min-1的搖床中培養。在前30 min以10 min的時間間隔取樣,之后每隔15 min進行取樣,每次取樣量為500 μL,試驗時間持續2 h,同時通過雙層瓊脂平板法測定噬菌體效價,試驗重復三次,使用GraphPad Prism 軟件繪制一步生長曲線。噬菌體爆發量等于裂解結束時的噬菌體數量除以感染初期細菌的初始濃度。

1.3.5 吸附曲線測定 取2 mL對數生長期的銅綠假單胞菌菌液到離心管中,再按照最佳MOI加入2 mL噬菌體,置于搖床當中,設置條件為37 ℃,200 r·min-1,孵育10 min,期間每隔2 min進行取樣,每次取樣量為500 μL。同時使用雙層瓊脂平板法測定噬菌體效價,試驗重復3次,以時間為橫坐標,噬菌體吸附率為縱坐標使用GraphPad Prism 軟件繪制噬菌體吸附曲線。

噬菌體吸附率=[(0 min噬菌體總量-未吸附噬菌體數量)/0 min噬菌體總量] ×100%。

1.3.6 噬菌體熱穩定性和pH穩定性測定 測定噬菌體在不同溫度下的穩定性。分別取1 mL確定效價的噬菌體加入到1.5 mL EP管中,分別置于-20、4、25、37、40、50、60、70和80 ℃下孵育1 h,每個溫度下放置3個樣品。孵育完成后再將所有樣品置于4 ℃冰箱1 h,然后12 000 r·min-1離心10 min收集所得上清液,通過雙層瓊脂平板法測定噬菌體效價。以溫度為橫坐標,噬菌體存活率為縱坐標使用GraphPad Prism9軟件繪圖。

測定噬菌體在不同pH條件下的穩定性。將SM緩沖液分別調節至pH值為1到14共14個梯度,每個梯度取900 μL加入到EP管,再加入100 μL確定效價的噬菌體原液,在37 ℃水浴鍋中孵育,1 h后12 000 r·min-1離心10 min收集所得上清液,通過雙層瓊脂平板法測定噬菌體效價。重復試驗3次,以pH為橫坐標,噬菌體存活率為縱坐標使用GraphPad Prism9軟件繪圖。

噬菌體存活率=[2/1 h后噬菌體效價/噬菌體原液效價] ×100%。

1.4 噬菌體全基因組分析

1.4.1 噬菌體核酸類型鑒定 使用Viral DNA Kit試劑盒提取噬菌體基因組,然后使用DNase I、RNase A和MungBean(20 U·μg-1)進行基因組酶溶鑒定,對照組使用ddH2O處理,所有組別在37 ℃水浴鍋中處理1 h,產物與Loading Buffer混合,通過1%瓊脂糖凝膠電泳分離,使用凝膠成像系統進行觀察。

1.4.2 全基因組測序及生物學信息分析 通過酶標儀檢測噬菌體基因組DNA濃度,要求達到5 ng·μL-1以上,總量要求40 μL,符合要求后送至華南農業大學獸醫學院預防教研室進行基因組測序。首先用Nextera XT DNA文庫制備試劑盒并進行質量鑒定,符合要求后使用lllumina Hiseq測序平臺全基因組測序,測序完成后用FASTQC工具分析數據質量,通過后用SPAdes v3.11.0[14]對序列進行拼接和組裝。獲取到完整的基因組數據后,使用GCserver軟件繪制全基因組圖。

利用在線網站VFDB(VFDB: Virulence Factors of Bacterial Pathogens)查找噬菌體全基因組中是否存在細菌毒力因子;通過在線工具CARD(Comprehensive Antibiotic Resistance Database)和CGE(Center for Genomic Epidemiology)檢測抗生素抗性基因;通過在線網站tRNAscan-SE 2.0預測是否存在tRNA基因[15]。利用MEGA11軟件對PaVOB全基因組序列進行系統發育分析,選取覆蓋率≥95%,一致性>94%的基因組進行進化分析。應用在線網站NCBI中的ORF finder工具預測PaVOB的DNA以查找潛在的蛋白質編碼片段,使用blastp驗證預測得到的蛋白質,蛋白質數據庫選擇非冗余蛋白質序列(nr),開始密碼子為′ATG′,分析預測得到的開放閱讀框(ORF)的功能。

1.5 噬菌體與抗生素體外聯合應用

1.5.1 抗生素MIC測定 選擇3種不同殺菌機制的抗生素,包括頭孢菌素類頭孢曲松(100 mg·mL-1)、氟奎諾酮類恩諾沙星(100 mg·mL-1)和氨基糖苷類慶大霉素(40 mg·mL-1),測試宿主菌的最小抑菌濃度(MIC)。將藥物在EP管中進行倍比稀釋,頭孢曲松和恩諾沙星最低稀釋到1.5 μg·mL-1,慶大霉素最低稀釋到0.3 μg·mL-1,將菌液濃度都調整到108CFU·mL-1備用。參照微量肉湯稀釋法(酶標板)的步驟進行加樣,然后將96孔板置于37 ℃恒溫培養箱中培養12 h,使用酶標儀在OD600 nm波長下檢測。

1.5.2 測定噬菌體與抗生素聯合應用效果 選擇上述三種抗生素,測定與噬菌體聯合應用的作用效果。首先準備效價為10～107PFU·mL-1的噬菌體稀釋液,藥物濃度選擇范圍根據MIC結果確定,共11個濃度梯度,從高到低使用LB肉湯進行2倍稀釋,準備108CFU·mL-1的PA18菌液備用。在無菌96孔圓底微量滴定板中進行試驗,先在96孔板每個孔中加入100 μL菌液,然后以藥物高濃度到低濃度的順序分別從第1孔到第11孔橫向加入100 μL藥物稀釋液,第2～8排重復操作,最后縱向加入不同效價的噬菌體100 μL,以第一縱列為例,第1孔加入噬菌體效價為107PFU·mL-1,依次類推第1列第7排孔內噬菌體效價為10 PFU·mL-1,剩余縱列重復操作。最后每個孔內應有混合液體300 μL,不夠量的用LB肉湯補齊,加樣結束后將96孔板置于37 ℃恒溫培養箱中培養12 h,應用酶標儀在600 nm波長下檢測OD值,試驗重復3次取平均值,應用TBtools軟件繪制熱圖。

2 結 果

2.1 噬菌體的分離鑒定及生物學特性

2.1.1 噬菌體分離純化鑒定結果 從醫院污水中分離到一株銅綠假單胞菌噬菌體并命名為PaVOB,如圖1a所示,噬菌體在雙層瓊脂板上形態表現為圓形、空斑透亮、邊緣清晰,直徑為2～3 cm。透射電鏡(TEM)顯示PaVOB病毒顆粒具有一個平均直徑為73.02 nm的二十面體頭部和一個平均長度為155.57 nm的長尾部(圖1b),屬于有尾噬菌體目(Caudovirales),長尾噬菌體科(Siphoviridae)。

圖1 噬菌體PaVOB的噬斑(a)及顯微形態(b)Fig.1 Phage plaques (a) and microscopic morphology (b) of phage PaVOB

2.1.2 噬菌體裂解譜 通過點樣法對PaVOB的宿主范圍進行測定,PaVOB能夠裂解29株銅綠假單胞菌中的5株,其中不包括標準銅綠假單胞菌CMCC 10104,裂解率為17.2%,其裂解譜較窄,屬于窄裂解譜噬菌體。

2.1.3 噬菌體一步生長曲線 根據最佳MOI建立的一步生長曲線,結果如圖2A所示:PaVOB滴度在10 min后快速上升,在120 min趨于平穩。因此,PaVOB的潛伏期為10 min,裂解期為120 min,爆發量為50 PFU·cell-1。

2.1.4 噬菌體吸附曲線 如圖2B所示,測定PaVOB對宿主菌PA18的吸附能力。結果表明,PaVOB在2 min內吸附速度最快,吸附率達到69.4%,在6和8 min內吸附率分別為91.4%、95.2%,10 min時吸附率最高,為99.1%,噬菌體吸附基本達到飽和。

2.1.5 噬菌體熱穩定性 溫度對PaVOB的影響結果如圖2C所示,PaVOB耐受低溫環境,在-20～40 ℃期間存活率都大于80%,之后隨溫度升高而下降,但是在60 ℃時還具有61%的存活率,在70 ℃條件下完全滅活。這一結果表明PaVOB耐低溫能力較強。

2.1.6 噬菌體pH穩定性 pH對PaVOB的影響結果如圖2D所示,PaVOB在pH為4～11之間存活率超過60%,pH為6時存活率接近100%,在pH為3和12時,分別具有25.2%、32.5%的存活率,在pH>12和pH<3時,PaVOB完全失活。這一結果表明PaVOB在pH為4～11的環境中穩定性較好,最適pH為6。

2.1.7 最佳感染復數 如表 1所示,當MOI為0.001時,PaVOB效價最高,為1.84×109PFU·mL-1。因此,PaVOB的最佳MOI為0.001。

表1 PaVOB最佳感染復數

2.2 噬菌體生物信息學分析

2.2.1 噬菌體核酸類型鑒定結果 對PaVOB使用不同核酸酶處理,結果如圖3所示,PaVOB基因組DNA對DNase I敏感,處理之后沒有條帶,而經RNaseA和Mung Bean Nuclease處理之后,條帶大小與陰性對照組基本一致,表明PaVOB基因組為雙鏈DNA。

M. DL15000 DNA相對分子質量標準;1. PaVOB核酸陰性對照;2. PaVOB核酸DNase I處理;3. PaVOB核酸RNaseA處理;4. PaVOB核酸Mung Bean Nuclease處理 M. DL15000 DNA marker; 1. PaVOB nucleic acid negative control; 2. PaVOB nucleic acid DNase I treatment; 3. PaVOB nucleic acid RNaseA treatment; 4. PaVOB nucleic acid Mung Bean Nuclease treatment

2.2.2 基因組一般特性分析結果 PaVOB(NCBI登錄號OQ743452)的全基因組測序結果如圖4所示,PaVOB基因組全長為72 179 bp,C+G含量為54.81%,另外在線軟件預測結果顯示,未在PaVOB中發現毒力基因、耐藥基因和tRNA編碼基因的存在。

2.2.3 噬菌體進化分析結果 基于噬菌體全基因組的進化分析結果如圖5所示,PaVOB與一個未分類的噬菌體vB PaeP FBPa1親緣關系小于0.1,且vB PaeP FBPa1屬于有尾噬菌體目,結合TEM形態可以確定PaVOB屬于長尾噬菌體科的新成員。

圖5 PaVOB進化分析Fig.5 Evolution analysis of PaVOB

2.2.4 預測的噬菌體基因組ORF及其功能注釋結果 PaVOB預測共得到74個ORF,其中37個分布在正鏈上,37個分布在負鏈上,23個未在蛋白質數據庫中找到相似蛋白,13個ORF與數據庫中的功能蛋白有較高的相似性(見表2),包括病毒相關RNA聚合酶(ORF41)、推定門戶蛋白(ORF47)、終止酶大亞基(ORF66)、推定裂解尾纖維蛋白(ORF40)、假定的DNA聚合酶I(ORF20)、推定結構蛋白(ORF51)、推定的單鏈DNA結合蛋白(ORF4)、N4 gp67樣蛋白(ORF45)、N4 gp55樣蛋白(ORF50)、主要衣殼蛋白(ORF62)、假定的dUTPase(ORF61)、N4 gp48樣蛋白(ORF27)和dUTP核苷酸水解酶(ORF34),剩余ORF均為假想蛋白。

表2 PaVOB功能蛋白注釋信息

2.3 噬菌體與抗生素體外聯合應用

如圖6a所示,結果呈現了噬菌體與頭孢曲松聯合應用的效果,數值代表細菌清除率,數值越大,顏色越深,清除效果越好。PaVOB與頭孢曲松聯合應用有增強作用,在頭孢曲松濃度≥24.40 μg·mL-1時,細菌清除率達到55%以上,PaVOB濃度在106～107PFU·mL-1時,與頭孢曲松聯合殺菌效果最好,細菌清除率達到90%～100%。

a. 頭孢曲松與PaVOB聯合應用;b.恩諾沙星與和PaVOB聯合應用;c.慶大霉素與和PaVOB聯合應用a. Combination application of ceftriaxone and PaVOB; b. Combination application of enrofloxacin and PaVOB; c. Combination application of gentamicin and PaVOB

如圖6b所示,PaVOB只有在效價為107PFU·mL-1時,對恩諾沙星的殺菌效果起到增強作用,低效價產生抑制作用,細菌清除率下降20%～90%。慶大霉素與PaVOB聯合使用見圖6c,PaVOB對慶大霉素未表現出明顯的增強或者抑制作用,慶大霉素的MIC無明顯變化。

3 討 論

本研究從廣州南方醫院污水中分離鑒定出長尾噬菌體PaVOB,能夠100%裂解臨床分離銅綠假單胞菌菌株,獲得直徑為2～3 mm的噬菌斑。但PaVOB表現出一個較窄的宿主譜,相比于噬菌體BrSP1對37株銅綠假單胞菌菌株有51.4%的裂解率[16],PaVOB僅僅裂解了17.2%的測試菌株,甚至有些噬菌體PPaMa1/18對銅綠假單胞菌臨床分離株的裂解率達到85.7%[17]。

3.1 銅綠假單胞菌噬菌體生物學特性分析

研究噬菌體的生物學特性有助于更好的在臨床中應用噬菌體。本研究中的PaVOB的最佳MOI為0.001,表明噬菌體可以在小的數量級感染多達10倍甚至1 000倍的細菌,在實際抗菌方面能發揮出強大作用。PaVOB的潛伏期為10 min,裂解期為120 min,與Kumar等[18]分離的噬菌體2019SD1以及Ma和Lu[19]分離的噬菌體SMP相比,PaVOB的潛伏期更短,表明噬菌體可以更快地感染細菌,體現出PaVOB的高效性。PaVOB在10 min內的吸附率更高,為99.1%,更快地吸附速度有利于及時消滅病原菌,同時也體現了噬菌體對宿主菌獨特的吸附機制,這可能與特異性受體有關。

噬菌體對環境的適應性對于臨床應用至關重要。本研究顯示,在-20～60 ℃溫度范圍內,PaVOB活性相對穩定,PaVOB在60 ℃時還具有61%的存活率,噬菌體耐低溫能力較強,有利于在實際環境中生存。PaVOB在pH3～pH12的范圍內都具有活性,表明其能夠在多數酸堿環境中存活。

3.2 銅綠假單胞菌噬菌體全基因組測序分析

研究噬菌體全基因組,能夠進一步鑒定和了解物種信息,本研究經過高通量測序,鑒定出新的噬菌體PaVOB,通過NCBI進行全基因組序列比對,與其親緣關系最近的是銅綠假單胞菌噬菌體(相似性大于95%),符合研究目標,說明測序結果準確。

PaVOB的基因組全長為72 179 bp,基因組與銅綠假單胞菌噬菌體PA26大小相似,為72 321 bp[20],C+G含量為54.81%,與其他噬菌體都不相同,這是由于GC含量代表物種的特征。此外,未在PaVOB中發現毒力基因和耐藥基因的存在,表明PaVOB用于臨床治療中的可能性,安全性能得到一定程度的保證。tRNA基因是一種噬菌體可以選擇性整合到其基因組中的轉運基因,可能有助于提高噬菌體的毒力,以達到更好的適應性,本文中PaVOB沒有tRNA編碼基因,表明噬菌體作為一種寄生病毒自身不能合成蛋白質的特點。從進化關系分析,PaVOB與一個未分類的噬菌體vB PaeP FBPa1親緣關系小于0.1,也可以推測出vB PaeP FBPa1可能是長尾噬菌體,進化結果也說明了PaVOB為長尾噬菌體科新發現的成員,再一次展示出噬菌體在自然界中的多樣性和豐富性,是寶貴的研究材料。

PaVOB 的ORF功能主要分為DNA復制與調控、裂解蛋白和結構蛋白。RNA聚合酶、單鏈DNA結合蛋白、DNA聚合酶I、dUTPase和dUTP核苷酸水解酶都參與DNA復制以及轉錄過程,對子代的復制有著不可忽視的作用;噬菌體終止酶能夠包裝基因組,終止酶大亞基和小亞基構建成終止酶,然而不同的噬菌體大亞基功能不同,例如噬菌體P22的終止酶大亞基(gp2)采用頭部機制將DNA包裝成預先形成的前衣殼結構[21];門戶蛋白的功能類似于DNA傳感器,將基因組包裝與二十面體衣殼成熟偶聯[22];裂解尾纖維蛋白與感染和裂解宿主菌有關,可能也是導致宿主特異性的一種原因,與主要衣殼蛋白都可以作為受體,通過噬菌體展示技術對其進行基因改造是擴大宿主譜的一種方法;噬菌體發揮獨特功能主要依靠結構蛋白,在噬菌體的組成、運動以及感染各個過程中都有結構蛋白發揮基礎功能,研究噬菌體的基因特性,可以通過蛋白質組技術對結構蛋白進行鑒定和分析,獲取詳細信息。

此外,PaVOB含有多的N4樣蛋白,包括N4 gp48樣蛋白、N4 gp67樣蛋白、N4 gp48樣蛋白和N4 gp55樣蛋白。N4是一種裂解性短尾噬菌體,對其基因組研究非常深入和透徹,被認為是N4噬菌體屬[23],目前很多新發現的噬菌體也被歸類到N4屬,例如LUZ7[24]和PEV2[25],這些蛋白在N4中都有特定的功能,而在PaVOB中出現,可能預示著它們之間親密的關系,也說明該屬的分布廣泛,是最早被分離研究的噬菌體之一,之后可以參照N4對其基因組進行詳細分析。

3.3 噬菌體與抗生素聯合應用分析

本研究選用三種不同抑菌機制的抗生素與PaVOB體外聯合應用,旨在探索兩者的聯合效果,發揮出更強大的抗菌作用,而且噬菌體與抗生素聯合應用還能大大降低細菌耐受的概率,也是一種對抗超級細菌的手段。頭孢曲松是頭孢菌素類抗菌藥,主要通過抑制細菌細胞壁的合成而發揮抗菌作用。在此研究中,PaVOB與頭孢曲松聯合應用有增強作用,且與噬菌體濃度有關,噬菌體濃度在106～107PFU·mL-1時,與頭孢曲松聯合殺菌效果最好。根據之前的研究,亞抑菌濃度的頭孢曲松與噬菌體協同作用會導致銅綠假單胞菌細胞顯著伸長和絲狀化,并提供一種排除干擾噬菌體增殖的作用方式[26],盡管具體機制還未明確,但是這種結果令人信服,Xu等[27]也證實噬菌體vB_1086與頭孢曲松具有協同作用。

恩諾沙星是喹諾酮類抗生素,又稱乙基環丙沙星,其抗菌機制主要是阻斷細菌DNA的復制。本研究中,PaVOB只有在效價為107PFU·mL-1時,對恩諾沙星的殺菌效果起到了增強作用,低效價甚至產生抑制作用。由于恩諾沙星與噬菌體聯合應用的報道并不多見,因此參考同一類的環丙沙星,根據Knezevic等[26]的研究,環丙沙星與噬菌體協同作用也會導致銅綠假單胞菌細胞顯著伸長和絲狀化,還有種可能是噬菌體清除掉細菌生物膜之后,使恩諾沙星的穿透性更強,直接作用在細菌體內,從而起到協同作用,這與Akturk等[28]的研究結果相似,同時需要考慮聯合治療中抗生素濃度和抗生素作用時間對協同應用的影響,例如一項研究顯示,在加入噬菌體6 h后添加最低抑菌濃度的抗生素,聯合處理可防止細菌再生[29]。

慶大霉素屬于氨基糖苷類抗生素,抗菌機制為抑制蛋白質合成與30 S核糖體亞基結合并破壞細胞包膜。本研究中慶大霉素與PaVOB聯合使用,未表現出任何作用。這可能與噬菌體類型有關,先前報道指出,絲狀噬菌體可以增加銅綠假單胞菌對慶大霉素的敏感性[30],不僅如此,氨基糖苷類抗生素還會通過阻斷感染周期的早期步驟來抑制噬菌體感染[31],因此,在測試噬菌體與抗生素的聯合效果時,需要考慮到噬菌體的類型和抗生素的種類,減少不必要的工作。

4 結 論

分離鑒定出一株具有雙鏈DNA基因組的長尾噬菌體PaVOB,進化關系顯示其為新發現的噬菌體,未攜帶毒力基因等有害基因。生物學特性表明其對環境適應性良好。體外聯合用藥結果表明,PaVOB與頭孢曲松聯合應用有協同作用,PaVOB在效價為107PFU·mL-1時,與恩諾沙星產生協同作用。該噬菌體具有用于臨床治療中的可能性,為進一步研究銅綠假單胞菌噬菌體制劑奠定了基礎。