基于UHPLC-Q-TOF-MS 技術分析假北紫堇入血成分及代謝產物

★ 余惠敏 李婉亭 劉海燕 何明珍,3 馮育林,3 鐘國躍,3（.江西中醫藥大學 南昌 330006；.南昌海關技術中心 南昌 330006；3.江西本草天工科技有限責任公司 南昌 330006）

假北紫堇藏藥名桑格絲哇，是罌粟科紫堇屬植物，分布于甘肅南部至中部、青海東部至南部、四川西北部至西南部和西藏東部，生長于海拔2 500～4 000 m 的亞高山針葉林下或山坡路旁［1］。假北紫堇以全草入藥，具有活血散瘀、清熱解毒、消腫鎮痛之功效［2］?；瘜W成分研究表明，該屬植物主要含有生物堿類成分，除此之外還含有黃酮、揮發油、甾體等成分［3-6］?，F代藥理學研究發現，該屬植物具有抗腫瘤、抗炎鎮痛、抗心律失常、保肝等作用［7-12］。在藥理活性方面，目前多集中在提取物的藥效研究，活性成分有待更進一步探究。有相關研究表明，藥物進入血液后才有可能發揮療效［13-14］。因此，有必要分析藥物的入血成分，以便找到藥物發揮作用的物質基礎。故本實驗利用中藥血漿藥物化學方法，結合UHPLC-Q-TOF-MS 技術，對含藥血漿進行快速分析，為假北紫堇藥效物質基礎及藥效研究提供依據。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Triple TOF 5600+高分辨質譜儀（美國AB Sciex公司）；LC-30A 超高效液相色譜儀（日本島津公司）；Analyst TF 1.6 和PeakView 1.2 數據處理系統（美國AB Sciex 公司）；EYALA 旋轉蒸發器（日本Eyala 公司）；電子分析天平（賽多利斯科學儀器有限公司）；HC-3018R 高速冷凍離心機（安徽中佳科學儀器有限公司）。

1.2 材料

假北紫堇購自西藏日喀則市江孜縣，經江西中醫藥大學鐘國躍教授鑒定為罌粟科紫堇屬植物假北紫堇的干燥全草，樣品標本（20200613）保存在江西中醫藥大學中藥固體制劑制造技術國家工程研究中心。甲醇、乙腈（色譜純，美國 Fisher Scientific 公司）；甲酸（色譜純，西亞試劑）；超純水（杭州娃哈哈集團有限公司）。SPF 級SD 雄性大鼠，體質量180～200 g，購自廣東省實驗動物監測所，動物生產許可證號SCXK（湘）2019-0004，適應性喂養4 d，動物保持自由飲水和進食。本實驗過程對動物處理均符合我國《實驗動物管理條例》及江西中醫藥大學實驗動物科技中心倫理委員會相關規定。

2 方法

2.1 假北紫堇提取物的制備

精密稱取假北紫堇藥材500 g，加10 倍體積70%乙醇回流提取3 次，每次時間為1.5 h，合并3 次提取液，濃縮干燥即得假北紫堇提取物，計算提取得率為21%。

2.2 供試品溶液的制備

精密稱取假北紫堇干燥提取物100 mg，加入10 mL 甲醇，超聲，使其完全溶解，用0.22 μm 有機微孔濾膜過濾，即得供試品溶液。

2.3 含藥血漿的制備

動物適應性飼養4 d 后，將SD 大鼠隨機分為空白組和給藥組，每組3 只。給藥前禁食12 h（可自由飲水），給藥組用400 mg/kg 的假北紫堇提取物灌胃給予大鼠，提取物用適量的0.5%羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）溶液溶解；空白組用等體積的0.5% CMC-Na 溶液灌胃給予大鼠。分別于給藥后0.5、1、2、4 h 于各組大鼠眼眶取血約0.5 mL，放入2 mL 事先用肝素鈉處理的EP 管中，3 500 r/min離心15 min，取上清液，即得血漿樣品，并將血漿樣品放置于-80 ℃冰箱中，備用。

2.4 血漿樣品的預處理

將同1 組大鼠血漿渦旋混合，以減少個體差異，再分別取各組血漿200 μL，加入3 倍量甲醇沉淀蛋白，渦旋混合3 min，于4 ℃、12 000 r/min 離心10 min。取上清液，氮氣吹干，殘渣用200 μL甲醇復溶，渦旋混合3 min，于4 ℃、12 000 r/min離心10 min，取上清液，進UHPLC-Q-TOF-MS分析。

2.5 色譜條件

Welch XB-C18（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）色譜柱，自動進樣器溫度4 ℃，柱溫40 ℃，流動相（A）：0.1%甲酸水；流動相（B）：乙腈。梯度洗脫，洗脫條件為：0.1～3 min，10%～15% B；3～15 min，15%～25% B；20～40 min，40%～95% B；40～42 min，95% B；42.1～45 min，10% B；進樣量3 μL，流速：0.3 mL/min。

2.6 質譜條件

電噴霧離子源正離子模式，質量掃描范圍m/z50～1 250，噴霧電壓（ISVF）：5 500 V，霧化器溫度（TEM）：550 ℃，氣簾氣（CUR）：30 psi（1 psi=6.895 kPa），輔助氣（GS1、GS2）：50 psi；裂解電壓（DP）：100 V，碰撞能量（CE）：30 eV，碰撞電壓差（CES）：15 eV。

2.7 數據分析

通過查閱文獻，對紫堇屬植物的化學成分進行了匯總，包括分子式、結構式、相對分子質量、中英文名稱等。建立假北紫堇化學成分數據庫，利用PeakView 軟件，對比分析假北紫堇提取物和含藥血漿中各化合物的保留時間及二級質譜圖，兩者共有且二級質譜碎片相同的成分可以確認為給藥組血漿中的原型成分。另通過查閱文獻并結合入血原型成分的結構特點和質譜裂解規律，分析推測入血成分的代謝產物，對 UHPLC-Q-TOFMS 采集的數據進行對比分析，快速鑒定出已知化合物。

3 結果

3.1 假北紫堇 UHPLC-Q-TOF-MS 總離子流圖的采集

取“2.2”“2.4”項下經處理后的供試品溶液、空白血漿樣品、含藥血漿樣品適量，按“2.5”“2.6”項下色譜與質譜條件進樣分析，獲得正離子模式下的總離子流圖。見圖1。

圖1 正離子模式下的總離子流圖

3.2 假北紫堇入血成分的鑒定

含藥血漿樣品按照“2.5”“2.6”項下方法進樣檢測，將得到的質譜原始數據導入PeakView 1.2數據處理軟件中，分析質譜裂解規律，結合自建的假北紫堇化學成分數據庫，在給予了假北紫堇提取物的大鼠血漿中鑒定得到20 個入血原型成分，并通過篩選給藥血漿樣中出現的離子信號，最終在大鼠血漿中共鑒定得到13 個代謝物，代謝途徑主要為甲基化、甲基羧酸化、脫水、葡萄糖醛酸化，以及復合反應等。見表1、表2。

表1 假北紫堇提取物大鼠血漿中原型成分分析的鑒定結果

化合物2：正離子模式下分子離子峰m/z146.059 8［M+H］+，tR為2.36 min， 推斷其分子式為C9H7NO，碎片離子為m/z118.064 1，推測應該是母離子失去1 分子CO 所產生的，結合參考文獻［15］和Mass Bank 數據庫推測該化合物2 為3-吲哚甲醛，其可能的裂解途徑見圖2。

圖2 3-吲哚甲醛的裂解途徑

化合物3：正離子模式下分子離子峰m/z206.082 8［M+H］+，tR為2.37 min， 推斷其分子式為C11H11NO3，碎片離子為m/z178.080 9 推測應該是母離子失去1 分子CO 所產生的，碎片離子m/z149.062 1 推測應該是繼續失去1 分子CH3NH 所產生，根據其裂解特性以及文獻［16］報道，推測化合物3 為Oxyhydrastinine，其可能的裂解途徑見圖3。

圖3 Oxyhydrastinine的裂解途徑

化合物5：正離子模式下分子離子峰m/z328.154 2［M+H］+，tR為3.49 min， 推斷其分子式為C19H21NO4，碎片離子為m/z298.511 4 推測應該是母離子失去1 分子OCH3所產生的，碎片離子m/z297.114 1 推測應該是母離子失去1 分子NH2CH3所產生。m/z282.093 7 推測應該是碎片A 繼續失去1 分子CH4所產生。碎片離子m/z237.065 2 推測是碎片A 繼續失去2 分子OCH3所產生，碎片離子m/z222.080 2 推測應該是碎片B 失去1 分子OH所產生，根據其裂解特性以及文獻［17］報道，推測化合物5 為10-O-methylhernovine，其可能的裂解途徑見圖4。

圖4 10-O-methylhernovine的裂解途徑

化合物13：正離子模式下分子離子峰m/z354.134 5［M+H］+，tR為7.47 min，推斷其分子式為C20H19NO5，碎片離子為m/z49.060 4 和碎片A 推測是母離子RDA 裂解所產生，碎片A 會繼續失去水分子或者羥基形成2 個碎片峰，根據其裂解特性以及文獻［18］報道，推測化合物13 為原阿片堿，其可能的裂解途徑見圖5。

圖5 原阿片堿的裂解途徑

化合物14：正離子模式下分子離子峰m/z324.123 2［M+H］+，tR為7.81 min， 推斷其分子式C19H17NO4，碎片離子為m/z149.060 1 和碎片離子為m/z176.070 1 推測是母離子RDA 裂解所產生，根據其裂解特性以及文獻［19］報道，推測化合物13 為四氫黃連堿，其可能的裂解途徑見圖6。

圖6 四氫黃連堿的裂解途徑

M3 分子量比咖諾定多12 Da 為咖喏定甲基羧酸化加脫水形成，二級碎片離子m/z366.069 6 推測是A 化合物失去1 分子COOH 所產生。M5 分子量比咖諾定少36 Da，二級碎片離子m/z317.066 9 推測該入血成分為B 化合物失去1 分子CH3所產生，裂解途徑見圖7［20］。

圖7 M3、M5的裂解途徑

M6 分子量比Ochrobirine 多176 Da，二級碎片離子m/z190.097 9，與Ochrobirine 一致，推測是該入血成分為Ochrobirine 葡萄糖醛酸化結合產物，裂解途徑見圖8［21］。

圖8 M6的裂解途徑

M11 分子量比煙酰胺多14 Da，二級碎片離子m/z94.065 7 是煙酰胺甲基化失去1 分子CONH2所產生，推測該入血成分為煙酰胺甲基化結合產物，裂解途徑見圖9［22］。

圖9 M11的裂解途徑

4 結論

研究表明，UHPLC-Q-TOF-MS 技術能夠快速準確分離和鑒定大鼠血漿中假北紫堇的化學成分，具有較高的分辨率，為假北紫堇入血成分的定性分析提供了一種快速、簡便、可靠的分析手段。本實驗采用UHPLC-Q-TOF-MS/MS 法結合PeakView 1.2 軟件對假北紫堇入血成分進行分析，從空白血漿、給藥血漿中提取對應化合物獲得相應離子流圖。再基于假北紫堇所含成分和相關文獻中的質譜數據對比，在大鼠給藥后入血成分中共鑒定出31 個化學成分，包括20 個原型成分，以及11 個代謝產物。通過分析，假北紫堇的入血成分主要為生物堿，這類成分主要發生了甲基化、葡萄糖醛酸化、甲基羧酸化等代謝反應。據報道紫堇屬中主要是生物堿成分，其中原阿片堿是典型的生物堿成分，具有良好的抗菌［23］、抗心律失常［24］、抗炎［25］作用。因此，生物堿成分可能是假北紫堇發揮藥理作用的藥效物質，但具體是哪些物質發揮作用及其發揮作用的機制還有待進一步研究。到目前為止，鮮有關于假北紫堇體內代謝的研究的文獻報道，本實驗運用高分辨質譜對假北紫堇進行體內研究，確定假北紫堇的入血原型成分，并鑒定了其代謝物，為假北紫堇的進一步開發和臨床合理應用奠定理論基礎。