白術-肉蓯蓉治療便秘的網絡藥理學分析及試驗驗證

劉元紅,胡玉歡,張 莉,楊萍瑞,胡衛東,馬 琪,畢師誠*

(1.西南大學動物醫學院,重慶 402460;2.西南大學中獸醫研究所,重慶 402460)

便秘是一種以便次減少、排便困難、糞便干結等為主癥的臨床常見腸道疾病[1],在家畜中比較常見[2]。有30%～50%的母豬在妊娠后期及產后會發生便秘[3],腸道內容物長時間聚集,內部菌群過度發酵,產生大量熱量和氣體導致脹肚,同時產生大量毒素,引發子宮炎、乳房炎、陰道炎等[4]。除此之外,便秘還會延長母豬分娩時間導致產出活仔豬數下降,糞便壓迫產道導致流產、難產[5]。動物常用治療便秘的藥物有硫酸鎂等容積性瀉藥、大黃等刺激性瀉藥、液體石蠟等潤滑性瀉藥和毛果蕓香堿等神經性瀉藥[6]。其中,中藥副作用較小、療效突出,成本相對較低,應用廣泛。白術具有健脾益氣、燥濕利水功效[7],還可以改善胃腸道功能和調節免疫[8]。肉蓯蓉有補腎陽、益精血和潤腸通便等功效[9]。治療便秘常用的藥物組合中,白術-肉蓯蓉為同現頻次較高的藥對[10]。網絡藥理學通過整合生物信息學、系統生物學相關內容,以數據庫技術、建模及分析技術和試驗技術為基礎,闡釋疾病的發生發展過程,分析藥物的作用機制。本研究通過運用網絡藥理學構建成分-靶點-疾病作用網絡,探討白術-肉蓯蓉有效成分治療便秘的作用機制,再通過動物試驗驗證白術-肉蓯蓉治療慢傳輸型便秘的效果,為今后開發相關中藥治療便秘提供思路及方向。

1 材料與方法

1.1 網絡藥理學資料與方法

1.1.1 白術-肉蓯蓉化學成分及靶點預測 借助TCMSP數據庫——中藥系統藥理學數據庫和分析平臺,在“Herb name”先后輸入“baizhu”、“roucongrong”進行檢索;所得結果按口服生物利用度OB≥30%、類藥性DL≥0.18篩選,獲得相關中藥成分。然后在“Related Targets”下的“targets infomation”查詢成分對應的靶點蛋白,導入UniProt數據庫查詢蛋白的基因名稱,并將基因名標準化。

1.1.2 便秘相關靶點的獲取及藥物成分-疾病靶點網絡圖繪制 分別在GeneCards 數據庫、OMIM數據庫、PharmGKB數據庫、TTD數據庫中以關鍵詞“constipation”檢索,收集便秘相關的靶點基因,整理后導入UniProt數據庫將基因名標準化;利用Excel中的刪除重復項功能對白術和肉蓯蓉的有效成分作用靶點及便秘相關靶點去重,然后將所得靶點導入Venny 2.1.0,構建“白術與便秘靶點”、“肉蓯蓉與便秘靶點”以及“白術-肉蓯蓉與便秘靶點”的韋恩圖。選擇“白術-肉蓯蓉與便秘靶點”的韋恩圖中交叉部分,通過“Results”中獲得的交集靶點及有效成分靶點的Mol ID建立network和tape文件,導入Cytoscape 3.7.2軟件構建白術-肉蓯蓉有效成分與便秘的靶點網絡。

1.1.3 藥物成分-疾病靶點PPI網絡構建 將成分-疾病交集靶點導入STRING數據庫的“Multiple proteins”,之后,“Organisms”選擇“Homo sapiens”,進行蛋白-蛋白相互作用(protein-protein interaction, PPI)分析?！癝ettings”最低要求交互得分設為0.4,同時選擇隱藏網絡中已斷開的節點,Clusters中集群的數量設為3,得到PPI網絡。將TSV格式數據文件導入Cytoscape3.7.2軟件,利用CentiScaPe 2.2插件對靶點蛋白互作網絡進行分析,通過度中心性(degree)、接近中心性(closeness)和中介中心性(betweenness)三個參數篩選大于閾值的數據,得到靶點核心網絡圖。

1.1.4 生物信息學GO分析及KEGG信號通路富集分析 將白術-肉蓯蓉與便秘的公共靶點導入DAVID數據庫,利用“Shortcut to DAVID Tools”中的“Functional Annotation”進行GO(Gene Ontology)的生物學過程(biological process,BP)、細胞組成(cellular component,CC)、分子功能(molecular function,MF)富集分析以及KEGG信號通路分析。其中,“Select Identifier”選擇“OFFICIAL_GENE_SYMBOL”,“Select species”選擇“human”,“List Type”選擇“Gene List”。導出結果篩選P<0.05的數據,降序排序后通過在線作圖平臺——微生信將KEGG前20位制作成富集氣泡圖,GO前10位制作成BP、CC、MF帶顏色富集條形圖。實現富集分析結果可視化,綜合預測白術-肉蓯蓉治療便秘的作用機制。

1.1.5 分子對接 為驗證核心靶點的準確性,選擇部分核心靶點與潛在靶點較多的成分進行分子對接。在TCMSP數據庫下載有效成分的3D結構,從PDB數據庫篩選下載蛋白結構并用PyMOL軟件刪除蛋白的配體和水分子。利用AutoDockTools軟件對蛋白和小分子進一步處理后進行分子對接,選擇結合較好的部分結果用PyMOL軟件進行可視化處理。

1.2 動物模型試驗驗證材料與方法

1.2.1 試驗動物 40只SPF級雄性KM小鼠,體質量18～22 g,購自斯貝福(北京)生物技術有限公司,許可證號:SCXK(京)2019-0010。試驗動物的利用遵照了西南大學倫理委員會的規定,倫理審查號:IACUC-20230213-01。

1.2.2 試劑與儀器 鹽酸洛哌丁胺、阿拉伯樹膠,上海麥克林生化科技有限公司,批號:C14425224、C14049325;枸櫞酸莫沙必利,大連美侖生物技術有限公司,批號:J0618B;白術、肉蓯蓉飲片購自重慶榮昌西城大藥行;電子天平,賽多利斯科學儀器(北京)有限公司,型號:BSA224 S-CW;定時恒溫磁力攪拌器,上海滬西分析儀器廠有限公司,型號:90-2;智能恒溫電熱套,天津工興實驗室儀器有限公司,型號:ZNHW;活性炭、1 mL注射器、灌胃針和手術器械等為本實驗室保存。

1.2.3 試驗分組及給藥 適應性喂養1周后,將小鼠隨機分為空白組(6只)和鹽酸洛哌丁胺組(34只)?？瞻捉M蒸餾水灌胃,鹽酸洛哌丁胺組以10.0 mg·kg-1灌胃給藥,前3 d每日1次,第4天開始每日早晚各1次。7 d造模成功后,將30只便秘小鼠隨機均分為模型組、陽性對照組和高、中、低劑量藥物組。晚第二次灌胃蒸餾水和鹽酸洛哌丁胺1 h后,空白組和模型組蒸餾水灌胃,陽性對照組10.0 mg·kg-1枸櫞酸莫沙必利灌胃,高、中、低劑量藥物組分別灌胃4.8,2.4,1.2 g·kg-1的白術-肉蓯蓉混懸液,連續7 d,每日1次。灌胃體積均為0.1 mL·10 g-1。給藥劑量參考人和動物間藥物等效劑量比值計算。

1.2.4 排便試驗 第7天末次給藥治療后小鼠禁食不禁水飼養24 h,灌胃蒸餾水和鹽酸洛哌丁胺,1 h后空白組、模型組、陽性對照組與高、中、低劑量藥物組灌胃相應溶液。再間隔30 min給各組小鼠灌胃0.3 mL活性炭混懸液,正常飲食飲水,記錄首粒黑便時間和12 h內排便粒數。

1.2.5 小腸運動試驗 排便試驗結束后小鼠禁食不禁水飼養24 h,各組分別予以上述同樣方法灌胃,30 min后全部小鼠灌胃0.3 mL活性炭混懸液,再間隔30 min處死小鼠。打開腹腔剪取幽門至盲腸的小腸,將其輕拉成直線測量小腸總長度及幽門到活性炭混懸液前沿的推進長度,計算小腸推進率=(小腸內碳末推進距離/小腸總長度)×100%。

1.2.6 統計學分析 應用SPSS 22.0統計分析軟件處理,組間比較選用單因素ANOVA檢驗,結果以“平均值±標準差”形式表示,P<0.05時表示差異顯著,有統計學意義。

2 結 果

2.1 網絡藥理學研究

2.1.1 “白術”、“肉蓯蓉”化學成分及靶點的篩選 通過TCMSP數據庫檢索出白術-肉蓯蓉所含化合物共130個,其中白術55個,肉蓯蓉75個。以DL≥0.18,OB≥30%進一步篩選得到白術7個,包括12-十七?；?2E,8E,10E-蒼術三醇、α-氨基比林、3β-乙酰氧基蒼術酮、8β-乙氧基白術內酯Ⅲ等,肉蓯蓉6個,包括β-谷甾醇、槲皮素、花生四烯酸、細胞因子等,見表1。除去重復項及未查詢到的基因,白術有效成分作用靶點18個,肉蓯蓉有效成分作用靶點158個,將二者合并、除去重復項后共得到158個靶點。

表1 白術-肉蓯蓉有效成分

2.1.2 便秘靶點篩選及藥物-成分-靶點相互作用網絡的構建與分析 以關鍵詞“constipation”在各數據庫檢索,共收集相關靶點基因1 156個,其中GeneCards數據庫1 133個(Relevance score>1篩選)、OMIM數據庫7個、PharmGKB數據庫5個、TTD數據庫11個,匯總并刪除重復項后共1 140個。疾病靶點分別與白術、肉蓯蓉及白術-肉蓯蓉藥物成分靶點取交集獲得共同靶點,韋恩圖見圖1。將白術-肉蓯蓉與疾病的交集靶點信息導入Cytoscape 3.7.2軟件構建藥物-有效成分-靶點網絡,含86個節點和112條邊。其中,紅色菱形節點代表藥物名稱,藍色橢圓形節點代表有效成分的Mol ID,綠色方形節點代表有效成分與疾病共有靶點,灰色直線表示節點間的相互關系,具體見圖2。其中,PTGS2與9種有效成分連接,為連接度最高的靶點基因,白術-肉蓯蓉治療便秘可能通過調節PTGS2起作用。有效成分中,槲皮素(quercetin)、β-谷甾醇 (beta-sitosterol)、3β-乙酰氧基蒼術酮(3β-acetoxyatractylone)、蘇齊內酯(suchilactone)和丁香樹脂二甲醚(Yangambin) degree較高,潛在靶點多。

圖1 “藥物成分-便秘”靶點韋恩圖Fig.1 Venn diagram of target of " Pharmaceutical Ingredients-Constipation "

圖2 “白術-肉蓯蓉有效成分-便秘”靶點網絡Fig.2 Target network of " Active Ingredient of Atractylodes Macrocephala and Cistanche Deserticola-Constipation"

2.1.3 蛋白質互作(PPI)網絡的構建 將白術-肉蓯蓉有效成分與疾病的71個共同靶點導入STRING數據庫得到PPI網絡,得到靶點核心網絡圖,節點代表靶蛋白,邊代表靶蛋白之間的相互作用。其中,邊數為993,平均節點度為28,平均局部聚類系數為0.724。節點分為相互作用較多的紅色、藍色、綠色三組,見圖3。繼而將TSV格式數據文件導入Cytoscape 3.7.2軟件,數據按Degree>28.371、Closeness>0.009、Betweenness>46.343(保留三位小數)篩選,Degree降序排列后得到19個核心靶點,包括Degree值較高的RAC-α絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(RAC-alpha serine/threonine-protein kinase,AKT1)、白細胞介素-6(Interleukin-6,IL6)、腫瘤壞死因子(Tumor necrosis factor,TNF)、細胞腫瘤抗原 p53(Cellular tumor antigen p53,TP53)等,可能是白術-肉蓯蓉治療便秘的關鍵靶點,具體結果見表2。構建19個核心靶點的PPI網絡,見圖4。

表2 白術-肉蓯蓉治療便秘的核心靶點

2.1.4 基因功能和通路富集分析 借助DAVID數據庫,將白術-肉蓯蓉作用于便秘的71個靶蛋白進行GO注釋分析和KEGG通路分析。結果表明,共涉及BP 26個、CC 50個、MF 72個、KEGG 24個。按P<0.05篩選,降序排序后將前10位的GO注釋結果以及前20位的KEGG通路相關數據導入微生信制圖。其中,BP主要調節對過氧化氫的反應、RNA聚合酶II啟動子轉錄的正調控及脂質儲存負調控等生物過程;CC主要對孔復合體、受體復合物及高爾基體等細胞組分有顯著作用;MF主要對氧化還原酶活性,結合分子氧作用于單個供體,結合兩個氧原子、蛋白酪氨酸激酶激活劑活性及ATP酶結合等分子功能方面作用顯著。KEGG富集潛在靶基因較多的通路有脂質和動脈粥樣硬化和乙型肝炎、癌癥中的蛋白聚糖和卡波西肉瘤相關皰疹病毒感染等,白術-肉蓯蓉可能通過這些信號通路治療便秘。具體結果見圖5。

MF中“oxidoreductase activity…”全稱為“oxidoreductase activity, acting on single donors with incorporation of molecular oxygen, incorporation of two atoms of oxygen”The full name for the “oxidoreductase activity…”in MF is “oxidoreductase activity, acting on single donors with incorporation of molecular oxygen, incorporation of two atoms of oxygen”

2.1.5 分子對接驗證 選擇AKT1、TNF、IL-6和PTGS2基因對應的靶點蛋白與槲皮素、β-谷甾醇和3β-乙酰氧基蒼術酮3個成分進行對接,結果見表3。結合能越低分子間結合越穩固,結合能<-5 kJ·mol-1時對接結果良好。用PyMOL對部分對接活性較好的結果可視化處理,見圖6。

a. AKT1-槲皮素;b. AKT1-β-谷甾醇;c. TNF-β-谷甾醇;d. IL6-β-谷甾醇;e. IL6-3β-乙酰氧基蒼術酮;f. PTGS2-β-谷甾醇a. AKT1-quercetin; b. AKT1-beta-sitosterol; c. TNF-beta-sitosterol; d. IL6-beta-sitosterol; e. IL6-3β-acetoxyatractylone; f. PTGS2-beta-sitosterol

表3 分子對接結合能

2.2 白術-肉蓯蓉對便秘小鼠的作用

2.2.1 白術-肉蓯蓉對便秘小鼠排便情況的影響 由表4可知,與空白組相比,模型組小鼠首粒黑便時間顯著延長(P<0.01),12 h排便量顯著減少(P<0.05),表明便秘小鼠造模成功。與模型組首粒黑便時間相比,高劑量藥物組和陽性對照組極顯著縮短(P<0.01),中劑量藥物組顯著縮短(P<0.05),低劑量藥物組差異不顯著(P>0.05)。與模型組相比,各劑量藥物組與陽性對照組12 h排便量差異均不顯著(P>0.05)。表明中、高劑量白術-肉蓯蓉混懸液對小鼠慢傳輸型便秘有改善作用。

表4 白術-肉蓯蓉對小鼠排便及小腸運動情況的影響

2.2.2 白術-肉蓯蓉對便秘小鼠小腸運動情況的影響 由表4可知,與空白組相比,模型組小腸推進率顯著降低(P<0.01),表明腸道蠕動減弱,鹽酸洛哌丁胺造模成功。與模型組相比,中、高劑量藥物組小腸推進率顯著增高(P<0.01),差異極顯著,低劑量藥物組與陽性對照組小腸推進率均無明顯變化,差異無統計學意義(P>0.05)。

3 討 論

便秘癥首見于《黃帝內經》,基本病機為大腸通降不利,傳導失司[11],是大家畜經常出現的一種病例,患病率較高[12]。有關中藥治療便秘的用藥規律分析表明,便秘的基本治則為潤腸通便,調暢氣機促進大腸傳導之力,白術、肉蓯蓉等是用于虛證的藥物組合[13]。由八珍散改制的顆粒劑治療產后便秘豬群有良好效果[14],由肉蓯蓉等10味中草藥配伍而成的復方制劑可以明顯減輕母豬便秘[15]。王文革等[16]對慢傳輸型便秘大鼠進行研究,結果表明大劑量生白術可能通過促進結腸組織c-kitmRNA表達,修復結腸ICC治療便秘。范亞楠等[17]研究發現,肉蓯蓉可以使便秘大鼠糞便粒數增加,小腸推進度提高,有效治療便秘。本研究對白術-肉蓯蓉治療慢傳輸型便秘的效果進行驗證,數據表明,中、高劑量白術-肉蓯蓉可使洛哌丁胺誘導的便秘小鼠首粒黑便時間顯著縮短,小腸推進率顯著增高,證明白術-肉蓯蓉可以促進腸道運動,對慢傳輸型便秘有明顯改善作用。中醫認為慢傳輸型便秘以本虛標實為主,多以氣虛型為主要證候,虛者補之是主要治則。本文試驗僅驗證了白術-肉蓯蓉對此種便秘證型有治療效果,對于諸如熱秘、冷秘、陽虛秘、陰虛秘等其他型便秘的治療效果,本文未作探究,后續可設計相關試驗進行驗證。為驗證白術-肉蓯蓉中有效成分治療便秘的準確性,也可設計單純化合物的治療組開展試驗。白術-肉蓯蓉藥作為治療便秘同現頻次較高的藥對,治療便秘的機制尚不明確。因此,本研究基于網絡藥理學和試驗進一步對白術-肉蓯蓉治療便秘的機制進行探討。

白術、肉蓯蓉治療便秘與其成分相關。白術含有內酯類、揮發油和多糖等成分,蒼術酮可以通過膽堿能受體促進胃腸運動,白術內酯I能增強唾液淀粉酶活性和調節腸道功能[18]。肉蓯蓉含有苯乙醇苷類和多糖等成分,總寡糖和半乳糖醇是通便的藥效物質[19]?！鞍仔g-肉蓯蓉有效成分-便秘”靶點網絡結果表明,槲皮素、β-谷甾醇、3β-乙酰氧基蒼術酮、蘇齊內酯和丁香樹脂二甲醚等成分潛在靶點較多,其中可能有白術-肉蓯蓉治療便秘的有效成分。有研究表明,槲皮素可以上調SIRT 1表達,使NLRP3促炎反應活化受到抑制,提高M2型巨噬細胞作用,改善結腸炎性損傷[20];還可以保護腸黏膜,恢復腸道功能,緩解便秘癥狀[21]。研究表明,β-谷甾醇有免疫調節、抗菌、抗炎和潤腸通便等作用[22-23],能降低結腸炎小鼠腸道TNF-α、IL-6和IL-1β的水平,增加腸上皮細胞抗菌肽表達,減輕炎癥對腸道環境干擾[24]。3β-乙酰氧基蒼術酮是白術揮發油中的一種成分。白術經炮制后蒼術酮含量減少,同時一部分轉化為白術內酯Ⅰ和白術內酯Ⅲ[25]。白術中的揮發油成分沒有產生“燥性”導致機體津液受損而加重便秘癥狀,可能因為白術治療便秘多為湯劑,其燥性部位揮發油有一定損失,因此在病理情況下白術仍以發揮通便作用為主[26]。

由本研究的靶點分析結果可知,多種有效成分均作用于PTGS2,而AKT1、IL-6和TNF等可能是核心靶點,在治療中發揮主要作用。AKT作為一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,能促進細胞增殖和抑制細胞凋亡[27],可通過PI3K/AKT信號通路調控eNOS和NO的合成與分泌,從而調控腸道功能,治療慢傳輸型便秘[28]。前列腺素內過氧化物合酶(PTGS)又稱正環氧化酶(COX),有PTGS1(cox-1)和PTGS2(cox-2)兩種異構酶。COX-2/PGE2是導致梗阻后腸運動障礙的重要機制[29]。TNF-α是主要促炎因子,可以引起腸道炎性損傷[30]。IL-6與腫瘤的發生發展關系密切,是導致便秘的相關炎癥因子[31]。TNF-α和IL-6能促進MMP-2和MMP-9的表達,從而降解細胞外基質,破壞基膜,加重炎性反應[32]。

4 結 論

白術-肉蓯蓉治療便秘的主要作用機制可能為多種活性成分通過PTGS2、AKT1、TNF和IL-6等靶點對脂質和動脈粥樣硬化、乙型肝炎等信號通路進行調控,從而影響對過氧化氫的反應、RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉錄的正調控、脂質儲存負調控等過程。