電化學聚合法制備分子印跡電極用于飲料中興奮劑的檢測
——對“電聚合制備導電高分子”實驗的改進

李原婷，楊韻涵，王俊剛，唐意紅，張素霞，韓生

上海應用技術大學化學與環境工程學院，上海 201418

1 實驗改進設計內涵及思路

1.1 實驗改進設計內涵

食品安全是關系國計民生的大事，二十大報告中提出要把思想認識和行動統一到黨中央、國務院決策部署上來，以“四個最嚴”要求為根本遵循，進一步強化風險意識，牢固樹立底線思維，不斷提升食品安全治理能力和治理水平。日常生活中，若飲料中興奮劑添加過量，對消費者生理及心理健康都會造成一定危害[1–3]。

導電聚合物作為新興的高分子功能材料，具有導電性高以及其他特殊的物理化學性能，已經在電池、電極催化材料、傳感器等領域有了廣泛的應用[4]。其中，電化學法合成導電聚合物膜有較多優點：其一，電化學法簡便易行，膜可一步聚合完成，時間短，成本低，且膜厚度可控，結構均勻；其二，電化學法可使原料單體直接在電極表面聚合，減少揮發性有機溶劑的使用，安全環保；其三，通過調節電化學參數，可以方便快速地得到不同結構和性能的聚合物膜，克服了化學法成膜難的問題[5]，因此非常適合本科學生的實驗教學。目前，電聚合導電高分子膜制備及其性能研究已經開始在各大高等院校相關專業的實驗教學中嶄露頭角。

通過調研部分高校關于導電高分子聚合物電化學制備的現有方案，并在完成本校開展的聚苯胺電化學制備實驗后，發現單純的電化學制備方法用時短、現象單一、討論性不足、應用性不強，導致學生體驗感較差，對導電高聚物的具體用途沒有了解，浪費了一個難得的多學科實驗操作機會。因此，將激發實驗興趣的元素，以及能引發理論思考、并與實際生活相貼近的內容融入到實驗設計中十分必要。

1.2 實驗改進設計思路

開放綜合性實驗是當前教學實驗改革的一個突出方向，相比于保守式的任務型實驗，綜合性實驗更能調動學生觀察、動手、思考和團隊協作能力。因此，團隊在現有電化學聚合導電高分子實驗的基礎上，對原有的方案進行了豐富和深化：將導電高分子聚合膜與分子印跡材料相結合，利用電化學法制備出具有分子印跡空穴的導電高分子聚合膜，結合表面增強拉曼光譜技術進行茶飲料中興奮劑茶堿、咖啡因或可可堿的檢測。

(1) 實驗預習階段，將全班同學進行分組。發送文獻供學生學習與討論，在教師的指導下理解分子印跡技術、電化學技術和表面增強拉曼光譜技術。確定擬采用的反應單體、模板分子、電化學聚合方式和條件、待測物吸附時間等。每組同學可以自行決定測定茶堿、咖啡因或可可堿中的一種。通過查閱文獻，確定待測物的表面增強拉曼光譜圖。該階段的教學可在線上開展，符合當前線上線下混合式教學改革的設計理念。同時滲透食品安全檢測重要性，指出黨的十八大以來，習近平總書記就食品安全做出的一系列重要論述，不斷推動食品安全工作等內容的研究，在實驗課程中融入思政元素。

(2) 實驗正式進行階段，每組按照擬定方案進行電聚合實驗，用鄰苯二胺作為功能單體，配制電解液，電聚合得到帶有分子印跡模板的聚合物膜，并利用電化學法進行洗脫。通過實驗現象深化對聚合物結構與性能的認識。

(3) 將分子印跡電極在配制的不同濃度待測分子溶液中進行吸附，并利用表面增強拉曼光譜(SERS)進行檢測，與文獻所得光譜峰進行比對，根據物質的特征峰制作標準曲線。

(4) 對市售包裝飲料(如綠茶、冰紅茶、奶茶等)中的興奮劑進行檢測，并在實驗結束后進行數據處理，計算飲料中興奮劑含量。

綜上所述，改進后的綜合性實驗方案更加充實，調動更多的技術手段，掌握更多前沿知識，可操作性強，也更能充分地利用學時，對學生查閱文獻、操作實踐能力和理論知識要求大幅提升，也對教師的教學方法和課堂設計提出了改革要求。

2 實驗部分

2.1 教學對象分析

課程的教學對象為化學、環境、食品等專業相關的本科生，先修課程為無機化學、分析化學、儀器分析等專業基礎課。

2.2 實驗原理

興奮劑是一類黃嘌呤生物堿化合物，是一種中樞神經興奮劑?？Х?、茶、軟飲料及能量飲料中均有咖啡因成分，過量添加會導致食品安全問題，危害健康。而咖啡因、茶堿和可可堿三種興奮劑結構十分相近(圖1)，用一般的分析技術很難快速對三者進行辨別和檢測[6]。

圖1 三種興奮劑的分子結構式

分子印跡技術也稱為分子模板技術。它以特定目標分子作為模板，模板分子與聚合物單體接觸會形成多重作用位點，當通過聚合形成分子印跡聚合物(Molecularly Imprinting Polymers，MIP)時，這些作用位點會被記憶下來；去除模板分子后，聚合物基質內會形成與模板分子的空間構型及功能基團排列相匹配的空腔，從而對模板分子具有良好的特異性、選擇性識別能力(圖2)。MIP材料可以根據不同目標分子“量體定做”，具有對環境適應性強、穩定性好、成本低、易制備等優點[7]。

圖2 分子印跡技術基本原理[8]

電化學聚合法制備分子印跡聚合物，操作簡便、形態厚度易控、成本低廉，因此成為非常有潛力的制備方法。通過選擇適當的功能單體，控制聚合電位范圍和聚合圈數即可制備得到印跡位點分布均勻、結構穩定且厚度可調的分子印跡聚合物膜。其中，鄰苯二胺單體在酸性水溶液中易電聚合形成致密的聚合膜。與本科教學實驗中常用的吡咯單體相比，鄰苯二胺毒性小，安全性更好。其聚合機理如圖3所示。

圖3 鄰苯二胺電聚合機理[9]

表面增強拉曼光譜技術(Surface-enhanced Raman scattering，SERS)是一種在分子水平上表征吸附于粗糙貴金屬表面物質的分析技術，具有檢測時間短、靈敏度高、干擾小、可無損原位分析等優點，且不需要復雜的樣品前處理過程[10]。貴金屬如金、銀和銅是常見的SERS增強基底。隨著光纖傳感技術的發展和拉曼光譜儀的小型化，更有利于SERS技術進行環境快速檢測的應用。

2.3 實驗試劑及儀器

本實驗中所涉及到的實驗藥品及相關信息如表1所示。

表1 實驗材料及試劑

另附：10 mL電解池、絲網印刷電極若干、1 mL移液槍、10 μL移液槍、250 mL燒杯、100 mL燒杯、10 mL燒杯、10 mL量筒、100 mL容量瓶、50 mL容量瓶、25 mL容量瓶、10 mL容量瓶、塑料滴管、玻璃棒若干。

實驗所用到的儀器見表2。

表2 實驗儀器及設備

2.4 實驗步驟

2.4.1 配制電解液

將含有2.5 mmol·L?1鄰苯二胺功能單體，0.1 mmol·L?1模板分子(咖啡因、茶堿或可可堿)，1.0 × 10?3mol·L?1HAuCl4和0.2 mol·L?1H2SO4溶液混合制備成電聚合溶液(圖4)。其中，HAuCl4和H2SO4溶液由教師準備，其他由學生自行配制，在課前預習時計算好所需試劑質量并進行稱量，均用pH = 7.0磷酸鹽緩沖液(PBS)配制(由教師準備)。

圖4 電解液照片

配制不含茶堿的電解液，所用試劑和濃度同上。

2.4.2 電極活化

搭建三電極體系，打開電化學工作站預熱10 min。將絲網印刷電極接入專用接頭，插入pH = 7.0的PBS緩沖液中。

打開電化學工作站軟件，點擊“方法”，選擇“電流-時間曲線(i-t curve)”。設置參數：電壓2.0 V、活化時間200 s?；罨?，用蒸餾水沖洗去除表面殘留溶液。

2.4.3 電化學聚合法制備具有分子印跡空穴和納米金的聚鄰苯二胺導電膜

打開電化學工作站軟件，點擊“方法”，選擇“循環伏安法(cyclic voltammetry，CV)”。設置參數：掃速為50 mV·s?1，掃描圈數20圈，掃描范圍?0.3 – 0.8 V。接下來，將活化后的印刷電極分別放置在兩種不同的電解液中進行聚合，得到分子印跡電極(MIP/SPE)和非分子印跡電極(NIP/SPE)用于對比。

2.4.4 模板分子洗脫

為MIP/SPE放置于pH = 7.0的PBS中(實驗室準備)，選擇循環伏安法，設置掃速為100 mV·s?1，電位0.2–1.3 V，進行電化學洗脫，以去除模板分子。

2.4.5 掃描電子顯微鏡表征分子印跡膜形貌

將制備的分子印跡膜電極工作電極區域剪成圓形，噴金增強導電性后放大觀測。

2.4.6 吸附及SERS測試

以茶堿為例：將固體溶解在0.1 mol·L?1PBS緩沖液(pH = 7.0)中，制備成1.0 × 10?3mol·L?1的茶堿儲備溶液。使用前，用蒸餾水將上述儲備溶液稀釋至不同濃度，分別為1.0 × 10?8、1.0 × 10?7、1.0 ×10?6、1.0 × 10?5和1.0 × 10?4mol·L?1。

使用便攜式i-Raman光譜系統，在532 nm激發波長下收集分析物的SERS光譜。光譜采集時間設定為20 s，激光功率為40 mW。記錄特征光譜強度，用Origin繪制標準曲線。

2.4.7 選擇性試驗

將可可堿和咖啡因溶解在0.1 mol·L?1PBS緩沖液(pH = 7.0)中，制備成1.0 × 10?3mol·L?1的可可堿和咖啡因儲備溶液。使用前，配制出茶堿、可可堿和咖啡因三者的濃度分別為1 : 1 : 1、3 : 10 : 10、1 : 10 : 10、1 : 0 : 0、0 : 1 : 0和0 : 0 : 1比例的溶液。

使用便攜式i-Raman光譜系統，在532 nm激發波長下收集分析物的SERS光譜。光譜采集時間設定為20 s，激光功率為40 mW。記錄特征光譜強度。

2.4.8 實際樣品測定

以茶堿為例，購置五種不同種類茶飲料，在上述條件下進行直接檢測，將得到的光譜圖與茶堿標準SERS譜圖進行比較。

2.5 實驗注意事項

1) 絲網印刷電極不能全部浸入溶液，以免導線進水。

2) 測試時要從低濃度開始，依次做起。

3) SERS測試前，每次需先掃描暗背景，掃描時要避光。

4) SERS測試時不能直接用眼睛看激光，須佩戴專業護目鏡，避免受傷。

5) 掃描電子顯微鏡儀器昂貴，須遵守實驗室操作規范，噴金等步驟由教師協助統一完成。

3 實驗結果與討論

下述實驗結果均以茶堿作為模板分子為例。

3.1 實驗過程及結果

鄰苯二胺單體在電解液中進行電聚合成膜以循環伏安曲線形式記錄在圖5a)中，氯金酸同步電化學還原過程記錄在圖5b中。從圖中可見，在0.61 V左右出現了一對完全不可逆的氧化峰，隨著掃描圈數的增加，該峰值電流逐漸減小。直到掃描圈數接近20圈時，峰電流幾乎消失，意味著電極表面形成了一層分子印跡膜。而右圖在?0.3 V – 0.0 V的電位范圍內可觀察到一對明顯的金的氧化還原峰，表面氯金酸被還原成納米金顆粒。

圖5 (a)電聚合含模板分子的鄰苯二胺循環伏安曲線圖；(b)電聚合含模板分子的鄰苯二胺及氯金酸還原的循環伏安曲線圖

利用掃描電子顯微鏡(SEM)對形成的分子印跡膜的形貌進行表征。如圖6所示，電化學聚合分子印跡膜呈顆粒狀多孔結構，電化學還原形成的納米金顆粒也均勻分布在膜中，尺寸約為45–50 nm。通過SEM表征，我們可以直觀地觀察到導電聚合膜的形狀結構。

圖6 分子印跡膜電極表面SEM照片

接下來，將MIP/SPE和NIP/SPE分別作為SERS增強基底，使用532 nm作為激發光源，對吸附于基底上的1.0 × 10?5mol·L?1茶堿溶液進行SERS表征。圖7表明，1150和1570 cm?1處的SERS特征峰分別為茶堿分子的環骨架振動和C―H3變形；1368 cm?1處的特征峰屬于C―C的伸展，1487 cm?1處的特征峰屬于嘧啶環的伸展[11]?？梢悦黠@看出，MIP/SPE展現出更強的SERS信號，也證實了分子印跡膜的形成，同時，分子印跡空腔的形成使得茶堿分子進一步接近AuNP表面，從而產生了共振耦合，有效增強了拉曼信號。

圖7 MIP/SPE和NIP/SPE分別吸附1.0 × 10?5 mol·L?1茶堿的SERS光譜

圖8記錄了MIP/SPE檢測不同濃度茶堿的SERS光譜。茶堿的特征峰強度隨濃度的降低而降低，在1.0 × 10?8mol·L?1的濃度下，SERS信號仍然清晰可見。通過觀察特征峰1487 cm?1，濃度的對數與該特征峰強度在濃度為1.0 × 10?8mol·L?1至1.0 × 10?4mol·L?1范圍具有良好的線性關系。線性關系為I(1487 cm?1) = 541.82logc(茶堿) + 6361.43，相關系數R2為0.993。

圖8 使用MIP/SPE檢測1.0 × 10?8 mol·L?1至1.0 × 10?4 mol·L?1濃度的茶堿得到的SERS光譜

由于可可堿、咖啡因與茶堿是均為黃嘌呤堿，結構十分類似。因此，在三者共存的情況下，對茶堿進行SERS檢測，可以考察方法的選擇性。圖9a記錄了茶堿、可可堿和咖啡因三者的濃度分別為1 : 1 : 1、3 : 10 : 10、1 : 10 : 10、1 : 0 : 0、0 : 1 : 0和0 : 0 : 1時的SERS光譜。從圖中可見，茶堿特征峰在三者濃度為1 : 1 : 1時，強度并沒有明顯下降。經過數據統計作圖，以1 : 0 : 0濃度時茶堿特征峰1487 cm?1處的SERS譜峰強度為參比，統計了MIP/SPE和NIP/SPE在不同混合溶液中該特征峰處的譜峰強度。從柱狀圖(圖9b)可見，當干擾物的濃度比茶堿大10倍以上時，非印跡電極在特征峰處的強度下降了78%，而印跡電極僅下降了49%，說明印跡電極對茶堿有更強的選擇能力。

圖9 (a) 在可可堿和咖啡因存在下，使用MIP/SPE檢測茶堿得到的SERS光譜。其中，茶堿、可可堿和咖啡因三者的濃度分別為1 : 1 : 1、3 : 10 : 10、1 : 10 : 10、1 : 0 : 0、0 : 1 : 0和0 : 0 : 1；(b) 與1 : 0 : 0濃度時茶堿特征峰1487 cm?1處的SERS譜峰強度對比，統計了MIP/SPE和NIP/SPE在不同混合溶液中特征峰處的譜峰強度

通過使用MIP/SPE對市售茶飲料樣品中茶堿進行識別和測定，進一步證實了方法的可行性。自超市購置了四種不同茶飲料樣品，分別為可口可樂淳茶舍、元氣滿滿乳茶、康師傅茉莉蜜茶、統一冰紅茶，并向其中分別添加1.0 × 10?5mol·L?1茶堿作為加標實際樣品。在圖10中記錄了在不加標和加標茶堿的茶飲料的SERS光譜。由于一般茶飲料中都富含大量的茶堿分子，因此在未加標的茶飲料樣品中可以觀察到THP的特征峰1487 cm?1。該結果還表明其他食品添加劑成分或天然有機物對SERS檢測的影響很小。將茶堿添加到飲料樣品中后，可以更明顯地識別出1487 cm?1的特征峰，進一步證明了方法的可行性。

圖10 使用MIP/SPE記錄的4種不同茶飲料樣品(黑色)和添加1.0 × 10?5 mol·L?1茶堿后(紅色)的SERS譜圖

3.2 實驗思考及成績評定

該實驗可給學生布置以下計算和思考題：

(1) 電聚合掃描圈數對聚合物膜是否有影響；

(2) 你認為還有哪些因素可能影響膜的聚合；

(3) 根據擬合的線性方程，請計算選取的市售飲料中茶堿的含量。

實驗課按3人一組分組實施，分線上預習和線下操作兩階段完成。學生的實驗成績評價和考核按照如下方式賦分：預習報告20分、實驗操作40分，實驗報告35分，實驗安全和衛生5分，總計100分。

3.3 實驗改進討論

原有實驗采用的是聚吡咯等導電聚合物膜的制備，以驗證性為主，內容偏少，觀察到的現象不多；而改進后的實驗采用的鄰苯二胺單體安全且不易揮發，實驗內容安排充足，更加豐富，讓學生對聚合物膜在傳感領域的應用有更加深入的了解。具體表現在以下幾個方面：

(1) 實驗內容設計豐富，以電聚合鄰苯二胺為主線，融合分子印跡技術和SERS檢測技術，學生在同一個實驗中可以掌握多種方法。

(2) 教師可根據實驗室的具體情況進行一些條件的指定，也可對一個或多個班級的方案進行統籌；還可根據最新文獻進行方案進一步優化。

(3) 使用便攜的絲網印刷電極，省去打磨電極部分，避免與其他電化學實驗步驟重復，也讓學生體會到傳統方法在不斷改進中。

(4) 結合生活實際，從大家日常生活中常喝的飲料入手進行分析，涉及了同學們感興趣的領域，學生可以自由選擇分析物進行實驗，激發好奇心。

(5) 綜合了電化學工作站的使用、拉曼光譜儀、掃描電子顯微鏡的使用和操作，學習電解液的配制、循環伏安法的運用、SERS操作和Origin軟件進行數據處理，再結合圖譜解析、電聚合原理講解等理論性知識的學習，使學生的綜合能力得到極大鍛煉。

(6) 實驗時間分配更靈活，適宜6學時至8學時的課程：如果對聚合條件探索內容進行適度增加，可增加至8學時。其中，2學時為線上預習學時，4–6學時為線下實驗部分。

4 結語

該實驗將一個傳統任務型實驗改進設計為綜合性實驗，既是對學生能力的考量，也是對教師教學能力的挑戰。實驗分為線上和線下兩部分，實驗前留給學生充足的時間學習文獻和準備，明確實驗思路及實驗條件來感悟實驗原理，體會實驗步驟所涉及的前沿技術，更加清晰高效地進行實驗檢測。教師則要梳理好如何組織學生進行文獻調研、方案擬定，對各組的實驗方案進行統籌規劃等，這也對教師的專業素養提出了更高的要求。并且，開放式設計也可推進線上線下混合式教學改革，也是實驗教學發展的一個趨勢。此外，可借助預習階段的文獻閱讀和討論部分，將導電高分子的發現與發展中的思政元素巧妙融入課程學習中。

實驗改進后，可行性高、內容豐富、涉及面廣、綜合性強，涵蓋了有機化學、電化學、高分子化學與物理以及儀器分析等諸多二級學科，更貼合現代化學學科發展；開放式設計與表征相結合的方案，強調文獻調研和實驗探索，可敦促學生將理論與實踐更好地結合起來，有利于學生專業知識體系的建立以及創新思維和科研能力的培養，也更契合本科實驗教學與時俱進的改革要求。