大腸桿菌感染奶牛乳腺上皮細胞和小鼠乳腺組織致其線粒體損傷的機制研究

莊翠翠,韓 博

(1.山西農業大學動物醫學學院,晉中 030801;2.中國農業大學動物醫學院,北京 100193)

奶業是我國畜牧業發展的支柱性產業。奶牛乳腺炎仍然是奶牛最常見,也是最具挑戰性的疾病之一。奶牛乳腺炎不僅會影響動物福利,也會造成牛奶質量下降,從而嚴重地影響奶業的發展并造成巨大的經濟損失[1]。奶牛乳腺炎的嚴重程度不僅取決于入侵病原體的種類和致病力,也受奶牛自身如哺乳期、年齡、胎次、自身免疫力以及外界飼養環境和擠奶方式等的影響,但病原微生物感染仍是引起奶牛乳腺炎最主要的病因[2]。目前有150多種病原體會誘發奶牛乳腺炎。根據病原體的不同,奶牛乳腺炎可分為細菌性乳腺炎、真菌性乳腺炎、藻類性乳腺炎和支原體性乳腺炎,其中發生率最高,病情最嚴重且經濟損失最大的是細菌性乳腺炎[3]。根據細菌的不同來源及傳播方式,奶牛乳腺炎的致病菌可以分為傳染性病原菌、機會性病原菌和環境性病原菌,其中傳染性病原菌主要有金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌等,機會性病原菌主要有表皮葡萄球菌、模擬葡萄球菌和產色葡萄球菌等,環境性病原菌主要有克雷伯桿菌、化膿隱秘桿菌和大腸桿菌(Escherichiacoli,E.coli)等[4]。

E.coli是引起奶牛乳腺炎最常見的環境致病菌之一。Gao等[5]對我國161個牛場的3 288份臨床乳腺炎來源的牛奶樣本進行分析,發現最多的病原菌是E.coli,占14.4%。E.coli感染會引起奶牛乳腺發生急性腫脹、疼痛和發熱,乳汁呈水樣、帶血或凝乳,產奶量急劇減少,并伴有毒血癥的臨床癥狀,如體溫升高、心率加快、精神沉郁和食欲不振[6-7]。盡管環境乳腺炎受到管理實踐的高度影響,但畜群結構和不斷提高的牛奶質量標準使乳腺炎成為一種復雜的疾病,且乳腺炎仍然是乳制品行業的首要問題[1,8]。目前,抗生素依然是國內外獸醫人員治療奶牛乳腺炎最常用的方法[9],然而抗生素大量且不合理的使用甚至濫用導致了耐藥致病菌株的出現和傳播以及畜產品抗生素殘留等問題,進而威脅著人類公共衛生安全。線粒體作為細胞中重要的兩層膜細胞器,不但能為細胞供給能量,還參與了細胞生長、分化和細胞周期調控、信息傳遞以及細胞凋亡等。但E.coli感染對線粒體的損傷機制仍不清晰。因此,本研究旨在進一步探究E.coli感染對奶牛乳腺上皮細胞線粒體的影響及其機理,為尋找安全、高效的抗生素替代品提供新思路且為E.coli性奶牛乳腺炎的防治提供新方向。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及奶牛乳腺上皮細胞

分娩1周的12周齡SPF級昆明小鼠購自北京斯貝福生物技術有限公司,飼養于山西農業大學實驗平臺的動物房內,每籠3只母鼠,自由采食和飲水。動物房溫度23 ℃±3 ℃,濕度50%±10%,每小時換氣15次,每天光照12 h。

奶牛乳腺上皮細胞系MAC-T[購自上海晶馬生物科技有限公司]在含有10%胎牛血清的DMEM中培養,傳8代后用于后續試驗。

1.2 E.coli培養

E.coli菌株由本實驗室前期從內蒙古患有臨床型乳腺炎的奶牛乳樣中分離并儲存于-80 ℃冰箱中[10],用血平板復蘇后,在Luria-Bertani肉湯培養基中培養至對數生長期用于后續試驗。該患病奶牛直腸溫度高達40.0 ℃,產奶量下降,牛奶中含有大量凝塊,乳腺組織持續腫脹。此外,本E.coli菌株在預試驗中能夠誘發小鼠乳腺炎。

1.3 試驗設計

將18只分娩1周的12周齡SPF級昆明小鼠母鼠隨機分成3組,分別為空白對照(Control)組、大腸桿菌(E.coli)組和脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)組,每組6只。全部小鼠左腿肌肉注射50 mg·kg-1體重舒泰50麻醉后,保定于體視顯微鏡下,利用無菌超微注射器對E.coli組母鼠的右側第4對乳腺導管注射25 μLE.coli生理鹽水溶液(包含106CFUE.coli),LPS組注射25 μL 20 mg·kg-1體重LPS生理鹽水溶液[11],Control組注射等量的無菌生理鹽水,處理后24 h,實施安樂死并收集乳腺組織。

以第9代奶牛乳腺上皮細胞為研究對象,隨機分成3組,分別為空白對照(Control)組、大腸桿菌(E.coli)組和脂多糖(LPS)組,Control組未被E.coli感染且未被LPS處理;E.coli組被感染復數為5的E.coli感染6 h,LPS組被1 μg·mL-1LPS處理6 h,重復3次試驗,每組3個重復,根據后續試驗需求收集感染后的奶牛乳腺上皮細胞。

1.4 測定指標及方法

1.4.1 乳腺上皮細胞角18蛋白免疫熒光鑒定 第9代奶牛乳腺上皮細胞生長于細胞爬片后,將細胞爬片上的奶牛乳腺上皮細胞置于500 μL 4 mL·L-1多聚甲醛中冰育固定10 min,磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline,PBS)洗滌3次,再加入500 μL的0.2% Triton X100透化,冰育7 min,PBS洗滌3次。細胞爬片室溫下于1%牛血清白蛋白封閉液中封閉60 min,加入鼠源角18蛋白抗體(購自Abcam公司,200倍稀釋),4 ℃孵育60 min,PBS洗滌3次,加入異硫氰酸熒光素標記的山羊抗鼠二抗IgG(1 000倍稀釋),室溫下避光孵育30 min,PBS洗滌3次后,利用4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-diaminyl-2-phenylindole,DAPI)避光孵育5 min,然后PBS洗滌3次。細胞爬片覆蓋到含有抗熒光淬滅劑的載玻片上,利用激光共聚焦顯微鏡觀察染色情況。

1.4.2 乳腺上皮細胞透射電鏡檢測 第9代奶牛乳腺上皮細胞經過不同的處理后,利用2.5%電鏡固定液固定奶牛乳腺上皮細胞,4 ℃固定過夜后,采用梯度酒精和丙酮溶液脫水,丙酮樹脂混合溶液聚合48 h后,超薄切片機切片,利用3%醋酸鈾-枸櫞酸鉛雙染色,透射電鏡拍照。

1.4.3 小鼠組織病理學檢測 母鼠安樂死后,迅速收集各組乳腺組織并于室溫固定于10%中性福爾馬林溶液中12 h后,流水沖洗2 h,70%～95%梯度酒精脫水,二甲苯透化和石蠟包埋后切片。制備好的石蠟切片經二甲苯透化、70%～95%梯度酒精脫水和蒸餾水脫蠟后進行蘇木素-伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色,染色后的切片用中性樹膠封片,在光學顯微鏡下觀察乳腺組織的病理學變化。

1.4.4 線粒體純度測定 嚴格按照線粒體提取試劑盒(購自南京建成生物工程研究所)說明書提取第9代奶牛乳腺上皮細胞和小鼠乳腺組織線粒體后,根據Caro等[12]的研究方法測定線粒體的純度,主要通過檢測線粒體和細胞質組分內ATP合成酶α亞基(ATP synthetase alpha subunit,ATP5A,一種線粒體標記物)和乳酸脫氫酶(lactic dehydrogenase,LDH,一種細胞漿標記物)的免疫印跡衡量線粒體的純度。嚴格按照BCA蛋白濃度測定試劑盒(增強型,購自碧云天生物技術有限公司)說明書測定線粒體勻漿和細胞質組分蛋白濃度,標準品(0、0.025、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg·mL-1)和待測樣本中加入200 μL BCA工作液(50體積BCA試劑A與1體積BCA試劑B混勻),37 ℃孵育30 min,D(562 nm)檢測吸光光度值,根據標準曲線計算待測樣品的蛋白濃度。線粒體勻漿和細胞質組分分別加入上樣緩沖液,混勻100 ℃煮沸5 min制成蛋白樣品。選取30 μg蛋白樣品加入到丙烯酰胺凝膠(上層5%濃縮膠和下層10%分離膠)上樣孔內,80 V濃縮20 min后,120 V分離90 min,200 mA轉膜90 min,0.2 μm聚偏二氟乙烯膜于含有5%脫脂奶粉的Tris-HCl緩沖鹽溶液封閉液(含0.1%吐溫20)中封閉90 min后,ATP5A(購自Abcam公司,稀釋1 000倍)、LDH(購自Santa Cruz Biotechnology公司,稀釋1 000倍)和β-actin(購自北京中杉金橋生物技術有限公司,稀釋400倍)一抗4 ℃孵育過夜,含有5%脫脂奶粉的Tris-HCl緩沖鹽溶液封閉液(含0.1%吐溫20)清洗3次,每次10 min,加入山羊抗鼠(購自北京中杉金橋生物技術有限公司,稀釋2 000倍)二抗,室溫孵育60 min,含有5%脫脂奶粉的Tris-HCl緩沖鹽溶液封閉液(含0.1%吐溫20)清洗3次,每次10 min,利用化學發光儀上曝光并采集圖像。

1.4.5 奶牛乳腺上皮細胞線粒體膜通透性檢測 第9代奶牛乳腺上皮細胞經過不同的處理后,根據Halestrap[13]的研究方法測定奶牛乳腺上皮細胞線粒體膜通透性,主要通過檢測硫氰酸鉀緩沖液中線粒體腫脹程度判斷E.coli感染對線粒體的損傷。緩沖液主要含有150 mmol·L-1硫氰酸鉀、10 mmol·L-12-(N-嗎啡啉)乙磺酸、10 mmol·L-13-嗎啉丙磺酸、5 mmol·L-1Tris、1 μg·mL-1魚藤酮和1 μg·mL-1抗霉素A,經HCl或KOH調節至所需pH 7.4。奶牛乳腺上皮細胞線粒體以2 mg·mL-1的蛋白質加入到7.4 mL 硫氰酸鉀緩沖液中混勻,D(520 nm)檢測吸光光度值,根據吸光度的變化判定線粒體膜通透性的改變。若吸光度降低,表明奶牛乳腺上皮細胞線粒體膜通透性增加。

1.4.6 三磷酸腺苷(ATP)含量檢測 第9代奶牛乳腺上皮細胞和小鼠乳腺組織經過不同的處理后,嚴格按照ATP含量檢測試劑盒(購自南京建成生物工程研究所)說明書操作,檢測D(636 nm)各管吸光光度值,雙蒸水調零。

1.4.7 線粒體電子傳遞鏈復合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ活性測定 第9代奶牛乳腺上皮細胞和小鼠乳腺組織經過不同的處理后,嚴格按照線粒體呼吸鏈復合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ試劑盒(購自南京建成生物工程研究所)說明書操作,檢測D(340 nm)檢測0和5 min吸光光度值,樣品活性計算公式如下:

樣品活性=樣本容量(0.1 mL)×5.5(毫摩爾吸光系數)×反應時間/(樣本OD-背景OD)×體系容量(1 mL)×樣本稀釋倍數÷樣品蛋白濃度。

1.4.8 線粒體DNA非編碼區包含位移環區(D-Loop)基因表達量及線粒體質量檢測 第9代奶牛乳腺上皮細胞和小鼠乳腺組織經過不同的處理后,嚴格按照線粒體提取試劑盒(購自南京建成生物工程研究所)說明書提取線粒體后,再嚴格按照動物組織/細胞線粒體DNA提取試劑盒(購自北京百奧萊博科技有限公司)說明書操作提取線粒體DNA,通過引物(D-Loop引物序列為F:TAGTGCTAATACCAACGGCC;R:AGGCATTTTCAGTGCCTTGC和β-actin引物序列為F:GTCCACCTTCCAGCAGAT;R:GCTAACAGTCCGCCTAGAA)進行PCR特異性擴增,反應體系為20 μL,其中線粒體DNA 2 μL,上、下游引物各0.8 μL,SYBR Green染料10 μL和水6.4 μL。反應條件:30次循環,94 ℃變性6 min,94 ℃ 45 s,60 ℃ 45 s,72 ℃ 1 min,72 ℃ 10 min。通過2-ΔΔCt法計算D-Loop基因表達量。

1.4.9 線粒體分裂與融合相關基因檢測 第9代奶牛乳腺上皮細胞和小鼠乳腺組織經過不同的處理后,嚴格按照TRIzol試劑(購自北京全式金生物技術股份有限公司)提取奶牛乳腺上皮細胞和小鼠乳腺組織總RNA后,按照反轉錄試劑盒說明書(購自北京全式金生物技術股份有限公司)將總RNA反轉成DNA,通過NCBI Gene中基因序列合成引物(表1)進行PCR特異性擴增,反應體系為25 μL,其中DNA模板2 μL,上、下游引物各1 μL,SYBR Green染料12.5 μL和水8.5 μL。反應條件:35次循環,95 ℃變性3 min,95 ℃ 10 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min。通過2-ΔΔCt法計算基因表達量。

表1 實時定量PCR引物序列

2 結 果

2.1 奶牛乳腺上皮細胞鑒定

對生長至第9代的奶牛乳腺上皮細胞進行角18蛋白免疫熒光檢測,激光共聚焦顯微鏡拍照發現,奶牛乳腺上皮細胞胞漿中角18蛋白染成綠色,均勻分布在細胞漿內,細胞核被DAPI染成藍色(圖1A),表明奶牛乳腺上皮細胞可用于后續試驗。

A. 角18蛋白綠色染色,細胞核藍色染色。標尺=50 μm。B. ATP5A在奶牛乳腺上皮細胞線粒體勻漿和細胞質組分中的蛋白表達量。C. ATP5A和LDH在Control和E.coli組奶牛乳腺上皮細胞線粒體勻漿中的蛋白表達量。D. ATP5A在小鼠乳腺組織線粒體勻漿和細胞質組分中的蛋白表達量。E. ATP5A和LDH在Control和E.coli組小鼠乳腺組織線粒體勻漿中的蛋白表達量。mito為線粒體勻漿,cyto為細胞質組分A. Cytokeratin 18 was stained green and nuclear was stained blue. Scale bars=50 μm. B. The protein expression of ATP5A in the mitochondrial homogenate and cytoplasmic components of bovine mammary epithelial cells. C. The protein expressions of ATP5A and LDH in the mitochondrial homogenates of bovine mammary epithelial cells of Control and E. coli groups. D. The protein expression of ATP5A in the mitochondrial homogenate and cytoplasmic components of mouse mammary gland. E. The protein expressions of ATP5A and LDH in the mitochondrial homogenates of mouse mammary gland of Control and E. coli groups. moti is mitochondrial homogenate and cyto is cytoplasmic component

2.2 奶牛乳腺上皮細胞和小鼠乳腺組織線粒體純度鑒定

相對于細胞質部分,線粒體勻漿中高度表達了的線粒體的標志物ATP5A(圖1B～D)。此外,為了確定線粒體勻漿的純度,在Control和E.coli組線粒體勻漿中高度表達了ATP5A乳酸脫氫酶,而低表達乳酸脫氫酶(LDH,一種細胞質標記物;圖1C和E)。這些結果表明,奶牛乳腺上皮細胞和小鼠乳腺線粒體勻漿內線粒體純度較高,可用于后續試驗。

2.3 E.coli感染對奶牛乳腺上皮細胞超微結構的影響

利用透射顯微鏡觀察奶牛乳腺上皮細胞線粒體的結構(圖2),正常培養的奶牛乳腺上皮細胞內線粒體結構完整,細胞連接緊密(圖2A),而經E.coli感染的奶牛乳腺上皮細胞間隙增大,線粒體腫脹,線粒體嵴缺失且部分模糊消失(圖2B)。這些結果表明,E.coli感染造成了奶牛乳腺上皮細胞內線粒體損傷。

紅色箭頭標示為細胞間隙增大;黃色箭頭標示為E.coli;綠色箭頭標示為線粒體腫脹;粉色箭頭標示為線粒體嵴缺損,部分模糊消失Red arrow indicates increased intercellular space; The yellow arrow indicates Escherichia coli; The green arrows indicate mitochondrial swelling; The pink arrows indicate the mitochondrial crests′ defect and partial missing mitochondrial crests

2.4 E.coli感染對小鼠乳腺病理變化的影響

病理組織結果如圖3所示。Control組小鼠乳腺腺泡結構清晰,并有散在的乳汁;E.coli組小鼠組織腺泡壁被破壞,腺泡內有游離的中性粒細胞并有散在的淡染乳汁;LPS組小鼠組織腺泡內有游離的中性粒細胞并有散在的淡染乳汁。

黑色箭頭標示為乳汁;粉色箭頭標示為中性粒細胞;綠色箭頭標示被破壞的腺泡壁Black arrows indicate milk; The pink arrows indicate neutrophils; The green arrow indicates the damaged acinar walls

2.5 E.coli感染對奶牛乳腺上皮細胞和小鼠乳腺線粒體膜通透性及線粒體電子傳遞鏈的影響

相較于Control組,E.coli感染或LPS極顯著降低了奶牛乳腺上皮細胞和小鼠乳腺組織內線粒體電子傳遞鏈復合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ活性和ATP的含量以及奶牛乳腺上皮細胞D(520 nm)吸光值(圖4A～G,P<0.05或P<0.01)。E.coli感染分別降低了奶牛乳腺上皮細胞D(520 nm)吸光值、線粒體電子傳遞鏈復合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ活性和ATP含量的51.83%、40.22%、36.13%、60.67%、41.41%、57.48%和36.16%,LPS分別降低了奶牛乳腺上皮細胞D(520 nm)吸光值、線粒體電子傳遞鏈復合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ活性和ATP含量的45.40%、38.18%、27.91%、43.42%、32.57%、43.20%和25.15%。此外,E.coli感染分別降低了小鼠乳腺線粒體電子傳遞鏈復合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ活性和ATP含量的24.77%、71.45%、37.34%、39.38%、30.09%和27.38%,LPS分別降低了小鼠乳腺線粒體電子傳遞鏈復合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ活性和ATP含量的19.37%、58.18%、26.74%、31.24%、32.57%、25.80%和13.11%。這些結果表明E.coli感染或LPS均破壞了奶牛乳腺上皮細胞和小鼠乳腺線粒體結構的完整性,膜通透性增加,膜的流動性降低,進一步降低了線粒體傳遞電子的效率,最終導致線粒體能量代謝紊亂。

*.P<0.05;**.P<0.01。下同*.P<0.05;**.P<0.01. The same as below

2.6 E.coli感染對奶牛乳腺上皮細胞和小鼠乳腺線粒體融合/分裂的影響

相較于Control組,E.coli感染或LPS極顯著降低了奶牛乳腺上皮細胞和小鼠乳腺內動力蛋白相關蛋白1(Drp1)和線粒體分裂蛋白1(Fis1)調控。此外,線粒體融合蛋白1(Mfn1)、線粒體融合蛋白2(Mfn2)和蛋白質視神經萎縮1(OPA1)mRNA表達(圖5A～E,P<0.05或P<0.01)。E.coli感染分別降低了奶牛乳腺上皮細胞內Drp1、Fis1、Mfn1、Mfn2和OPA1 mRNA表達的38.00%、42.67%、35.00%、30.00%和44.00%,LPS分別降低了奶牛乳腺上皮細胞內Drp1、Fis1、Mfn1、Mfn2和OPA1 mRNA表達的32.00%、33.00%、32.67%、33.00%和35.33%。此外,E.coli感染分別降低了小鼠乳腺Drp1、Fis1、Mfn1、Mfn2和OPA1 mRNA表達的33.57%、32.20%、22.93%、31.37%和21.23%,LPS分別降低了小鼠乳腺Drp1、Fis1、Mfn1、Mfn2和OPA1 mRNA表達的23.70%、24.20%、23.73%、30.80%和24.97%。這些結果表明,E.coli感染或LPS均抑制奶牛乳腺上皮細胞和小鼠乳腺內線粒體的融合/分裂。

2.7 E.coli感染對奶牛乳腺上皮細胞線粒體生物發生的影響

相較于Control組,E.coli感染或LPS極顯著降低了奶牛乳腺上皮細胞和小鼠乳腺內過氧化物酶增殖物激活受體γ共激活因子1α(PGC-1α)、核呼吸因子1(NRF1)和線粒體轉錄因子A(TFAM)和D-Loop的基因表達(圖6A～D,P<0.05或P<0.01)。E.coli感染分別降低了奶牛乳腺上皮細胞內PGC-1α、NRF1、TFAM和D-Loop的基因表達的25.93%、27.33%、31.67%和35.40%,LPS分別降低了奶牛乳腺上皮細胞內PGC-1α、NRF1、TFAM和D-Loop的基因表達的37.30%、24.33%、30.67%和43.07%。此外,E.coli感染分別降低了小鼠乳腺PGC-1α、NRF1、TFAM和D-Loop的基因表達的20.40%、28.50%、24.37%和40.13%,LPS分別降低了小鼠乳腺PGC-1α、NRF1、TFAM和D-Loop的基因表達的26.70%、26.60%、32.60%和28.27%。這些結果表明,E.coli感染或LPS均減少了奶牛乳腺上皮細胞和小鼠乳腺內線粒體的生物發生。

A～E. 分別為PGC-1α、NRF1、TFAM和D-Loop mRNA表達水平A-E. The mRNA expression levels of PGC-1α, NRF1, TFAM and D-Loop mRNA expressions,respectively

3 討 論

奶牛乳腺上皮細胞在奶牛乳腺應對細菌感染的過程中發揮著關鍵作用[14]。因此,奶牛乳腺上皮細胞已經成為研究奶牛乳腺炎發病機制的體外模型[15]。角18蛋白是中間纖維蛋白家族中的一員,構成多種上皮細胞骨架。因此,角18蛋白被認為是上皮細胞特有的標志物。本研究中,角18蛋白被用于鑒定奶牛乳腺上皮細胞系。研究結果表明,復蘇后的第9代奶牛乳腺上皮細胞角18蛋白染色陽性,本研究與前期研究[16]一致,表明本研究中使用的細胞系為奶牛乳腺上皮細胞。此外,在本研究中,E.coli感染和LPS處理均可引起小鼠乳腺腺泡內出現游離的中性粒細胞,這表明E.coli感染和LPS處理均可誘發乳腺炎。因此,本試驗中小鼠乳腺炎的模型已成功建立,可用于后續試驗。

A～E. 分別為Drp1、Fis1、OPA1、Mfn1和Mfn2mRNA表達水平A-E. The mRNA expression levels of Drp1, Fis1, OPA1,Mfn1 and Mfn2, respectively 圖5 E.coli感染或LPS對奶牛乳腺上皮細胞和小鼠乳腺線粒體融合/分裂的影響Fig.5 The effect of Escherichia coli infection or lipopolysaccharide on mitochondrial fusion/division in bovine mammary epithelial cells and mouse mammary gland

研究發現,ATP5A和LDH分別是線粒體和細胞漿的典型標志物[17]。本研究中,相對于細胞質部分,線粒體勻漿中ATP5A高度表達。此外,為鑒定線粒體勻漿的純度,本研究檢測了線粒體勻漿中LDH蛋白表達,發現Control組和E.coli組奶牛乳腺上皮細胞和小鼠乳腺中ATP5A高度表達,LDH也有部分表達,這表明線粒體勻漿純度較高,僅有較少量的細胞質組分污染,可用于后續試驗。

線粒體是機體多種細胞儲存和供應能量的細胞器,研究發現線粒體大小、線粒體形態變化以及線粒體膜通透性可被用于衡量線粒體損傷及降解程度[18]。本研究中,E.coli感染的奶牛乳腺上皮細胞間隙增大,線粒體腫脹,線粒體嵴缺失且部分模糊消失。此外,E.coli感染顯著降低了D(520 nm)吸光值。這些結果表明,E.coli感染破壞了奶牛乳腺上皮細胞線粒體結構的完整性,膜通透性增加,膜的流動性降低,從而導致了線粒體損傷。

線粒體主要通過涉及電子傳遞鏈的氧化磷酸化產生ATP,且能量代謝產物和標志酶可以用于判定線粒體的損傷程度[19]。線粒體電子傳遞鏈中電子的傳遞和氧化磷酸化等產能反應均發生在線粒體膜中,因此線粒體膜的損傷會造成能量代謝紊亂。在線粒體內,電子傳遞鏈復合物Ⅰ通過催化還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸的氧化脫氫生成煙酰胺腺嘌呤二核苷酸[20]。電子傳遞鏈復合物Ⅱ通過催化琥珀酸氧化為延胡索酸,進一步使輔酶Q還原成2,6-二氯吲哚酚,最終導致O2減少[21]。電子傳遞鏈復合物Ⅲ是線粒體氧化磷酸化的必需物質,也是活性氧的主要來源,通過將還原型輔酶Q的氫傳遞給細胞色素c,生成還原型細胞色素c。電子傳遞鏈復合物Ⅳ是線粒體電子傳遞鏈的終端受體,主要通過氧化細胞色素c將O2轉化為水[22]。電子傳遞鏈復合物V主要是促進產生細胞所需要的ATP能量[17]。本研究中,E.coli感染極顯著降低了奶牛乳腺上皮細胞和小鼠乳腺內線粒體電子傳遞鏈復合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ活性和ATP的含量,與LPS處理的結果一致,說明E.coli感染主要通過LPS誘導線粒體膜損傷,進而干擾了線粒體的電子傳遞鏈,最終造成奶牛乳腺上皮細胞和小鼠乳腺能量代謝紊亂。

線粒體通過調控自身的分裂與融合來改變形態以滿足細胞的需求。線粒體的分裂過程發生在線粒體外膜上,主要由Drp1和Fis1調控[23]。此外,Mfn1、Mfn2和OPA1共同介導線粒體內膜的融合[24]。在本研究中,E.coli感染極顯著降低了奶牛乳腺上皮細胞和小鼠乳腺內Drp1、Fis1、Mfn1、Mfn2和OPA1 mRNA表達,與LPS的作用一致,表明E.coli感染主要通過LPS抑制奶牛乳腺上皮細胞和小鼠乳腺線粒體的融合/分裂。

線粒體生物發生是機體和細胞對能量需求作出的反應,能夠顯著增加線粒體的質量。線粒體內表達的蛋白多數由線粒體DNA轉錄和翻譯。線粒體DNA僅包含兩個非編碼區,無內含子,非編碼區包含位移環區(D-Loop)[25]。因此,D-Loop可以用于衡量線粒體DNA的總量。PGC-1α通過激活NRF1的轉錄調節TFAM的表達,進而促進線粒體蛋白的合成、線粒體DNA的復制和轉錄以及新線粒體的生物發生,提高線粒體的質量,以適應組織、器官增加的能量需求[26]。本研究中,E.coli感染極顯著降低了奶牛乳腺上皮細胞和小鼠乳腺內PGC-1α、NRF1、TFAM和D-Loop的基因表達,與LPS的作用一致,這些結果表明,E.coli感染通過LPS減少了奶牛乳腺上皮細胞和小鼠乳腺內線粒體的生物發生。

4 結 論

本研究證明了E.coli感染主要通過LPS造成奶牛乳腺上皮細胞和小鼠乳腺線粒體能量代謝紊亂、抑制線粒體的分裂與融合以及減少線粒體的生物發生,進而造成線粒體損傷。因此,E.coli感染是通過誘導線粒體損傷造成奶牛乳腺炎,且線粒體損傷是造成乳腺損傷的重要原因之一。