基于高分辨率熔解曲線檢測MD腫瘤微衛星不穩定性

史澤風,李翎旭,郭譯文,廖 云,孫昭宇,王來榮,楊德吉,姚大偉

(南京農業大學動物醫學院,南京 210095)

馬立克病(Marek′s disease,MD)是雞的一種傳染性腫瘤病,以淋巴組織增生和腫瘤形成為主要特征[1]。近年來,我國山東、河南、吉林、廣西等地不斷有從免疫雞群中分離到MDV強毒株的報道,因此MD仍然是雞最重要的傳染病之一,MD腫瘤發生、發展機制和有效防控仍是該病研究的重要方向。病毒誘發的腫瘤是病毒致瘤因子和宿主之間的相互作用的結果,宿主自身基因的變化也是腫瘤形成的重要因素。宿主基因突變是腫瘤形成過程中的關鍵驅動力量,腫瘤的產生被認為依賴于獲得的遺傳不穩定性[2],而基因組微衛星不穩定性(microsatellite instability,MSI)是遺傳不穩定性的主要形式,表現為腫瘤組織相對于健康組織微衛星序列重復單位的插入或缺失,造成微衛星長度的改變[3]。研究表明多種病毒性腫瘤,如人類T細胞白血病病毒1型,丙型肝炎病毒,EB病毒等誘導的腫瘤中都存在基因組不穩定性[4-6]。研究還發現EBV DNA酶可能直接誘導人上皮細胞DNA損傷或者間接抑制DNA修復,導致MSI,基因突變,繼而發生癌變[6]。關于微衛星不穩定的檢測目前主要有PCR單鏈構象多態性(PCR-SSCP)、多重熒光PCR毛細管電泳法、二代測序(NGS)等方法。PCR-SSCP操作復雜,耗時較長,不適用于高通量的檢測。多重熒光PCR毛細管電泳法是檢測MSI的方法學“金標準”,但是操作過程復雜,熒光標記引物費用較高,結果判斷中會面臨熒光過強或過少,非特異性峰、不顯著的峰大小改變,雜合性缺失等問題[7]。NGS與傳統PCR方法相比具有通量高、靈敏度強和特異性強等特點,可以實現對樣本中多個微衛星位點和多個疾病相關基因同時檢測,但是由于成本和周轉時間的限制,使得基于NGS的MSI檢測方法未能在臨床實踐中常規使用[8]。高分辨率熔解曲線(high resolution melting,HRM)是2003年興起的一種基因序列分析新技術,不僅可檢測基因單核苷酸多態性、插入缺失、串聯重復序列、甲基化和線粒體單體型,而且還可用于突變掃描和熒光聚合酶鏈反應儀的溫度校驗。具有快速、準確、廉價、閉管操作等優點,現已廣泛用于醫學、遺傳學、微生物學、動植物學、法醫學和農業等學科[9]。因此本研究采用HRM方法檢測MD腫瘤基因組微衛星序列相對于健康組織(肌肉組織)的變化,揭示MD腫瘤發生后MSI現象。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

LightCycler 480 High Resolution Melting Master購自Roche公司。蛋白酶K購自天根生化(北京)有限公司。DNA提取酚試劑購自北京索萊寶科技有限公司。裂解液(100 mmol·L-1Tris-HCl,25 mmol·L-1EDTA,1% SDS)。枸櫞酸葡萄糖合液(二水枸櫞酸鈉13.2 g,一水枸櫞酸4.8 g,一水葡萄糖14.7 g,溶于1 L水中)。TE緩沖液(10 mmol·L-1Tris-HCl,1 mmol·L-1EDTA,pH 7.6)

1.2 樣品采集

山東某雞場,京紅蛋雞,1日齡接種MDV疫苗,4月齡發病,觀察整個雞群的健康狀況以及臨床癥狀。頸靜脈放血,處死,然后打開腹腔觀察肝、脾、腎、睪丸、卵巢等內臟器官的病理變化。血液樣品:挑選精神沉郁、羽毛蓬松,消瘦,后麻痹的病雞,心臟采血,枸櫞酸葡萄糖合液抗凝,保存于凍存管中。組織樣品:每只雞采集肌肉、肝、脾、腎和腫瘤等組織樣品,組織取樣在組織離體30 min內完成,取樣動作迅速,將組織切成小塊,一份置于離心管內,放于泡沫箱中,冰塊低溫運輸保存,用于DNA提取;一份放入青霉素瓶內,加入10倍體積的10%福爾馬林溶液,常溫運輸保存,用于組織病理學檢查。

1.3 組織病理學檢查

取出10%的福爾馬林中固定的肝組織修剪成小塊,經過脫水、透明,浸蠟制備石蠟包埋切片,然后進行HE染色,光學顯微鏡觀察組織病理學變化并拍照記錄。

1.4 病毒 PCR檢測

取組織樣品0.1 g置于2 mL離心管中,加入1 mL裂解液,用電動勻漿器研磨組織,形成組織懸液。采用蛋白酶K消化、苯酚抽提的方法提取樣品中總DNA[10]。馬立克病病毒(MDV)檢測采用引物MDVmeqF:5′-GCGAATTCTATGTCTCAGGAGCCAGAGCC-3′,MDVmeqR:5′-TTATCT-CGAGTCAGGGTCTCCCGTCACC-3′,擴增MDV基因片段長度為1 039 bp[11];禽白血病病毒(ALV)檢測采用引物ALV F:5′-CATGCCTGTAGTGATTAAGACA-3′,ALV R:5′-TCTAGCACATATTTGATTATC-3′,擴增目的片段大小675 bp[12];禽網狀內皮組織增生癥病毒(REV)檢測采用引物REV F:5′-CGCTGGCTCGCTAACTGCCAT-3′,REV R:5′-ACGGATTCAGTCCGGATCCCT-3′,擴增目的片段大小467 bp[12];PCR產物送生工生物工程(上海)股份有限公司進行雙向測序。得到的序列采用DNAstar軟件包的中SeqMan軟件進行拼接,得到的meq基因序列在NCBI數據庫中(https:∥blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)與國內外的MDV分離株meq基因序列進行比較。

1.5 微衛星位點選擇與引物的合成

參考雞遺傳圖譜,根據本實驗室前期的研究結果[13],選擇15個微衛星標記(ABR0026、ABR0382、ABR0433、MCW0036、MCW0200、MCW0220、ABR0672、ADL0198、ABR0549、ABR0287、ABR0532、ADL0268、LEI0104、LEI0124)進行高分辨率熔解曲線分析,所有引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.6 微衛星標記HRM檢測

根據病理剖檢的結果,采集5只病變較為明顯的MD病雞的肌肉、肝、脾、血液及腫瘤結節(5號雞)樣本。采用蛋白酶K消化、苯酚抽提的方法提取樣品中總DNA。用TE緩沖液將DNA濃度統一調整為100 ng·μL-1,然后置于-20 ℃冷凍保存備用。

使用LightCycler 480實時熒光定量PCR系統(羅氏)配套的LightCycler 480 High Resolution Melting Master試劑(羅氏)和96孔板(白色)。20 μL PCR反應體系Master Mix(2×conc)10.0 μL,微衛星擴增的上、下游引物混合物(5 μmol·L-1)1.0 μL,MgCl2(25 mmol·L-1)2 μL,DNA模板1 μL,補水至20 μL。LightCycler 480實時熒光定量PCR系統高分辨率熔融曲線程序:采用覆蓋65～53 ℃退火溫度的降落PCR方案。PCR反應程序和參數設置如表1所示。比較分析不同樣品之間15個微衛星標記熔解曲線的差別。先觀察是否有擴增曲線,是否為特異性擴增,獲得擴增曲線后,在軟件分析模塊選項中使用Gene scanning選項進行分析,選取擴增曲線拐點前后區域進行分析,觀察曲線分群,分析系統軟件自動將不同分群曲線以不同顏色區分。

表1 HRM反應程序參數

1.7 非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測MD腫瘤的MSI

挑選HRM檢測結果中發現有明顯差異的樣品,將其PCR產物進行非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測。配制5.5%聚丙烯酰胺凝膠:丙烯酰胺∶雙丙烯酰胺溶液(29∶1)18 mL,10×TBE緩沖液10 mL,去離子水61.5 mL,甘油10 mL,加入10 mL新配制的1%過硫酸銨,然后在通風櫥中加入70 μL TEMED,充分混勻后迅速灌制凝膠,室溫聚合1 h左右備用。取4 μL PCR產物加入10 μL甲酰胺上樣緩沖液,混勻后進行94 ℃變性5 min,于冰上迅速冷卻。取5 μL樣品加到聚丙烯酰胺凝膠加樣孔中,垂直電泳儀200 V電泳,具體電泳時間由溴酚藍指示劑的位置來確定。電泳結束后用硝酸銀染色[13],在Bio-Rad凝膠成像分析儀下觀察電泳結果,并分析各泳道條帶增多、減少或位置發生改變的情況。

1.8 微衛星序列分析

同一個微衛星標記的PCR擴增產物經聚丙烯酰胺凝膠電泳后,若在同一只雞的肌肉、肝、腫瘤樣品中觀察到電泳條帶存在差異,則對差異電泳條帶進行切膠處理。用手術刀片小心切取差異的電泳條帶,將切下來的膠條置于1.5 mL的離心管中,100 μL TE緩沖液漂洗3次,每次浸泡5 min。然后將膠條置于新的離心管中,100 μL TE緩沖液浸泡12 h。取5 μL上清液作為模板,用相對應的微衛星標記PCR擴增使用的引物再次進行PCR擴增。PCR產物采用2%瓊脂糖凝膠電泳35 min,切取電泳條帶,采用普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒純化PCR產物。純化的PCR產物送生工生物工程(上海)股份有限公司進行雙向測序。得到的序列采用DNAstar軟件包的中SeqMan軟件進行拼接,采用MegAlign軟件比較肌肉、肝、腫瘤擴增片段的基因序列的差別。

2 結 果

2.1 MD臨床癥狀及病理學變化

患病雞表現為精神萎靡,消瘦,羽毛蓬亂,個別雞翅膀下垂,劈叉姿勢,扭頭、仰頭等癥狀,死亡率約30%。剖檢后主要的病理變化如圖1所示,肝體積增大,少數病雞(約3%)肝表面有孤立的隆起結節,多數病雞(約90%)肝表面和切面有灰白色的結節。脾腫大(約80%),表面和切面有灰白色的致密的結節樣病灶。腎腫大(約70%),表面和切面有灰白色的致密的結節樣病灶。其他內臟器官病理變化不明顯。少數(約5%)雞坐骨神經輕度增粗,水腫。組織病理學檢查如圖2所示,低倍鏡下可見肝小葉之間界限不清,肝小葉內有多個腫瘤灶,高倍鏡下可見肝竇內大量腫瘤細胞浸潤,肝細胞嚴重變性壞死,肝竇擴張,可見肝索排列紊亂,腫瘤細胞形態多樣,包含大、中、小淋巴細胞,成淋巴細胞,核質比高,部分腫瘤細胞可見有絲分裂像。

A. 肝腫大,表面及切面大量灰白色小結節;B. 脾腫大,表面大量灰白色小結節;D. 腎腫大,表面大量灰白色小結節A. The liver was enlarged with numerous small gray-white nodules on the surface and in the section of the liver; B. The spleen was enlarged with numerous small gray-white nodules on the surface; C. The kidney was enlarged with numerous small gray-white nodules on the surface

2.2 MDV meq基因測序分析

隨機挑選5個腎組織樣品進行PCR擴增,結果如圖3所示,5個樣品均能夠擴增出MDV 1 039 bp的meq基因目的片段,而ALV和REV病毒PCR擴增均為陰性,進一步說明這些病雞為MDV感染,不存在ALV和REV病毒感染及混合感染的情況。測序后與NCBI數據庫中的MDVmeq基因進行序列比較,此次山東分離的MDV毒株與近年來我國境內江蘇分離株JS201801相同,相似性為100%,與其他省市分離株(河南HNXZ101,山東QD01311,廣東GD20QY04A,安徽AN-1,吉林JL/1404,黑龍江WC/1203,廣西GX0101)的相似性也高達99.69～99.90%。與國外早期分離的經典強毒株(848A、MD5、RB1B)相似性為98.64%～99.16%。與常用的疫苗毒株的相似性略低,與CVI988疫苗株相似性為98.26%,與814疫苗株相似性為98.96%。此次山東分離株與國內近年來分離的強毒株處于同一分支,親緣關系較近,與國外強毒株和疫苗毒株親緣關系較遠。

1、4、7、10、13. MDV檢測;2、5、8、11、14. ALV檢測;3、6、9、12、15. REV檢測;M.DL2000 DNA相對分子質量標準;17～19. MDV,ALV,REV陰性對照1, 4, 7, 10, 13. Detection of MDV;2, 5, 8, 11, 14. Detection of ALV;3, 6, 9, 12, 15. Detection of REV;M.DL2000 DNA marker; 17-19. Blank control of MDV, ALV, REV

2.3 HRM分析

采用LightCycler 480系統中的Gene scanning選項進行熔解曲線分析,得到歸一化處理后的差異熔解曲線,如圖4所示,15個微衛星標記中有14個微衛星標記存在肌肉組織和其他組織(肝、脾、血液、腫瘤)之間熔解曲線差異,即存在微衛星不穩定性(MSI)。

圖4 14個微衛星標記的高分辨率熔解曲線(差異熔解曲線)Fig.4 HRM of 14 microsatellites (difference plots)

統計不同病雞和不同微衛星標記熔解曲線的差異如表2所示,5號病雞存在明顯較大的腫瘤結節,15個微衛星標記中14個存在差異。其他4只病雞主要表現為臟器腫大,組織內彌漫性分布灰白色的腫瘤小結節,與正常組織之間沒有明顯的界限,存在MSI的微衛星標記較5號雞少。其余4只雞15個微衛星標記存在MSI的頻率分別為3/15,2/15,5/15,7/15。同一個微衛星標記在不同的發病雞樣品中出現MSI的頻率不相同,在15個微衛星標記中,MCW0200和MCW0220兩個微衛星標記出現MSI的頻率最高,在所有的發病雞樣品中都存在MSI。其次是ABR0549微衛星標記,在4只雞的樣品中存在MSI現象。另外,ADL0198微衛星標記在所有雞的樣品中都不存在熔解曲線的差異。

表2 不同病雞和不同微衛星熔解曲線差異統計分析

2.4 非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測及序列分析

挑選HRM檢測結果中發現的有明顯差異3個微衛星標記(MCW0200、ABR0549和ABR0220)的樣品,進行非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳,結果如圖5所示,腫瘤、肝、脾和肌肉組織之間的電泳條帶的大小存在明顯的差異。MCW0200微衛星標記肌肉組織樣品的PCR產物條帶小于腫瘤、肝、脾組織。ABR0549和ABR0220微衛星標記肌肉、肝、脾組織樣品的PCR產物小于腫瘤組織。對存在差異的條帶進行切膠測序分析,序列的峰圖比較如圖6所示,MCW0200微衛星標記腫瘤組織中簡單重復序列(CA)重復15次,比肝和肌肉組織中的重復次數增加了6次,腫瘤中(TA)重復了2次,比肝和肌肉組織中的重復次數減少了1次,另外肝中比腫瘤和肌肉中增加了2個堿基(AA)序列。ABR0549微衛星標記腫瘤組織中增加了2個(CA)重復。MCW0220微衛星標記腫瘤、肝、肌肉組織中的簡單重復序列的重復次數沒有差異,但是腫瘤相對肝和肌肉組織插入了一段GAGTGTTT序列。

A. MCW0200(1. 肝;2. 腫瘤;3. 肌肉;4. 脾);B. ABR0549(1. 腫瘤;2. 肝;3. 肌肉;4. 脾);C. MCW0220(1. 脾;2. 肌肉;3. 腫瘤;4. 肝)A. MCW0200 (1. Liver; 2. Tumor; 3. Muscle; 4. Spleen); B. ABR0549 (1. Tumor; 2. Liver; 3. Muscle; 4. Spleen); C. MCW0220 (1. Spleen; 2. Muscle; 3. Tumor; 4. Liver)

3 討 論

馬立克病是馬立克病病毒感染雞后引起的一種淋巴細胞增生為主要特征的病毒性腫瘤病,雖然疫苗能較好地預防該病的發生,但伴隨著病毒自身進化及疫苗免疫壓力,MDV流行毒株的毒力正不斷增強,因此MD腫瘤發生發展的機制和有效防控仍是該病研究的重要方向[14]。山東省農業科學院檢測2022年第3季度MD發病率為3.33%[15]。本研究從山東某雞場采樣,該雞場雞群發病年齡為4月齡,主要的臨床表現符合MD腫瘤發病后消瘦,精神沉郁的特點,同時也表現出神經系統損傷后翅膀下垂,后肢麻醉,頭頸歪斜等特點。病理剖檢可以看到肝、腎、脾等臟器表面和內部有大量灰白色結節狀的腫瘤病灶,符合MD內臟腫瘤的特點。組織病理學符合MD腫瘤細胞大小不一淋巴細胞的特征。PCR也能檢測到病料中的MDV,因此確診該雞場雞群患MD。雖然該雞群1日齡已經接種過MDV疫苗,但是仍然發生MDV感染,且meq基因序列與國內近年分離的強毒株相似性高達99.69～100%,說明MDV可能突破目前商品疫苗所提供的保護,這給MD的防控帶來了新的挑戰[16]。

目前存在很多關于腫瘤發生的理論,包括原癌基因的激活和抑癌基因的失活、細胞增殖周期控制點的失控、基因組的不穩定、端粒酶耗損、抗凋亡基因過表達等理論,這些理論的共同特點:腫瘤是由于DNA受到損傷,遺傳物質改變引起的[2]。病毒感染或表達的蛋白也可以直接或間接的激活DNA損傷信號通路。MDV感染使機體產生氧化應激反應,抗氧化酶活性降低,丙二醛、蛋白羥基和一氧化氮濃度升高,大量自由基在體內蓄積,造成DNA損傷[17]。MDV感染抑制DNA損傷應答(DDR)通路,DDR信號通路受損使得細胞的DNA復制正確率下降以及DNA修復功能遭到破壞,這些效應共同加劇了細胞基因組的不穩定性,這些基因組的不穩定性可進一步導致細胞的癌變或病變[18]。MSI是遺傳不穩定性的主要形式,MSI最早發現于遺傳性非息肉性結腸癌中,目前在許多腫瘤中都發現MSI現象,如結直腸癌、膀胱癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌等惡性腫瘤[19]。本研究發現在MD腫瘤中也存在微衛星不穩定的現象,15個微衛星標記中14個微衛星標記擴增后均表現為不穩定,這與醫學上發現的腫瘤MSI現象相似[18]。同時也發現,來源于不同雞的組織發生MSI的頻率不同,本研究5號雞發生的MSI的微衛星個數為14個,而其他雞只有7個及以下。主要由于5號雞樣本中有腫瘤組織,肝上存在明顯的腫瘤結節,而其他雞的樣本僅表現為肝、脾腫大,表面有小結節,腫瘤組織與正常組織之間的界限不清,在取樣時腫瘤組織中?；煊姓５慕M織,檢測時正常組織PCR擴增產物會掩蓋腫瘤組織的PCR產物,因此發生MSI的微衛星的個數沒有腫瘤多。

目前關于腫瘤基因突變的檢測技術方法(電泳、質譜、測序等)操作復雜,時間較長,費用成本較高[20]。高分辨率熔解曲線分析技術(HRM)是近年來發展起來的用于突變掃描和基因分型的新技術。熔解曲線與DNA的序列長度、GC含量及雙鏈互補性相關,堿基序列發生替換、缺失、插入等改變均可引起DNA熔解曲線的變化,通過高靈敏度熒光定量PCR儀檢測的熔解曲線變化,把野生型、純合突變型及雜合突變型予以鑒別[21]。HRM技術在基因突變篩查中具有較高的靈敏度,研究表明HRM檢測結腸癌患者KRAS基因突變,檢出率高于Sanger測序法,檢測敏感性為100%,特異性為95.24%,而且操作簡便、節約時間[22]。HRM在檢測小于400 bp的PCR產物時,靈敏度特異性均為100%;而檢測長達1 000 bp的PCR產物時,靈敏度仍高達96.1%,特異性99.4%[20],變異位點在PCR產物的位置并不影響掃描的精確性。微衛星DNA片段長度通常小于350 bp,正好在HRM檢測范圍內,所以用HRM方法檢測MSI方便適用。本研究采用LightCycler 480系統中的Gene scanning得到歸一化處理后的差異熔解曲線,正常組織和病變組織或腫瘤組織之間的熔解曲線形狀存在明顯的差異。為進一步驗證這種差異,將各組織的PCR產物進行非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳,結果也發現不同組織之間的電泳條帶的大小也存在差異,通過切膠純化、測序的結果進一步證明他們之間的差別,腫瘤或病變組織相對于正常組織存在微衛星重復單位的增多或減少,基因片段的插入等情況。上述結果說明HRM技術可以應用于腫瘤中MSI的檢測,且操作簡單,可實現高通量的檢測。

4 結 論

本研究采集MD自然發病雞的組織樣本,通過高分辨率熔解曲線分析技術發現MD發病雞的肌肉、肝、脾、血液、腫瘤組織中微衛星標記PCR擴增后的熔解曲線存在明顯的差異,堿基序列存在微衛星重復單位的增多、減少或基因片段的插入或缺失,即存在MSI現象。腫瘤生物學研究表明MSI是錯配修復(mismatch repair,MMR)系統缺陷的表現形式,MMR系統是細胞復制后的一種修復機制,該系統能特異性地識別和修復DNA復制過程中出現的堿基錯配、插入和缺失等,從而起到維持整個基因組穩定、降低自發突變的功能,同時也是防止腫瘤發生的重要屏障[2]。然而在MD腫瘤形成過程中是否伴有宿主MMR功能的異常尚沒有相關的研究報道,這也為MD腫瘤形成機制的研究提供了新的思路。