中藥渣發酵菌劑篩選及發酵工藝優化效果研究

■ 劉 倩 羅國良 郭 利 李曉成 宋 莊 郭肖蘭 鐘 偉*

（1.吉林農業科技學院，吉林吉林 132109；2.中國農業科學院特產研究所，吉林長春 130112；3.吉林大北農農牧科技有限公司，吉林長春 130102）

當前我國中藥企業發展迅速，中藥需求與日俱增，中藥渣等固體廢棄物如何安全合理且綠色處理已成為當前一大難題。研究表明，中藥渣若直接飼喂會影響動物適口性，消化利用率極低，其中所殘留的生物活性成分和豐富營養物質得不到有效利用，易造成浪費[1]。利用微生物發酵技術可明顯降低中藥渣中纖維素和木質素含量，提高蛋白質和氨基酸等營養成分含量，改善適口性，從而提高中藥渣飼料化利用的效率[2-4]。

乳酸菌、芽孢桿菌、酵母菌是常用發酵中藥渣的益生菌菌種[5]，可達到減毒增效、節約藥源、產生活性物質等作用[6]。戴燊等[7]用黑曲霉及植物乳桿菌混菌發酵中草藥后，粗蛋白、粗脂肪等明顯提高，中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維、木質素等明顯降解，其營養價值明顯提高。聶芙蓉等[8]用酵母菌、枯草芽孢桿菌混合發酵女貞子后使其粗蛋白和生物活性成分含量均有所提高，纖維含量降低。李秋月等[9]證實微生物發酵中草藥后其活性成分會被酶解為小分子物質，增強其原有藥效。但目前大部分研究注重于中藥發酵后營養價值、活性成分的改變及發酵代謝產物的藥理功能，對于菌制劑發酵中藥渣后效果及優化發酵工藝參數缺少相關研究。因此，本研究對中藥渣進行菌制劑發酵，篩選出最優發酵菌制劑組合和添加比例，并從初始水分含量、發酵溫度、發酵時間三方面進行菌制劑發酵工藝參數優化分析，以期為中藥渣的二次利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

本研究樣品為中成藥經有效成分提取后剩余的殘渣，由吉林通化修正藥業有限公司提供，主要成分為玄參、板藍根、麥冬、天冬等。

1.2 復合發酵菌制劑

發酵菌劑由植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum,Lp)、酵母菌(Bacillus subtilis, Bs)、枯草芽孢桿菌(Saccharomyces cerevisiae, Sc)作為發酵菌種，均為實驗室保藏菌種，活菌總量≥5×108CFU/mL。

1.3 試驗設計

1.3.1 試驗一：不同種類菌制劑對中藥渣發酵后營養價值的影響

試驗以中藥渣為發酵底料，噴漿玉米皮、豆粕、麥麩為發酵輔料，設定初始含水量為50%，采用單因素完全隨機化設計，以單一菌、等比例兩兩復合及三者復合共設置8 個處理組（CON、Lp、Sc、Bs、Lp+Sc、Lp+Bs、Sc+Bs、Lp+Sc+Bs）。待樣品攪拌均勻后裝入帶有單向呼吸閥的密封發酵袋中，置于30 ℃培養箱中連續發酵3 d，每個樣品3 個重復。發酵達到72 h，取出發酵藥渣混勻后采取四分法取樣進行測定pH 及各營養物質含量。

1.3.2 試驗二：不同添加比例的植物乳桿菌和枯草芽孢桿菌對中藥渣發酵后營養價值的影響

以試驗一得到的最佳處理組為基礎，進行4×4 雙因素試驗，其中A 因素為植物乳桿菌，設4 個添加水平（1、2、3、5），分別為3、6、9 mL 和15 mL；B 因素為枯草芽孢桿菌，設4 個添加水平（1、2、3、5），分別為3、6、9 mL 和15 mL。共16 個處理組。待樣品攪拌均勻后裝入帶有單向呼吸閥的密封發酵袋中，置于30 ℃培養箱中連續發酵72 h，每個樣品3 個重復。發酵達到72 h，取出發酵藥渣混勻后采取四分法取樣進行測定pH及各營養物質含量。

1.3.3 試驗三：不同發酵條件對中藥渣營養價值和生物活性成分含量的影響

以試驗一和試驗二得到的最優結果為正交試驗處理組，以發酵物料的初始水分含量（A）、發酵溫度（B）、發酵時間（C）作為試驗因素，設計三因素三水平的正交試驗，各因素具體水平參數如表1。發酵步驟同上，混合均勻后在不同條件下進行發酵培養，發酵結束后取出，四分法取樣，測定pH、各營養物質含量、生物活性成分及毒素含量。

表1 發酵條件優化組合因素水平

1.4 指標檢測

1.4.1 pH測定

稱取發酵后的中藥渣10 g，置于錐形瓶中（容量為250 mL），加入90 mL純化水于錐形瓶中混勻，然后用紗布過濾后取濾液于燒杯內，用酸度計（雷磁，型號PHS-3C，02220128號）進行pH測定。

1.4.2 常規營養成分含量的測定

飼料中干物質（DM）含量參照GB/T 6435—2006，采用恒溫烘干法測定；粗蛋白（CP）含量參照GB/T 6432—1994 的方法，采用凱氏定氮法測定；粗脂肪(EE)含量參照GB/T 6433—2006 的方法，采用索氏抽提法測定；粗纖維（CF）含量參照GB/T 6434—2006 的方法，采用濾袋法測定；中性洗滌纖維（NDF）含量參照GB/T 20806—2006的方法，酸性洗滌纖維（ADF）含量參照NY/T 1459—2007 的方法，均采用濾袋法測定；粗灰分（Ash）含量參照GB/T 6438—1992 的方法，采用灼燒法測定。

1.4.3 生物活性成分及安全性指標的測定

還原糖含量和類黃酮含量測定分別采用微量法和可見分光光度法，嚴格按照試劑盒說明書測定，試劑盒均購自北京索萊寶科技有限公司。

生物堿含量和乳酸含量測定采用分光光度法和微量法，嚴格按照試劑盒說明書測定，試劑盒均購自江蘇科銘生物技術有限公司。

嘔吐毒素含量和黃曲霉毒素B1 含量測定均采用雙抗體一步夾心酶聯免疫吸附試驗（ELISA），嚴格按照試劑盒說明書測定，試劑盒均購自上海優選生物科技有限公司。

1.5 數據處理

數據使用 Excel 2010進行初步處理，之后再采用SAS 9.4 進行統計分析。單因素試驗采用one-way ANOVA 方差分析，雙因素試驗采用GLM 程序進行統計分析，用Duncan’s 法進行多重比較。正交試驗結果采用極差分析和一般線性模型進行方差分析。數據以“平均值±標準差”表示，P＜0.05時表示差異顯著，P＞0.05時表示差異不顯著。

2 結果與分析

2.1 不同種類菌制劑對中藥渣發酵后營養價值的影響

如表2 所示，各試驗組pH 顯著低于CON 組（P＜0.05）；各試驗組DM 含量顯著低于CON 組（P＜0.05）；Bs、Sc+Bs、Lp+Sc+Bs 組CP 含量顯著高于CON 組和其他試驗組（P＜0.05）；Lp、Sc、Lp+Bs、Sc+Bs、Lp+Sc+Bs組EE 含量顯著低于CON 組（P＜0.05）；Lp+Sc、Lp+Bs、Lp+Sc+Bs組NDF含量顯著低于CON 組和其他試驗組（P＜0.05）；除Lp 組和Bs 組Ash 含量顯著高于CON 組（P＜0.05），其他組間Ash含量均無顯著差異（P＞0.05）；各組間CF含量、ADF含量無顯著差異（P＞0.05）。

表2 不同菌制劑處理后中藥渣內營養成分含量變化

2.2 不同添加比例的植物乳桿菌和枯草芽孢桿菌對中藥渣發酵后營養價值的影響

如表3 所示，不同添加比例菌種處理后組間pH和DM、CP、CF、NDF、ADF、Ash 含量存在顯著差異（P＜0.05）。植物乳桿菌不同添加比例組間pH 和DM、CP 含量存在顯著差異（P＜0.05），隨菌種添加比例增加，pH 升高，DM 含量降低；植物乳桿菌不同添加比例組間EE、CF、NDF、ADF、Ash 含量無顯著差異（P＞0.05）?？莶菅挎邨U菌不同添加比例組間pH 和DM、NDF 含量存在顯著差異（P＜0.05）；枯草芽孢桿菌不同添加比例組間EE、CP、CF、ADF、Ash 含量無顯著差異（P＞0.05）。兩種菌株的不同添加比例對pH和DM、CP、CF、NDF、ADF、Ash 含量變化具有顯著交互作用（P＜0.05）。

表3 菌制劑不同添加比例對中藥渣內營養物質含量的影響

2.3 不同發酵條件對中藥渣營養價值和生物活性成分含量的影響

2.3.1 不同發酵條件下中藥渣中pH 和DM、EE、CP、Ash含量的變化

由表4 正交試驗結果極差分析表明，發酵條件對pH 影 響 因 素 的 主 次 順 序 為A＞C＞B，最 佳 組 合 為A3B1C3，即初始水分含量55%、發酵溫度35 ℃、發酵時間72 h。對各處理組pH 進行方差分析結果如表5 所示，初始水分含量、發酵溫度、發酵時間對該指標影響均為差異顯著（P＜0.05）。

表5 中藥渣發酵后營養物質方差分析

由表4 正交試驗結果極差分析表明，發酵條件對DM 含量影響因素的主次順序為A＞B＞C，最佳組合為A1B3C1，即初始水分含量45%、發酵溫度40 ℃、發酵時間24 h。對各處理組DM含量進行方差分析結果如表5所示，初始水分含量、發酵溫度對該指標影響為差異顯著（P＜0.05），發酵時間對該指標無顯著影響（P＞0.05）。

由表4 正交試驗結果極差分析表明，發酵條件對EE 含量影響因素的主次順序為B＞C＞A，最佳組合為A2B2C2，即初始水分含量50%、發酵溫度37 ℃、發酵時間48 h。對各處理組EE 含量進行方差分析結果如表5所示，發酵溫度對該指標影響為差異顯著（P＜0.05），初始水分含量、發酵時間對該指標無顯著影響（P＞0.05）。

由表4 正交試驗結果極差分析表明，發酵條件對CP 含量影響因素的主次順序為B＞C＞A，最佳組合為A3B2C2，即初始水分含量55%、發酵溫度37 ℃、發酵時間48 h。對各處理組CP 含量進行方差分析結果如表5所示，發酵溫度對該指標影響為差異顯著（P＜0.05），初始水分含量、發酵時間對該指標無顯著影響（P＞0.05）。

由表4 正交試驗結果極差分析表明，發酵條件對Ash 含量影響因素的主次順序為B＞C＞A，最佳組合為A1B3C3，即初始水分含量45%、發酵溫度40 ℃、發酵時間72 h。對各處理組Ash 含量進行方差分析結果如表5 所示，初始水分含量、發酵溫度、發酵時間對該指標影響均為差異顯著（P＜0.05）。

2.3.2 不同發酵條件下藥渣內纖維含量的變化

由表6 正交試驗結果極差分析表明，發酵條件對CF 含量影響因素的主次順序為B＞A＞C，最佳組合為A1B3C3，即初始水分含量45%、發酵溫度40 ℃、發酵時間72 h。對各處理組CF 含量進行方差分析結果如表7 所示，發酵溫度對該指標影響為差異顯著（P＜0.05），初始水分含量、發酵時間對該指標無顯著影響（P＞0.05）。

表6 中藥渣發酵后纖維含量極差分析

表7 中藥渣發酵后纖維含量方差分析

由表6 正交試驗結果極差分析表明，發酵條件對NDF 含量影響因素的主次順序為A＞C＞B，最佳組合為A3B1C3，即初始水分含量55%、發酵溫度35 ℃、發酵時間72 h。對各處理組NDF 含量進行方差分析結果如表7 所示，初始水分含量對該指標影響為差異顯著（P＜0.05）,發酵溫度、發酵時間對該指標無顯著影響（P＞0.05）。

由表6 正交試驗結果極差分析表明，發酵條件對ADF 含量影響因素的主次順序為B＞A＞C，最佳組合為A1B3C3，即初始水分含量45%、發酵溫度40 ℃、發酵時間72 h。對各處理組ADF含量進行方差分析，結果如表7 所示，發酵溫度對該指標影響為差異顯著（P＜0.05），初始水分含量、發酵時間對該指標無顯著影響（P＞0.05）。

2.3.3 不同發酵條件下藥渣內生物活性成分含量的變化

由表8 正交試驗結果極差分析表明，發酵條件對類黃酮含量影響因素的主次順序為A＞C＞B，最佳組合為A3B2C2，即初始水分含量55%、發酵溫度37 ℃、發酵時間48 h。對各處理組類黃酮含量進行方差分析結果如表9 所示，初始水分含量、發酵溫度、發酵時間對該指標均無顯著影響（P＞0.05）。

表8 中藥渣發酵后生物活性成分極差分析

由表8 正交試驗結果極差分析表明，發酵條件對還原糖含量影響因素的主次順序為C＞B＞A，最佳組合為A2B2C1，即初始水分含量50%、發酵溫度37 ℃、發酵時間24 h。對各處理組還原糖含量進行方差分析結果如表9 所示，發酵溫度、發酵時間對該指標影響為差異顯著（P＜0.05），初始水分含量對該指標均無顯著影響（P＞0.05）。

由表8 正交試驗結果極差分析表明，發酵條件對生物堿含量影響因素的主次順序為C＞A＞B，最佳組合為A2B1C2，即初始水分含量50%、發酵溫度35 ℃、發酵時間48 h。對各處理組生物堿含量進行方差分析結果如表9 所示，初始水分含量、發酵溫度、發酵時間對該指標均無顯著影響（P＞0.05）。

由表9 正交試驗結果極差分析表明，發酵條件對乳酸含量影響因素的主次順序為C＞A＞B，最佳組合為A3B2C3，即初始水分含量55%、發酵溫度37 ℃、發酵時間72 h。對各處理組乳酸含量進行方差分析結果如表9 所示，初始水分含量、發酵時間對該指標影響為差異顯著（P＜0.05），發酵溫度對該指標均無顯著影響（P＞0.05）。

2.3.4 不同發酵條件下藥渣內毒素含量的測定

發酵后藥渣中存在對應毒素的測定結果如表10所示，結果表明黃曲霉毒素B1 和嘔吐毒素的含量均符合我國飼料衛生標準。

表10 中藥渣發酵后毒素含量

3 討論

3.1 不同種類的植物乳桿菌和枯草芽孢桿菌處理對中藥渣發酵效果的影響

藥渣中由于自身抗營養因子存在，直接利用效果不佳。相關研究表明，經微生物菌種發酵處理后，可以提升營養價值、改善適口性等[10]。藥渣在發酵過程中產生酒香味，改善藥渣氣味，利于提高適口性，可以提高發酵效率和發酵質量。試驗中不論是單一菌還是復合菌發酵，藥渣的營養成分均發生了變化，在發酵過程中，菌株自身生長繁殖需要消耗一定的營養物質，同時與發酵底物及輔料間相互作用產生了部分易降解的代謝產物，造成DM 含量降低。一般物料發酵后的pH 范圍為3.8～4.5，pH 越低，越利于發酵保存[11]。本試驗所測定pH 范圍符合文獻報道，并與李亞新等[12]和韋票等[13]研究結果相一致，添加菌劑組pH 顯著低于對照組，且添加Lp 菌劑的各組pH 顯著低于其他未添加組，說明植物乳酸桿菌具有促進發酵產生乳酸、降低pH 的作用。與對照組相比，經Bs、Sc+Bs、Lp+Sc+Bs 處理后CP 含量顯著提升了9.95%、8.56%、10.44%，Lp+Bs 組NDF 含量顯著降低6.53%，Ash 含量顯著降低6.54%，與楊旭等[14]、王馨影[15]等、葉丙奎[16]研究結果相一致。而與空白對照組相比，Lp+Bs 組pH、CF、NDF、ADF、Ash含量分別降低15.70%、1.15%、6.53%、4.94%、6.49%，CP 含量提高3.34%；與Lp+Sc+Bs 組相比，Lp+Bs 組pH、NDF、ADF 含量分別降低1.26%、2.14%、0.48%，符合Ahmed 等[17]和白冰等[18]文獻報道。單一菌種添加模式無法同時兼顧發酵品質與有氧暴露后腐敗抑制的要求[19-20]，混菌發酵已為研究熱點。孫宜新等[21]研究發現復合菌種發酵組比單一菌種發酵組的大葉枸中有益菌含量分別提高11.59%和7.89%。綜上所述，最佳菌制劑組合為Lp+Bs組。

3.2 不同添加比例的植物乳桿菌和枯草芽孢桿菌處理對中藥渣發酵效果的影響

在發酵過程中復合菌種混合后進行厭氧發酵，其中枯草芽孢桿菌等好氧菌的存在為植物乳桿菌的生長繁殖創造了厭氧環境,而枯草芽孢桿菌降解纖維的能力有限[22]，與植物乳桿菌混合后發酵起到微生物間的協同作用，達到優勢互補，相輔相成，發揮單一菌株起不到的作用[23]。研究表明，發酵菌劑的接種量越高，藥渣的發酵效果越好。隨著微生物增殖量增加，其所消耗底物中所需要的營養就越多[24]。周勇等[25]研究試驗發現，當嗜酸乳桿菌、產朊假絲酵母菌、枯草芽孢桿菌、乳酸芽孢桿菌以2∶1∶2∶1 的比例混合發酵復合中藥渣后，發酵效果較優。李若熙等[26]研究發現，嗜酸乳桿菌與植物乳桿菌（1∶1）混菌發酵時，綜合發酵能力最強。秦夢等[27]發現中藥渣堆肥發酵效果隨菌劑接種量的增加而增強，但當菌種接種量超過0.5%時，發酵效果顯著降低。本試驗結果與上述文獻研究所得結論相似，在指定發酵溫度和發酵時間下，其DM、CP、EE等營養物質含量隨菌制劑添加比例的增加呈現先降低再增加的趨勢；CF、NDF、ADF等纖維類營養物質含量呈先增加后降低或先增加后降低再增加的變化趨勢，但均在植物乳桿菌與枯草芽孢桿菌1：1 等比例混合時，DM、CP、EE 等營養物質含量較高，CF、NDF、ADF等纖維類營養物質含量較低。所以綜合各項指標變化，認為菌制劑的最佳添加比例為兩者等比例混合，且添加比例為1∶1。

3.3 不同發酵條件對中藥渣發酵效果的影響

3.3.1 初始水分含量

初始水分含量是影響發酵的重要因素，過高或過低均會影響菌種生長繁殖進而影響發酵品質[28]。含水量過低時，菌種不能充分獲取營養物質，生長發育緩慢；含水量過高時，藥渣易黏連結塊、腐敗變質，影響發酵效果[29]。有研究表明，當發酵飼料水分含量在40%～60%時可使發酵飼料品質維持穩定[30]。安琦等[31]發現當黃芪藥渣內含水量為50%～70%時，乳酸菌數量較高，發酵較為適宜。孫合美等[32]研究發現，發酵飼料中水分含量為30%～40%可以使發酵菌種活菌數增多，飼料pH 較為穩定。陳鑫等[33]研究也證實以50%的初始含水量發酵紅芪藥渣效果良好。但不同藥渣藥材組成不同，其發酵適宜的含水量也可能不同，因此本試驗設定45%、50%、55%三個水平的初始含水量進行發酵中藥渣，以發酵后中藥渣的營養成分含量變化及生物活性成分含量評定中藥渣適宜發酵的初始水分含量，結果表明當含水量為55%時發酵效果最好。

3.3.2 發酵溫度

溫度是影響菌種生長和代謝的關鍵因素。研究表明，大多數益生菌生長適宜溫度為20～33 ℃，最高不應超37 ℃[34]。向宇[35]證實經曲霉和芽孢桿菌固體發酵甘草藥渣的最適宜發酵溫度為30 ℃。孫曉燕等[36]利用混合菌種發酵中藥渣認為，25～37 ℃為發酵最佳溫度區間。賀曉玉[37]用蛹蟲草菌發酵五味子藥渣，發現當發酵溫度為26 ℃時可以提高五味子藥渣的利用價值，并能降低試驗成本。而本試驗所用菌種生長適宜的溫度為37 ℃，此時發酵效果最好。該結論與以上研究結果不一致，可能是由于最佳發酵溫度易受發酵底物和發酵菌種的影響，且同菌種不同發酵條件下所需發酵溫度也不同[38]。

3.3.3 發酵時間

發酵時間也是發酵成功與否的重要影響因素之一[39]，發酵時間過長，發酵環境不利于菌體生長，提高發酵生產成本；發酵時間過短，導致抗營養因子脫除量降低[40]，易降低發酵產量，影響發酵效果。武洪志等[41]研究發現，枯草芽孢桿菌發酵復方中草藥的最佳發酵時間為 2.7 d；岳鹍等[42]通過中心組合設計響應面試驗建立二次回歸模型對大黃藥渣固態發酵條件進行優化，確定最優發酵時間為7.5 d。本試驗與上述研究的最佳發酵時間有所不同，可能是由于與本研究選定相關發酵質量的評價指標不同，也有可能是因為所選用藥渣不同，藥材組成也不同。孟文文等[43]確定黑曲霉發酵玉屏風口服液藥渣的最佳發酵時間72 h；劉鋒[44]利用黑曲霉H-2 發酵黃芪藥渣產纖維素酶的最佳發酵時間是72 h。本試驗設定發酵時間的三個水平中通過結果證實最佳發酵時間為72 h，與以上研究結果相一致，藥渣的發酵處理效果較好。

3.4 不同發酵條件對藥渣安全性的影響

黃曲霉毒素B1 和嘔吐素通常用于評價飼料的安全性。飼料生產安全標準要求AFB1≤20 μg/kg，DON≤1 000 μg/kg。在試驗條件下，發酵后藥渣中AFB1 和DON 的含量遠低于國家對飼料中毒素含量的檢測標準，符合國家對飼料衛生安全要求，說明經本試驗發酵條件處理后的藥渣無安全風險。

4 結論

綜上所述，當菌制劑處理組合為植物乳桿菌與枯草芽孢桿菌混合且添加比例為1∶1 時，中藥渣具有較好發酵效果。在此條件下中藥渣的最佳發酵工藝條件為：初始水分含量為55%，發酵溫度為37 ℃，發酵時間為72 h。