水楊酸甲酯及其同分異構體的氣質聯用定性分析
——推薦一個啟發思維的質譜實驗

丁玉潔，高曉慧，李昆，蔡熾，陳淑云，彭電，劉浩然,＊

1 湖南大學化學化工學院，化學生物傳感與計量學國家重點實驗室，教育部分析化學課程虛擬教研室，湖南大學化學實驗教學中心，長沙 410082

2 長沙衛生職業學院，長沙 410605

質譜分析是儀器分析中一個重要的組成部分。各高校的質譜分析實驗目的各不相同，設計各有特色。有的采用氣質聯用或液質聯用檢測混合物[1,2]；有的采用基質輔助激光解析質譜檢測蛋白質或其他高分子[3,4]；有的則把質譜作為制備化合物的一個檢測手段用來驗證結構[5]；有的只是用質譜儀檢測簡單化合物，注重儀器操作而不是解析[6]。

在課程設置上，有的學校是將質譜實驗作為波譜分析實驗的一部分，也有的學校將質譜實驗作為專業實驗或綜合實驗來開設。由于質譜昂貴、復雜，實驗中能讓學生親自動手的機會不多，而質譜解析現在大多是通過計算機搜索譜庫來完成。由此，在很多質譜實驗中學生可能主要是觀摩整個過程，見識一下，參與程度不高。我們認為，除了讓學生熟悉基本的質譜操作外，質譜的解析對于本科生來說亦是不可或缺的過程，這一過程不能停留在理論課堂上由老師給出幾個圖譜來進行訓練，更需要通過實驗來真切地感受，在實驗過程中鞏固理論、提升實驗技能。筆者經過多年不斷地摸索、完善，設計了一個既生動有趣、又能涵蓋眾多質譜知識的實驗，對于學生的質譜分析技能、思維均有良好的提升作用?，F推薦如下。

1 實驗背景

水楊酸甲酯(1，鄰羥基苯甲酸甲酯)是冬青油的主要成分，也是風油精、紅花油等藥物的化學成分之一[7,8]。水楊酸甲酯同分異構體眾多。我們選擇以下5個生活中常見的異構體與之進行對比分析，借以鞏固學生的質譜理論知識，并提升其質譜解析的能力。尼泊金甲酯(2)：尼泊金甲酯(對羥基苯甲酸甲酯)是經典的防腐劑，在藥品、化妝品用有廣泛的應用[9]。間羥基苯甲酸甲酯(3)：間羥基苯甲酸甲酯是水楊酸甲酯及尼泊金甲酯的異構體，只是酚羥基的取代位置不同。香蘭素(4)：香蘭素又稱香蘭醛，在藥品、食品中作為香味劑[10]。2,4-二羥基苯乙酮(5)及3,4-二羥基苯乙酮(6)二者是化學合成中重要的中間體，可作為合成天然產物查耳酮、黃酮的原料[11,12]。

圖1 化合物結構式

2 實驗目的

(1) 掌握氣質聯用儀的基本操作方法、基本參數；

(2) 鞏固質譜解析的一般方法，熟悉苯環、酯、酚、醛、甲基、甲氧基等各基團的裂解特征；

(3) 熟悉質譜中的重排規律。

3 實驗材料

3.1 主要試劑

水楊酸甲酯(鄰羥基苯甲酸甲酯)、尼泊金甲酯(對羥基苯甲酸甲酯)、間羥基苯甲酸甲酯、香蘭素、2,4-二羥基苯乙酮、3,4-二羥基苯乙酮，以上均為分析純；甲醇，色譜級。

3.2 主要儀器

TRACE200 POLARIS Q型氣質聯用儀，美國菲尼根公司。

4 實驗方法

4.1 色譜條件

進樣器溫度250 °C，載氣(氦氣)流速1 mL·min?1，起始溫度120 °C，保持3 min，10 °C·min?1程序升溫，升至200 °C，保持2 min。進樣分流比1 : 20。質譜條件：傳輸線溫度210 °C，離子源210 °C，質荷比掃描范圍35–500m/z，溶劑延遲設為3 min。

4.2 操作步驟

用色譜級甲醇配制水楊酸甲酯溶液，使濃度控制在1 μg·mL?1左右。用進樣針吸取上述溶液0.1 μL，進樣。記錄總離子流圖、質譜圖(“棒圖”)。

5 結果分析與討論

5.1 基本信息

水楊酸甲酯總離子流圖顯示，其保留時間為4.29 min (圖2上)。質譜棒圖顯示，其分子離子峰質荷比為152，基峰為120，其余碎片有92，65，39 (圖2下)等。

插穗的生長年限決定其體內的營養物質積累和木質化程度。1年生莖可能由于生長時間較短，養分存儲不足，加上髓部較大，所含粘液較多而容易腐爛。所以多年生的插穗成活率普遍比1年生莖高，且根系平均長度、根叢數量、新生幼枝平均長度整體上都比1年生莖的表現出明顯優勢。但如果選取過于老化的枝條，其內源生長素會逐漸減低，細胞的再生能力也會逐漸降低，所以其生根能力和成活率也會降低，故在實際生產中，小花清風藤扦插繁殖建議剪取2～4年生的枝條作為插穗最適宜。

圖2 水楊酸甲酯的質譜總離子流圖(上)及質譜棒圖(下)

5.2 結果初步分析

m/z152為最右端的峰，與之相鄰的峰為120，二者相差32，差值在合理范圍內，故152為分子離子峰?？赡芎紨祩€氮，或不含氮。152到120之間差值為32，一般此為中性片段甲醇[13]。120到92之間質荷比相差28，可能為羰基的碎片，也可能是酚類的裂解碎片[13]。m/z92或91一般為取代苯的特征離子。以不含氮考慮，則一般物質含碳、氧、氫。計算分子量為152的分子式。如為10個碳原子，則分子式為C10OH16或C10O2，均不合理。如為9個碳原子，則分子式為C9O2H12，不飽度為4；如為8個碳原子，則分子式為C8O3H8，不飽度為5。

經過上述綜合分析，學生一般能推斷出結構為水楊酸甲酯(鄰羥基苯甲酸甲酯)、間羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸甲酯其中之一。但要確定為水楊酸甲酯有較大難度。因為本實驗涉及重排裂解。

5.3 實驗難點、重點討論

此實驗中涉及的第一個知識點是重排裂解，這也是其中的重點和難點。一般教科書重點講述的通常是McLafferty重排(麥氏重排)。不過此處涉及的重排卻是“芳環鄰位效應”，只有極少數教科書提及[14]。其原理是一些含有雜原子取代基的鄰二取代苯常發生六元環過渡重排，脫去中性分子碎片。事實上，在水楊酸甲酯這一裂解過程中有兩個途徑(圖3)。除了上述重排裂解之外，仍然存在失去?OCH3自由基的情況[13,15]。因此，在質譜棒圖中，m/z120占優勢，但也存在m/z121的峰。

圖3 水楊酸甲酯的重排(脫去CH2OH中性分子)與非重排裂解(脫去OCH3自由基)

就“芳環鄰位效應”這一主題，我們可以拓展一下。類似地，鄰羥基苯甲醇、鄰甲基芐胺、水楊酸、鄰氨基酚及鄰苯二酚在裂解中也會存在芳環鄰位效應[14]，在重排裂解過程中脫去水或氨(圖4)。因此，借助于這一實驗，可直觀認識重排裂解，又可鞏固理論知識。對于具有相應結構的分子，可推斷出可能發生的重排。

圖4 具有“芳環鄰位效應”的幾個化合物

通過上述例子，結合理論課上的基礎，學生無需刻板記憶即能基本掌握質譜的“芳環鄰位效應”這一重排裂解規律，并能運用到其他類似化合物的解析之中，通過實驗“反哺”理論知識。

第二個知識點是酚類的裂解規律。酚羥基上的氫容易離去重排到芳環上，隨后發生α裂解，引起開環。接著可發生i斷裂，失去CO，得到[M ? 28]的奇電子碎片離子。也可以再發生氫重排和置換反應，得到[M ? 29]的碎片離子。

第三個知識點是比較常規的苯環裂解規律。m/z77，65，51，39一般為苯環關聯的特征峰。取代苯可能出現m/z91或92的峰，這也是理論及實驗教學中應把握的基本知識點。

雖然隨著科技的發展，質譜的解析主要依靠計算機技術，極大減少了人工解析的工作量。但面對計算機給出的可能結構式，最終確定結構仍需要人的判斷。因此，對本科生而言在質譜解析中鞏固、延伸基礎知識，培養、提升思維能力十分重要。

5.4 與同分異構體的對比分析

為加深學生對“芳環鄰位效應”知識的理解，并在實驗中鞏固理論知識，我們通過搜索譜庫，找到下述水楊酸甲酯幾個異構體的質譜圖，進行對比分析。

(1) 對比分析尼泊金甲酯(對羥基苯甲酸甲酯) (圖5A)、間羥基苯甲酸甲酯(圖5B)的質譜圖。由于二者的酚羥基沒有處于甲酯的鄰位，不會形成重排。因此，二者沒有m/z120的峰，只有脫去˙OCH3自由基后的m/z121的峰。這一對比可以加深對“芳環鄰位效應”的理解。

(2) 對比分析香蘭素的質譜圖(圖5C)。因香蘭素為醛類，其特點是有較大的[M ? 1]及[M ? 29]的峰。這是醛的特征。較易識別。

(3) 對比分析2，4-二羥基苯乙酮(圖5D)、3，4-二羥基苯乙酮(圖5E)的質譜圖。二者的基峰都是脫去甲基后m/z137的峰。前者除基峰以外，其余峰的豐度均非常小。而后者先脫去一分子CO產生一個m/z109的峰，再脫去一分子CO后形成m/z81的峰。

6 教學思考

本實驗具有以下特點：

(1) 所選化合物均為生活中常見或者具有重要生物活性的物質，學生實驗時倍感親切，能激發其對專業的興趣。除上述六種化合物外，有學生想到生活中常用的樟腦、木糖醇分子量亦為152，也想測一測它們的質譜圖。正如科學家愛因斯坦所言，“興趣是最好的老師”。

(2) 聯系理論與實驗教學，啟發思維。以水楊酸甲酯為中心設計，通過對其同分異構體質譜圖的對比，不僅讓學生掌握了氣質聯用儀的基本操作方法，又鞏固了學生的質譜解析知識，在相互關聯的實例中熟悉了苯環、酯、酚、醛、甲基、甲氧基等各基團的質譜裂解特征。特別是對“芳環鄰位效應”這一重排裂解知識加深了認識。

(3) 本實驗可培養學生綜合思維能力，充分調動學生的主觀能動性。筆者曾問學生，“如果用氣質聯用儀測間羥基苯甲酸甲酯和對羥基苯甲酸甲酯，從質譜圖上是否能區分開來？”答曰“非常難”或“不可能”。又問“用什么分析方法容易區分二者？”答曰“核磁共振”。由此，學生意識到“尺有所短，寸有所長”的哲學道理，也更加理解為什么化合物解析通常是四大譜進行綜合解析。

(4) 本實驗學時、難度靈活可調。本實驗如果只測定水楊酸甲酯一般2小時內可完成。如果要測定多個化合物，學時可設置為4學時。也可以將其中一個化合物作為常規實驗用，將其他化合物作為未知物進行實驗考核。由于均為同分異構體，學生如果只看分子量而不進行詳細解析并結合其他方法(紅外、核磁)是難以得到正確答案的。

綜上所述，本實驗能提升本科生質譜分析的思維能力，可推薦為化學、藥學、食品等相關專業本科生作為實驗項目，亦可作為研究生訓練素材。