研究型儀器分析實驗：紅酒樣品中多氯聯苯含量的測定

鄭海嬌，許海，賈瓊

吉林大學化學學院，長春 130012

儀器分析是指采用比較復雜或特殊的儀器設備，通過測量物質的某些物理或物理化學性質的參數及其變化來獲取物質的化學組成、成分含量及化學結構等信息的一類方法。儀器分析實驗為本科化學專業及近化學專業學生必修的一門實驗課程[1–3]，它具有靈敏度高、專一性強、取樣量少、耗時短等優點。在現有的儀器分析實驗中，通常注重儀器操作與樣品分析的流程，或針對單一種類的儀器安排實驗內容，缺少對樣品前處理流程的關注和不同種類儀器在同一個實驗內容中的配合使用，這些缺陷使得儀器分析實驗缺少整體性和綜合性。評價高等院校人才培養質量的重要指標是大學生的實踐動手能力。因此，開展完整性和綜合性較強的儀器分析實驗，培養學生動手實踐與思維創新的能力，讓學生在認識儀器組成的同時熟悉儀器原理與操作，此教學內容的開展十分重要。筆者所在教學團隊承擔儀器分析理論課與實驗課教學的工作，且多年從事樣品前處理領域的科研工作，尤其在固相微萃取技術方面取得一系列科研與教學成果[4–8]。希望通過總結多年實踐經驗，采用參考文獻與實際研究相結合的方式，將前沿的科研成果轉化成與基礎教學相匹配的教學資源，設計出具有合理性的同時適用于本科教學和實際應用的儀器分析實驗。

作為一類重要的持久性有機污染物，有機氯污染物所造成的污染和危害已引起人們的重視。首批列入《關于持久性有機污染物的斯德哥摩公約》受控名單的12種持久性有機污染物中，有9種是有機氯農藥。參考世界衛生組織國際癌癥研究機構2017年公布的致癌物清單，多氯聯苯作為有機氯污染物中的一類，屬于I類致癌物。在我們的生產生活中，如絕緣油、熱載體等多種產品的工業添加劑的成分中均存在多氯聯苯。由于多氯聯苯的性質穩定，在自然界中很難被分解，導致其在環境中能長時間存在，并且會隨食物鏈進入到人體，引發疾病發生[9,10]。因此，選用多氯聯苯作為待測物，在教學上是有實際意義的。目前，多氯聯苯已發展出多種檢測手段，包括拉曼光譜技術[11]、光電化學檢測法[12]、氣相色譜-串聯質譜技術[13,14]、氣相色譜法[15,16]等。其中，氣相色譜法具有靈敏度高、進樣量小、準確度好、耗時短、適用范圍廣的特點，被廣泛地應用于多氯聯苯的檢測。作為儀器分析實驗中不可或缺的環節，樣品前處理可有效減少環境樣品中存在的大量干擾性雜質對分析結果造成的影響。固相微萃取技術于20世紀末由加拿大科學家Pawliszyn提出，這項技術通過集成化的萃取流程大大縮短了檢測時間，其優勢有目共睹，在化學、環境、醫學、食品等學科中深受重視并推廣應用[17]。

1 實驗目的

本實驗的主要教學對象是在學習并掌握無機化學、有機化學和儀器分析理論課及相關實驗技術的基礎上的高等學?；瘜W專業高年級的本科生，通過儀器分析綜合實驗進一步提高學生綜合運用儀器解決實際問題的動手能力和創新能力。實驗安排8學時，分為三個部分，固相微萃取技術的理論學習、儀器分析實驗的理論知識學習、實驗操作及數據處理。主要教學目的為：

(1) 通過實際樣品萃取實驗操作學習并鞏固樣品前處理知識，讓學生充分了解儀器分析實驗的全流程；

(2) 通過儀器分析實驗操作學習并鞏固色譜理論及光譜理論，使學生掌握通過不同的儀器處理實際問題的方法，培養學生的動手能力；

(3) 通過儀器分析全流程的實驗演示及操作，具體問題具體處理，培養學生綜合思考的能力。

2 實驗部分

2.1 主要試劑

甲基丙烯丁酸酯(≥ 99.7%)、偶氮二異丁腈(≥ 99.7%)、甲基丙烯酸氧丙基三甲氧基硅烷(≥ 99.7%)、乙二醇二甲基丙烯酸酯(≥ 99.7%)、氧化亞銅(≥ 99.5%)、正丙醇(≥ 99.5%)、1,4-丁二醇(≥ 99.5%)、正己烷(≥ 99.5%)、烯丙胺(≥ 99.5%)、β-環糊精(≥ 99.7%)、對甲苯磺酰氯(≥ 99.5%)及甲醇(≥ 99.5%)、丙酮(≥ 99.5%)等常用試劑采購于天津光復化學試劑廠。多氯聯苯標準品(PCB28、PCB52、PCB101、PCB118、PCB138、PCB153、PCB180，≥ 99.8%)來自于德國Dr. E公司。實驗用超純水經過Milli-Q (密理博公司，美國)系統凈化而成。

2.2 主要儀器

Thermo Nicolet 670型紅外光譜儀(賽默飛世爾公司，美國)，Q500型同步熱分析儀(梅特勒托利多公司，美國)，島津2014型氣相色譜儀(島津公司，日本)，氣相色譜柱為HP-1MS型號毛細管柱，檢測器為電子捕獲檢測器(ECD)，配備量程為10 μL的微量進樣器。

2.3 儀器分析條件

氣相色譜實驗條件：進樣體積：1 μL；進樣口溫度：250 °C；氣化室溫度：320 °C；毛細管色譜柱柱溫：270 °C；程序升溫：初始溫度設置50 °C，以10 °C·min?1的速率升溫到250 °C，保持1 min，隨后，以10 °C·min?1的速率升溫到250 °C，保持10 min；進樣時間：0.75 min；壓力：0.17 Mpa，載氣和尾氣：高純氮氣，1.3 mL·min?1和37 mL·min?1。

紅外光譜儀實驗條件：采用KBr壓片法；干燥的試樣量：0.5–2.0 mg；干燥的KBr量：100–200 mg；對照試樣結構對4000–400 cm?1區域的每一個峰進行歸屬討論。

同步熱分析儀實驗條件：干燥的試樣量：10 mg；溫度設置：25–800 °C；升溫速率：10 °C·min?1。

3 實驗步驟

3.1 標準樣品及紅酒樣品處理

標準樣品的配制：分別稱取7種多氯聯苯標準品，用正己烷稀釋至10 mg·L?1并定容于10 mL的棕色容量瓶中，標準品儲備液放置于4 °C冰箱中儲存備用。

選用本地超市的紅酒為樣品，取50 mL樣品紅酒加入氯化鈉(2.0 g)、硫酸鈉(2.0 g)和正己烷溶劑(5.0 mL)，以4500 r·min?1的轉速離心20 min后取上清液，經濾膜過濾后上清液保存至4 °C儲存備用?？瞻讟悠芳凹訕嘶旌弦簶悠返呐渲品椒ㄈ缟?。

3.2 固相微萃取柱裝置的制備(教師制備，視頻演示)

毛細管內壁的處理：取長度為40 cm的石英毛細管柱用丙酮、氫氧化鈉(1.0 mol·L?1)、鹽酸(1.0 mol·L?1)、高純水和丙酮依次沖洗30 min后用氮氣吹干毛細管管壁。丙酮與甲基丙烯酸氧丙基三甲氧基硅烷的混合液通入干燥的毛細管內，將毛細管兩端的開口用硅膠塞封閉，在恒溫的50 °C水浴中反應14 h。用丙酮沖洗冷卻至室溫后的毛細管柱，用氮吹法去除未反應的試劑。

改性劑的制備：制備過程見圖1a。首先，以堿法反應通過β-環糊精與對甲苯磺酰氯(p-TsCl)和烯丙胺溶劑合成6位取代的烯丙基β-環糊精。隨后，將烯丙基β-環糊精和氧化亞銅堿性溶液在室溫下混合后置于在水浴反應器中連續反應2 h，過濾清洗后的物質經60 °C真空烘箱中干燥24 h，得到烯丙基β-環糊精氧化亞銅改性劑。

圖1 (a) 固相微萃取柱的制備；(b) 萃取過程圖

稱取甲基丙烯丁酸酯(BMA，360 mg)、偶氮二異丁腈(AIBN，4.0 mg)、乙二醇二甲基丙烯酸酯(EDMA，240 mg)、正丙醇(610 mg)、1,4-丁二醇(790 mg)及烯丙基β-環糊精氧化亞銅改性劑(110 mg)作為聚合反應液。將聚合反應液振蕩20 min混勻，通入氮氣，再將反應液通入處理后的毛細管中，在60 °C恒溫水浴中進行16 h的反應，反應結束后將未參與反應的物質用甲醇沖洗除去。將所制備的微萃取柱用兩液混合硬化膠(AB膠)固定在5 mL注射器針栓位置，取代金屬針頭，得到固相微萃取柱裝置。圖2為固相微萃取柱裝置結構。

圖2 固相微萃取柱裝置結構示意圖

在實際本科生儀器分析實驗中，重點在于讓學生熟悉儀器表征方法以及采用標準曲線法對多氯聯苯含量的檢測。實驗所用固相微萃取柱裝置的制備過程由實驗教師先行完成，將錄制完整的合成過程教學演示視頻作為先導課程，輔助學生學習和鞏固有機合成方面的知識。

3.3 萃取過程及實驗條件優化

固相微萃取柱對有機氯污染物的萃取過程主要包括預處理、上樣、清洗、洗脫四個步驟，具體步驟見圖1b。預處理步驟：吸取0.2 mL甲醇和0.5 mL磷酸緩沖溶液，依次以0.05 mL·min?1的流速沖洗并活化萃取柱；上樣：吸取1.0 mL的待測樣品溶液以0.1 mL·min?1的流速流過萃取柱；清洗：以與樣品溶液同樣的流速推入0.2 mL的磷酸緩沖溶液；洗脫：以0.05 mL·min?1的流速推入0.1 mL的洗脫液，并在萃取柱的出口處收集洗脫液，以備后續分析使用。

為了達到更好的萃取性能，我們優化了影響萃取實驗的樣品流速及解吸液流速，樣品及解吸液的流速決定了萃取時間的長短，決定了固相微萃取柱的柱背壓高低，決定了萃取效率的優劣。本實驗選用濃度為10 ng·mL?1的多氯聯苯標準品，采用單因素控制變量法，對其進行優化以達最優的萃取效果。

4 結果與討論

4.1 固相微萃取柱的表征

為成功合成確定固相微萃取柱，對所合成的改性劑進行紅外光譜的表征，采用KBr紅外壓片法，如圖3所示，圖3a中1365和845 cm?1處出現的峰分別對應甲苯磺?；?環糊精的S＝O和C―H伸縮振動峰。在圖3b中，1640、1571和1080 cm?1處出現的紅外峰分別為中間體烯丙基β-環糊精的C＝C、N―H和C―N的振動峰。圖3c中，除了圖3b中的紅外峰，在630 cm?1處新增了一個屬于O―Cu(I)的紅外吸收峰，以上結果可以表明烯丙基β-環糊精-氧化亞銅的成功合成。

圖3 對甲苯磺?；?環糊精(a)、烯丙基β-環糊精(b)、烯丙基β-環糊精-氧化亞銅(c)的紅外譜圖

為了評價萃取柱的熱穩定性能，用細針將毛細管萃取柱內的材料推出并收集以備熱重分析實驗使用，將收集的萃取柱內材料置于樣品室，在室溫下以10 °C·min?1的速率升溫到850 °C，結果如圖4所示。在250 °C之前材料熱穩定性較好，當溫度在400–450 °C之間，材料產生明顯的熱失重至質量不再損失，表明所制備的萃取柱裝置熱穩定性良好，符合萃取實驗所需。

圖4 (甲基丙烯丁酸酯-乙二醇二甲基丙烯酸酯-烯丙基β-環糊精-氧化亞銅)萃取柱的熱失重分析圖

4.2 樣品流速和解吸液流速對萃取效率的影響

本實驗選取1.0 mL樣品量，在樣品流速為0.05–0.2 mL·min?1的范圍內，考察不同樣品流速對萃取柱富集多氯聯苯的富集能力的影響，結果如圖5a所示，當樣品流速從0.05 mL·min?1開始增大時，氣相色譜圖中目標分析物的峰面積隨流速的增大而增大，峰面積在樣品流速為0.1 mL·min?1時達到最大，其后峰面積隨流速的增大而減小。之后，采用同樣的控制變量法對解吸液流速進行優化(圖5b)，選取0.1 mL為解吸液體積，在0.02–0.1 mL·min?1流速的范圍內考察解吸效率的變化趨勢。綜合考慮萃取時間及柱背壓的影響，最終實驗選取0.1和0.05 mL·min?1作為樣品與解吸液流速。

圖5 樣品流(a)速和解吸液流速(b)對萃取效率的影響

4.3 多氯聯苯的標準曲線繪制

在最佳的萃取條件下，用固相微萃取柱結合氣相色譜法對多氯聯苯標準品進行了分離檢測。在7支10 mL的容量瓶中分別加入10 mg·L?1的標準儲備液0.000、0.001、0.010、0.050、0.100、0.250、0.500 mL，加入正己烷溶液定容至10 mL，搖勻。將所配制溶液依次經過萃取柱萃取，收集萃取液，用微量進樣器吸取1 μL的樣品送入氣相色譜進樣口。經檢測，本方法檢出的7種多氯聯苯均線性關系良好，相關性系數(R)達0.9980以上。圖6為典型的氣相色譜圖。

圖6 七種多氯聯苯的典型色譜圖

4.4 紅酒樣品中多氯聯苯含量的測定

紅酒樣品均購于本地超市，讓學生通過加標回收的實驗測定實際樣品中多氯聯苯的回收率，加標回收實驗為向樣品中加入低、高兩種濃度(1.0和10 ng·mL?1)標準的多氯聯苯標準品?；厥章蕦嶒灲Y果見表1所示。

表1 回收率實驗

5 教學實踐與結論

本實驗共需用時5–6 h，采取團隊分工配合的方式完成實驗內容。實驗開始后，每2人為一組，分為以下五個步驟展開：(1) 課前預先觀看教師演示視頻，掌握固相微萃取柱的制備流程，此步驟全部同學參加；(2) 查閱相關文獻，了解固相微萃取柱的紅外及熱重分析表征流程，了解待測物性質，此步驟全部同學參加；(3) 制定實驗方案并與教師討論，設計對照實驗，調整并優化最終實驗方案，此步驟全部同學參加；(4) 開展實驗：① 第一組同學配制不同加標濃度的樣品，使用氣相色譜儀對影響萃取效率的不同的因素進行優化并繪制標準曲線，② 第二組同學使用紅外光譜儀對固相微萃取柱內固體樣品進行表征分析，③ 第三組同學使用同步熱分析儀對固相微萃取柱內固體樣品進行表征分析，④ 第四組同學使用氣相色譜儀對實際樣品進行定量分析；(5) 數據分析，并對所得到的實驗結果進行小組內探討，此步驟全部同學參加。

我們的教學團隊多年從事儀器分析課程的理論課與實驗課教學，與學生共同探討實驗改進方案，結合相關文獻成果對實驗課程的安排與實驗步驟進行優化，使用了紅外光譜法和同步熱分析法作為表征手段，通過對樣品前處理技術的學習和利用氣相色譜法對樣品進行檢測，既改善了原有實驗課程的單調性，又提高了實驗課程的趣味性。通過對不同儀器的使用，加深了學生對儀器性質及操作的認知；通過固相萃取法結合氣相色譜檢測的實驗操作，讓學生了解了儀器分析全流程的操作技術手段。同時，在教學的過程中，教師通過學生對實驗各步驟的操作，更加綜合地掌握了學生動手實踐中較為薄弱的環節，并對教學內容進行相應的改進，在明顯提升實驗教學質量的同時，也進一步提升了實驗教師的教學業務水平。