α-常春藤皂苷通過激活和穩定p53/Noxa信號誘導肝癌細胞凋亡*

陳曉靜,周莉,劉凱琪,段菊鳳,劉明,李洪亮,汪選斌,2,3

[1.湖北醫藥學院附屬人民醫院藥學部和藥學院,十堰 442000;2.湖北醫藥學院生物醫藥研究院,十堰 442000;3.武當特色中藥研究湖北省重點實驗室(湖北醫藥學院),十堰 442000]

預知子(AkebiaeFructus)為湖北武當山地區特色中藥,α-常春藤皂苷(α-hederin)為其主要活性成分,也是其質量標志物[1-2]。α-常春藤皂苷可體外抑制胰腺癌、肺腺癌、喉癌、結腸癌、組織細胞淋巴瘤、急性單核白血病等細胞的增殖[3-4],在體內亦可抑制肝細胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)的生長和轉移[5],可導致HCC胞膜孔隙形成[4,6],使活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS)升高,膜滲透性增加,產生凋亡[5,7-9],抑制HCC轉移[10]。但α-常春藤皂苷誘導HCC凋亡的機制尚不完全清楚。筆者在本研究將α-常春藤皂苷作用于HCC,研究其誘導凋亡可能的機制,以期為解釋預知子抗肝癌作用機制提供依據。

1 材料與方法

1.1實驗動物 6～8周齡雄性Balb/c裸鼠10只,無特定病原體(specific pathogen free,SPF)級,購買于斯貝福(北京)生物技術有限公司,飼養于湖北醫藥學院動物中心,實驗動物生產許可證號:SCXK(京)2019-0010。實驗符合動物實驗倫理規定[倫理審查批件編號:TY20222505,湖北醫藥學院動(福)第2022-實090號]。

1.2藥品與試劑 α-常春藤皂苷購于成都埃法生物科技有限公司(貨號:AB1189,含量>98%);陽性對照藥喜樹堿(camptothecin,CPT)購于Selleck公司(上海),貨號:S1288;噻唑藍[3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,MTT]購于合肥Biosharp公司(貨號:3580GR001);PI/Annexin V 凋亡檢測試劑盒購于BD生命科學(美國Becton,Dickinson and Company,貨號:556547);Noxa單抗隆一抗(兔抗人,1：1 000,貨號:14766S)、p-p53單抗隆一抗(兔抗人,1：1 000,貨號:9287T),p53單抗隆一抗(兔抗人,1：1 000,貨號:2527S)、Bcl-2單抗隆一抗(小鼠抗人,1：1 000,貨號:3498T)、Bax單抗隆一抗(兔抗人,1：1 000,貨號:5023)、Cytc單抗隆一抗(小鼠抗人,1：1 000,貨號:4280T)、caspase 3單抗隆一抗(小鼠抗人,1：1 000,貨號:9662)、Cleaved-caspase3單抗隆一抗(兔抗人,1：1 000,貨號:9579)、caspase9單抗隆一抗(小鼠抗人,1：1 000,貨號:9504)、Cleaved-caspase9單抗隆一抗(兔抗人,1：1 000,貨號:9509)、PARP單抗隆一抗(兔抗人,1：1 000,貨號:9532)、Cleaved-PARP單抗隆一抗(兔抗人,1：1 000,貨號:5625)以及相應二抗均購自美國Cell Signaling Technology公司;甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate delydrogenase,GAPDH)單克隆一抗(小鼠抗人,1：1 000)購自Proteintech(美國蛋白質技術公司,貨號:60004)。小干擾RNA干擾siRNA Noxa購自美國Santa Cruze公司(貨號:14766S),小干擾RNA干擾siRNA p53購自美國Santa Cruze公司(貨號:K0816)。

1.3儀器 酶標儀(瑞士TECAN公司,型號:A5082);流式細胞分析儀(美國Beckman Coulter公司,型號:CytoFLEX);二氧化碳(CO2)培養箱(美國Thermo公司,型號:Model 3111);凝膠成像儀(美國Bio-Rad公司,型號:ChemiDocTM XRS+)。

1.4細胞及培養 人肝癌細胞系Bel-7402和HepG2來自湖北醫藥學院附屬人民醫院中藥藥理實驗室。細胞以含10%胎牛血清的RPMI-1640培養基培養于37 ℃、5%CO2環境中。

1.5MTT檢測 參照文獻檢測α-常春藤皂苷對HCC的體外抑制作用[12],將HCC細胞分別與0(對照組,Control組)、10、15、20和30 μmol·L-1α-常春藤皂苷共培養0、24和48 h。5 mg·mL-1MTT染色,酶標儀于波長490 nm處讀取吸光度值,計算細胞抑制率。

1.6流式細胞術(flow cytometry,FCM)檢測 以Annexin V-FITC/PI染色,并以FCM檢測凋亡率[12]。即將Bel-7402和HepG2細胞接種到6孔板,24 h后加入0(對照組,Control組)、10、20、30 μmol·L-1α-常春藤皂苷。按試劑盒說明書進行:Annexin V(1.25%,5 μL)-FITC/PI(20 μg·mL-1,5 μL)于室溫下避光染色5 min,流式細胞分析儀上檢測凋亡。

1.7轉錄組學分析 將0(對照組,s0)、10(s10)、20(s20)和30(s30) μmol·L-1α-常春藤皂苷作用于HCC 24 h。收集樣品并送上海Bioin生物技術有限公司進行轉錄組學檢測。

1.8RNA干擾 將Bel-7402細胞分為對照組、siRNA干擾空白組(Con siRNA)、siRNA組(p53 siRNA或Noxa siRNA)和siRNA-p53/Noxa+α-hederin組(siRNA-p53+α-hederin 30 μmol·L-1或siRNA-Noxa+α-hederin 30 μmol·L-1)。HCC細胞于對數生長期置于6孔板,CO2培養箱培養24 h。將脂質體3000(lipofectamine 3000,美國Invitrogen公司)加入Opti-MEM培養基稀釋,稀釋比例1：1。加入細胞轉染48～72 h,以蛋白免疫印跡(western blotting,WB)檢測蛋白表達變化。

1.9實時熒光定量多聚核苷酸鏈式反應(real-time quantitative polymerase chain reaction,qRT-PCR) 為檢測α-常春藤皂苷及RNA干擾對HCC基因的影響,以qRT-PCR檢測mRNA的表達[11](表1)。

表1 qRT-PCR引物序列

1.10WB實驗 在α-常春藤皂苷(10、20和30 μmol·L-1),喜樹堿(陽性對照,10 μmol·L-1),脂質體-質粒干預HCC細胞24 h前后進行WB實驗[11],于凝膠成像儀檢測蛋白條帶。

1.11蛋白穩定性實驗 以放線菌酮(cycloheximide,CHX,50 μg·mL-1)和(或)α-常春藤皂苷作用于Bel-7402及HepG2細胞0(對照組,Control組)、1、2、4、6和8 h[12],WB檢測蛋白表達量。

1.12體內移植瘤實驗 取生長良好的對數生長期Bel-7402細胞,于裸鼠前肢右側腋下接種0.2 mL(細胞密度1×106個·mL-1)。造模24 h后每2 d觀察瘤體生長情況,約1周后,接種的裸鼠均出現圓形或橢圓形、直徑約11 mm皮下質硬結節,即為造模成功。將造模成功的小鼠正常喂養,隨機分為模型組(DMSO)和給藥組(α-常春藤皂苷10 mg·kg-1),每組5只,腹腔注射給藥。小鼠稱體質量,檢測瘤體大小,觀察22 d內裸鼠腫瘤體積變化,給藥完畢后處死裸鼠,剝離腫瘤并稱質量,瘤體置-80 ℃冰箱備用。

2 結果

2.1α-常春藤皂苷誘導HCC細胞凋亡 以不同濃度α-常春藤皂苷[0(對照組)、10、15、20和30 μmol·L-1]干預Bel-7402和HepG2細胞24、48 h后,細胞存活率均呈時間和劑量依賴性下降(圖1A)。FCM結果顯示,HCC細胞呈劑量依賴性凋亡(圖1B)。WB結果顯示,裂解態凋亡蛋白比例增加,提示α-常春藤皂苷可上調Bel-7402和HepG2細胞中凋亡蛋白PARP、Caspase9和Caspase3活性(圖2)。

A.α-常春藤皂苷干預后肝癌細胞生存率曲線;B.流式細胞術檢測肝癌細胞的凋亡情況。①與對照組比較,t=1.667～29.33,P<0.05;②與對照組比較,t=-49.06～-11.27,P<0.01。

A.α-常春藤皂苷對Bel-7402中凋亡蛋白的影響;B.α-常春藤皂苷對HepG2中凋亡蛋白的影響。CPT為陽性對照。①與α-常春藤皂苷濃度為0組比較,t=-0.880 0～0.123 3,P<0.01。

2.2α-常春藤皂苷激活HCC細胞的p53/Noxa通路 見圖3。轉錄組學結果發現,作用于Bel-7402細胞24 h后,α-常春藤皂苷10 μmol·L-1組較對照組(s0組)上調基因365個,下調基因122個;而α-常春藤皂苷20 μmol·L-1組(s20組)和30 μmol·L-1組(s30組)分別上調基因336和2 596個,下調基因155和2 226個(圖3A)。

A.α-常春藤皂苷干預Bel-7402細胞差異基因的韋恩圖;B、C.α-常春藤皂苷干預Bel-7402細胞差異基因的熱圖;D.α-常春藤皂苷干預Bel-7402細胞差異基因的信號通路圖;E.KEGG分析Noxa與凋亡、p53信號的相關性。s0:空白對照組;s10.α-常春藤皂苷10 μmol·L-1組;s20.α-常春藤皂苷20 μmol·L-1組;s30.α-常春藤皂苷30 μmol·L-1組。

A.α-常春藤皂苷對Bel-7402細胞p53/Noxa通路蛋白表達的影響;B.α-常春藤皂苷對HepG2細胞p53/Noxa通路蛋白表達的影響。①與α-常春藤皂苷濃度為0 μmol·L-1時比較,t=-1.313～0.21,P<0.01。

α-常春藤皂苷30 μmol·L-1組與對照組(Control)熱圖比較,差異顯著(圖3B),顯示Bax、PMIAP1(Noxa)、Cytc和TP53(p53)表達上調(圖3C)。將158個差異基因在京都基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)和基因本體(Gene Ontology,GO)數據庫進行功能富集分析,發現p53為重要信號之一(圖3D)。α-常春藤皂苷還可上調HCC類固醇/萜類骨架生物合成信號(圖3B)。通過癌癥基因組圖譜(the cancer genome atlas,TCGA)數據庫基因集富集分析(gene set enrichment analysis,GSEA)檢測發現p53信號與Noxa mRNA水平關系密切,提示與促凋亡正相關(圖3E)。WB結果也發現α-常春藤皂苷增加了p-p53、Noxa、Bax和Cytc蛋白的表達,下調了Bcl-2蛋白的表達,與轉錄組學結果近似,提示α-常春藤皂苷增加了Noxa表達,并可提高p53活性(圖4)。

2.3Noxa/p53是α-常春藤皂苷誘導HCC細胞凋亡的重要信號 以siRNA敲低p53和Noxa,siRNA-Noxa可減少Noxa的mRNA和蛋白表達(圖5A和5B);siRNA-p53可減少p53的mRNA和蛋白表達(圖5C和5D),提示α-常春藤皂苷可激活p53/Noxa信號。α-常春藤皂苷可逆轉siRNA-Noxa和siRNA-p53所致的低凋亡率(圖6)。

A.Noxa siRNA轉染的HCC細胞中Noxa mRNA和蛋白的表達;B.α-常春藤皂苷對Noxa siRNA轉染的HCC細胞中p53/Noxa蛋白表達的影響;C.p53 siRNA轉染的HCC細胞中Noxa mRNA和蛋白的表達;D.α-常春藤皂苷對p53 siRNA轉染的HCC細胞中p53/Noxa蛋白表達的影響。siRNA/NC表示轉染空白質粒。①與siRNA/NC比較,t=-0.050 0～0.206 7,P<0.05;②與siRNA/NC比較,t=-1.463～1.237,P<0.01。

2.4α-常春藤皂苷增加HCC細胞中p53/Noxa蛋白穩定性 CHX干預結果提示,p53和Noxa蛋白水平呈時間依賴性下降,給予α-常春藤皂苷后,p53和Noxa蛋白降解延遲(圖7)。

2.5α-常春藤皂苷抑制體內移植瘤的生長 與模型組比較,α-常春藤皂苷可抑制肝癌體內移植瘤生長,該結果與體外細胞抑制結果相符(圖8)。

圖8 α-常春藤皂苷對肝癌體內移植瘤的抑制作用

3 討論

HCC是預后差的惡性腫瘤[13-14]。近年來,中藥抗肝癌研究日益引起研究者的興趣[15-16]。α-常春藤皂苷是武當特色中藥預知子的活性成分和《中華人民共和國藥典》規定的預知子質量標志物,具有抗病毒、抗炎和抗腫瘤作用[17-19]。但α-常春藤皂苷是否通過Bcl-2相關的信號p53/Noxa發揮作用尚不明確。本研究中,α-常春藤皂苷可呈時間和劑量依賴性地降低HCC細胞存活率,增加凋亡級聯反應蛋白活化,提示發生了凋亡。

轉錄組學結果發現,α-常春藤皂苷干預后肝癌細胞Bax/Bcl-2、PMIAP1(Noxa)、Cytc和TP53(p53)表達增加[20]。KEGG分析發現Noxa與p53相關的凋亡信號密切相關。WB和RNA干擾結果也發現,α-常春藤皂苷干預后肝癌細胞p53/Noxa信號激活。由于Noxa屬于僅含有BH3的Bcl-2家族蛋白,包括了啟動區-155到-174位的p53潛在識別序列[21],本研究通過α-常春藤皂苷誘導肝癌細胞凋亡,進一步證實了激活p53/Noxa與凋亡的關系(圖9)[22]。前人文獻發現α-常春藤皂苷與人類組織細胞淋巴瘤U973和人急性單細胞性白血病細胞THP-1的膜膽固醇存在相互作用而導致孔隙形成[4]。筆者的研究也發現,α-常春藤皂苷可上調肝癌細胞類固醇/萜類骨架生物合成信號,與前人研究結果近似,值得進一步探討。

圖9 α-常春藤皂苷誘導肝癌細胞凋亡機制示意圖

p53激活凋亡通路與其磷酸化[23-24]和轉錄后泛素化降解程度[25]相關。筆者在本研究中發現,α-常春藤皂苷可上調p53磷酸化蛋白表達,并逆轉敲低p53/Noxa信號引起的凋亡減少,且阻礙了p53/Noxa蛋白降解,提示α-常春藤皂苷是通過上調p53/Noxa信號、穩定p53/Noxa蛋白水平[25-27]而發揮誘導凋亡作用。值得注意的是,由圖4A結果可見,α-常春藤皂苷干預后,p53總蛋白無變化,但由于磷酸化水平(p-p53)升高,故p-p53/p53比值增加,提示α-常春藤皂苷干預可增加p53活性。但同樣給予30 μmol·L-1α-常春藤皂苷,圖5與圖4相比,p53蛋白總量增高,這可能由于RNA干擾實驗中加入了空白質粒(siRNA/NC)的干擾或實驗條件改變所致。

此外,p53存在野生型和突變型。野生型主要功能是維持細胞基因組穩定性,負調節細胞生長和誘導凋亡,而突變型則刺激和促進腫瘤發生。在人類腫瘤中,p53突變型至少占50%。在肝癌中,p53外顯子7的突變概率是8.4%。超過36%的突變在249位密碼子第3堿基[28]。人肝癌細胞系常用于體內外肝細胞癌的研究。本研究中使用的細胞系為Bel-7402[29]和HepG2[30-31],其p53基因均為野生型,因此在本研究中適用。

關于α-常春藤皂苷體外濃度問題,文獻報道α-常春藤皂苷對HepG2、SMMC-7721和Huh-7肝癌細胞的半數抑制濃度(IC50)折算成摩爾濃度分別為18.5～103.35、17.72～123.84和21.89 μmol·L-1[5,31],使用CD147抗體和殼聚糖納米粒(α-Hed-CS-CD147-NPs)可提高抑制率而降低IC50值(對HepG2細胞由103.35 μmol·L-1降至42.19 μmol·L-1;對SMMC-7721細胞由123.84 μmol·L-1降至43.52 μmol·L-1)[31]。另有文獻報道,α-常春藤皂苷抑制HepG2和Hcclm3遷移和侵襲的濃度為5 μmol·L-1(非細胞毒性濃度),α-常春藤皂苷體內劑量為5 mg·kg-1[10]。本研究中,筆者發現10～30 μmol·L-1α-常春藤皂苷可誘導肝癌細胞凋亡,體內則為劑量10 mg·kg-1,與文獻結果類似。

綜上所述,α-常春藤皂苷通過激活和穩定p53/Noxa信號而誘導肝癌細胞凋亡,其機制值得深入探討(圖9)。