代謝組學在眼部疾病中的研究進展

蔣佳璇,劉俊鵬,歐陽珺雯,張成曉,胡 凱

0 引言

生物過程涉及基因、RNA、蛋白質和代謝物之間的相互作用,而環境因素可以在各個層面改變生物過程,這些復雜的相互作用共同塑造了疾病的表型[1](圖1A)?！敖M學”是一種高通量分析生物過程的方法[2],可在各個層面追蹤生物過程的變化(圖1A)?！按x組學”是最新發展的組學技術,針對樣本中的代謝物進行的高通量識別和定量。代謝物是質量在50-1 500Da的小分子,是代謝過程的產物或底物,包括氨基酸、糖類、脂質、有機酸等[3]。代謝組學根據檢測的范圍分為非靶向和靶向代謝組學[2]:非靶向代謝組學旨在全面檢測樣品中盡可能多的代謝物,主要用于生物標志物的探索和發現;靶向代謝組學專注于具有相似功能或參與相同代謝途徑的特定代謝物,主要用于驗證非靶向研究的結果,或作為生物途徑的驗證工具。代謝組學主要使用核磁共振(NMR)光譜和質譜(MS)技術[4],常見的樣本來源包括血液、血清、血漿、尿液、腦脊液、實體組織和細胞等[5]。眼部疾病通常是復雜的多因素疾病,而由于血-房水屏障和血-視網膜屏障,眼部自身代謝組受全身環境的影響較小,因此是理想的代謝組學分析器官。眼部可用于分析的樣本包括角膜、晶狀體、視網膜、淚腺、眼瞼、玻璃體、房水和淚液等[6](圖1B)。其中,玻璃體是最常用的眼部組織之一,因其在手術中易于獲得,且解剖結構靠近視網膜。此外,血漿或血清代謝組學也用于研究血-視網膜屏障受損或與全身相關的眼部疾病。代謝組學已在眼部疾病中得到廣泛應用,Luo[7]綜述了眼基質中代謝組學的樣本處理方法、研究進展和生物標志物,本文在其基礎上系統性地匯總了代謝組學在糖尿病視網膜病變(diabetic retinopathy,DR)、年齡相關性黃斑變性(age-related macular degeneration,ARMD)、青光眼和干眼(dry eye syndrome,DES)中的研究成果,總結了最新研究進展中的潛在生物標志物和代謝途徑,并對代謝組學在眼部疾病中未來的發展和應用進行了展望。

圖1 生物過程中的組學層次及眼部代謝組學的樣本 A:代謝組是基因組轉錄、翻譯及其與環境因素相互作用的下游;B:眼部的各部分實體組織和液體均可作為代謝組學的檢測樣本。

1 代謝組學在DR中的研究進展

DR是糖尿病最常見的微血管并發癥之一[8]。早期DR的特征包括微動脈瘤、視網膜出血和硬性滲出物,稱為非增殖性糖尿病視網膜病變(non proliferative diabetic retinapathy,NPDR);晚期DR以新血管形成為特征,稱為增殖性糖尿病視網膜病變(prolifertive diabetic retinapathy,PDR)。代謝組學的應用可以識別DR中的代謝物紊亂,分析DR的診斷、分型和預后的生物標志物,找到個性化治療的靶向代謝物。

多項研究已表明,糖代謝紊亂在DR中起到了關鍵作用。Barba等[9]發現PDR患者的玻璃體中葡萄糖、乳酸鹽和乙酸升高,而半乳糖醇和抗壞血酸降低。Haines等[10]發現PDR患者的玻璃體中糖酵解的下游產物減少,磷酸戊糖途徑產物增加,與氧化應激下的變化相同。Chen等[11]發現血漿中11種代謝物與DR相關,其中2-脫氧核糖、3,4-二羥基丁酸、赤蘚糖醇、葡萄糖酸和核糖濃度升高,而麥芽糖濃度下降;葡萄糖酸在非糖尿病個體、無DR的糖尿病患者、DR患者的血漿中逐步增加,是DR風險預測的潛在標志代謝物。

嘌呤和嘧啶代謝物也被認為是DR潛在的生物標志物。Xia等[12-13]發現DR患者的血漿中四種嘌呤(腺苷、肌苷、尿酸和黃嘌呤)和三種嘧啶(胞苷、胞嘧啶和胸苷)濃度升高。Chen等[11]也發現,胞嘧啶、胸腺嘧啶和胞苷濃度的增加與DR相關,其中胞苷的曲線下面積、敏感性和特異性最高,提示胞苷可能是DR的潛在生物標志物。

脂代謝相關研究表明,脂代謝在DR的疾病進展中也發揮了重要作用,與炎癥穩態失衡和血管生成有關。Schwartzman等[14]發現DR患者的玻璃體中花生四烯酸衍生的5-羥基二十碳四烯酸(5-HETE)的濃度增加,而抗炎性的環氧二十碳三烯酸(EET)濃度降低,提示5-脂氧合酶(5-LOX)通路參與了DR中炎癥的啟動和放大。與此一致,Al-Shabrawey等[15]報道PDR患者的玻璃體中5-HETE、12-HETE和15-HETE的濃度增加,這些HETEs與氧誘導缺血性視網膜病變(OIR)小鼠模型中視網膜新生血管的形成相關。此外,Lin等[16]發現脂氧合酶(LOX)和細胞色素P450(CYP)催化的氧化脂質(oxylipins)在PDR患者的玻璃體中發生顯著變化,5-HETE、12-HETE、20-HETE、20-羧基花生四烯酸(20-COOH-AA)水平升高。Zhao等[17]的最新研究也發現PDR患者的玻璃體中參與LOX和CYP通路的氧化脂質受影響最大,進一步反映了PDR中炎癥失衡的情況。Wang等[18]的最新研究則通過靶向和非靶向代謝組學的結合,發現PDR期患者血清中去氧膽酸和二十碳五烯酸(EPA)水平顯著低于NPDR期,可作為DR疾病進展的代謝標志物。

隨著代謝組學研究的進展,精氨酸代謝和尿素循環途徑在DR中也受到了關注。Paris等[19]發現PDR患者的血漿中精氨酸及其相關代謝產物(瓜氨酸、鳥氨酸、脯氨酸)濃度增加,類似的趨勢也在OIR小鼠模型中得到驗證。Sumarriva等[20]和Peters等[21]的最新研究也發現DR患者的血漿中精氨酸和瓜氨酸水平升高,與玻璃體中精氨酸和瓜氨酸水平升高相對應。而Tomita等[22]則報道PDR患者的玻璃體中精氨酸下游的肌酸水平以及與肌酸相關的通路下調,在小鼠OIR模型中,口服肌酸抑制了新生血管形成,提示補充肌酸可作為DR的治療以及預防方法[23]。

氨基酸和其他代謝物質在DR中的變化也受到了最新的關注。Rhee等[24]發現DR患者血漿中谷氨酰胺升高、谷氨酸降低,二者及二者的比值可作為血漿中預測DR預后的生物標志物。Jin等[25]發現DR患者房水中乳酸、琥珀酸、抗壞血酸和甲酸減少,天冬酰胺、異亮氨酸、二甲胺(DMA)增加。其中DMA是不對稱二甲基精氨酸(ADMA)的代謝物,通過引起NOS解耦聯來促進氧化應激,DR中DMA的升高與氧化應激和內皮功能障礙有關。高血糖誘導的氧化應激狀態促進了NADPH向NADH的轉換,提高了NADH/NAD比例,使TCA循環減少、分解降低,增加了天冬酰胺和谷氨酰胺的濃度,在Ding等[26]對DR患者血漿的最新代謝組學研究中也得到了驗證。Wang等[27]的最新研究則進一步提出了芳香族氨基酸代謝途徑在DR患者玻璃體中的失調。

代謝組學已在DR中較為廣泛的應用,可以鑒別DR疾病過程中發生變化的各個代謝過程和代謝物,提示DR預測、分層和預后的生物標志物,對發現DR預防和個性化治療的潛在靶代謝物具有重要意義。

2 代謝組學在ARMD中的研究進展

ARMD是發達國家老年人失明的主要原因之一[28]。ARMD的特征包括光感受器和視網膜色素上皮的進行性退化,可分為新生血管型(濕性)ARMD和萎縮型(干性)ARMD。房水是ARMD代謝組學研究的主要樣本,通過代謝組學可以深入了解ARMD的發病機制,為治療ARMD提供新的方向。

能量相關的糖代謝異常是濕性ARMD的主要發病因素之一[29]。Han等[30]對ARMD患者房水中的葡萄糖代謝進行了靶向代謝組學研究,發現枸櫞酸和異檸檬酸升高,琥珀酸和α-酮戊二酸降低,提示糖代謝異常。進一步的非靶向代謝組學分析發現[31],濕性ARMD患者的房水中有18種代謝物明顯改變,涉及氨基酸代謝、糖代謝、肉堿代謝、肌酸代謝等途徑,提示了ARMD中代謝紊亂的全貌。Liu等[32]對ARMD與白內障患者的血清進行代謝組學研究發現,ARMD與磷酸戊糖途徑和線粒體電子傳遞鏈有關。

楊瀾在訪談中提起了這段經歷，她小心翼翼地問鞏俐，經歷了那樣悲痛的事情，回來后又要立刻拍戲，會不會有種被撕裂的感覺。鞏俐很堅定地說：“你拍完戲以后，回家想怎么去祭奠去哭，那是你自己的事情，但是你在有那么多人一起陪你的時候，不可以把自己的情緒帶給別人?！?/p>

脂質代謝途徑也參與了ARMD的發生,尤其是脂質氧化產生的氧化應激增加[33]。Laíns等[34]分析ARMD患者和對照組血漿的代謝組學發現,最顯著的差異出現在脂質譜,其次是氨基酸和核苷酸譜。兩組間有87種代謝物差異顯著,其中大多數的代謝物(82.8%)參與了甘油磷脂代謝,支持了脂質代謝紊亂在ARMD發病機制中的重要作用[29]。在ARMD的早期、中期和晚期,甘油磷脂的水平也有顯著不同,甘油磷脂的改變可能與ARMD中氧化應激的激活有關[35]。肉堿是一種促進脂肪酸進入線粒體氧化的二肽。Chao de la Barca等[36]和Mitchell等[37-38]發現,在ARMD患者的血液樣本中長鏈?；鈮A升高,證實了ARMD中肉堿穿梭途徑的改變,提示ARMD中線粒體脂肪酸代謝發生障礙。Deng等[39]通過非靶向代謝組學在濕性ARMD患者血漿中發現了17種差異代謝物,其中大部分是參與ARA代謝的氧化脂質。Acar等[40]通過對2 267例ARMD患者和4 266例對照組血清樣本的大型代謝組學分析,確定了60種與ARMD相關的代謝物,其中高密度脂蛋白(high density lipoprotein,HDL)水平升高,極低密度脂蛋白(very low density lipoprotein,VLDL)水平降低。

氨基酸代謝紊亂也與ARMD的發病機制相關。Osborn等[41]使用非靶向代謝組學在濕性ARMD患者的血漿中發現天冬氨酸、谷氨酰胺和苯丙氨酸水平降低、酪氨酸水平升高,提示ARMD中酪氨酸和尿素代謝失調。Luo等[42]也報道了ARMD患者血漿中氨基酸的代謝紊亂,包括N-乙酰-L-丙氨酸、L-酪氨酸、L-苯丙氨酸、L-蛋氨酸、L-精氨酸等。此外,Han等[30-31]的最新研究報道了在ARMD患者房水中谷氨酰胺降低、谷氨酸升高;Lains等[34]報道了ARMD患者和對照組之間以及ARMD各階段的患者之間血漿中的谷氨酸和谷氨酰胺水平顯著變化,提示了ARMD中神經遞質的供應障礙,對視網膜和視覺通路至關重要,該團隊的最新研究發現ARMD患者的血漿代謝組學特征與ARMD 3a臨床進展和功能改變相關[43]。Mendez等[44]的最新研究發現ARMD患者血漿中與谷氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸代謝相關的氨基酸與桿截距時間(RIT)和暗適應曲線下面積相關,表明氧化應激和線粒體功能障礙可能在ARMD和視力障礙中起作用。

代謝組學在ARMD中的應用正在快速發展,將代謝組學鑒別出的差異代謝物與ARMD已知的生物標志物相結合,可以優化ARMD進展的預測模型、制定個性化的預防策略和靶向治療方法。

3 代謝組學在青光眼中的研究進展

青光眼(glaucoma)是全球最常見的不可逆性失明病因。青光眼的主要機制是眼內壓(IOP)升高,導致視網膜神經節細胞受損,引發不可逆的視神經損傷。原發性開角型青光眼(primary open angle glaucoma,POAG)是研究最廣泛的亞型,而原發性閉角型青光眼(primary angle-closure glaucoma,PACG)和原發性剝脫性青光眼(PEXG)仍缺乏大規模的組學研究[45]。

現有研究顯示,青光眼發病與糖代謝的改變有關。Agudo-Barriuso等[46]研究發現,眶內視神經擠壓后的大鼠視網膜中,損傷后第14d TCA循環的中間產物減少,而與滲透應激(亞?；撬?、尿素、山梨醇、肌醇和赤蘚糖醇)、氧化應激(抗壞血酸、麥角硫因、半胱氨酸-谷胱甘肽二硫化物)和葡萄糖代謝(果糖、葡萄糖、葡萄糖-6-磷酸、麥芽糖)相關的代謝物增加。Mayordomo-Febrer等[47]對注射透明質酸鈉的青光眼模型大鼠進行研究發現,青光眼模型眼中的葡萄糖水平降低。作者認為葡萄糖水平降低反映了前房能量供應減少,進而影響了小梁網的流出,而IOP的升高又進一步導致進入毛細血管內的ATP減少。Pan等[48]對POAG和白內障患者的房水樣本進行非靶向代謝組學檢測,發現了18種差異代謝物,涉及碳水化合物、?；鈮A、磷脂酰膽堿、氨基酸和多胺家族等,其中潛在的生物標志物包括2-巰基乙烷磺酸、d-赤蘚內酯、脫氫抗壞血酸、半乳糖、甘露糖、壬二酸和利糖醇。

此外,脂質代謝紊亂在青光眼的病理生理過程中也起到重要作用。在眶內視神經擠壓后的大鼠視網膜中,鞘氨醇和磷酸膽堿水平增加[46]。Buisset等[49]在POAG患者的房水中發現7種磷脂酰膽堿、1種溶血磷脂酰膽堿、1種鞘磷脂的升高,提示磷脂代謝可能是開發神經保護療法的關鍵。Mayordomo-Febrer等[47]發現青光眼模型大鼠的房水中VLDL顯著上升,VLDL可以促進纖維連接蛋白、層黏連蛋白和IV型膠原蛋白的表達,從而減少細胞對小梁網基底膜的黏附。Burgess等[50]在POAG患者的血漿中檢測到棕櫚酰肉堿、鞘脂、維生素D相關化合物和類固醇前體的代謝過程上升,其中棕櫚酰肉堿的增加反映了線粒體脂肪酸代謝失調。Nusinovici等[51]的最新研究調查了POAG患者血液中的脂質代謝物,研究表明總HDL3-膽固醇水平的升高與POAG發生率的降低顯著相關,支持了膽固醇轉運紊亂在POAG發病機制中的作用。

關于氨基酸和多胺家族的研究也揭示了青光眼的代謝特征。Buisset等[49]在POAG患者的房水中發現谷氨酰胺、甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、羥脯氨酸、乙酰鳥氨酸含量升高,精胺、亞精胺、?；撬崴较陆?。Leruez等[52]對POAG患者血漿的檢測也發現了精胺和亞精胺水平的降低。?；撬?、精胺、亞精胺均參與保護視網膜神經節細胞;精胺和亞精胺的降低導致線粒體膜電位調節受損,提示青光眼中發生視神經元受損和氧化應激。Kouassi Nzoughet等[53]在POAG患者的血漿中發現9種濃度增加的代謝物,其中煙酰胺、N-乙?；?L-亮氨酸和精氨酸最為顯著,與青光眼發病機制中線粒體損傷的假說一致。Javadiyan等[54]發現晚期青光眼患者的血清中ADMA和對稱二甲基精氨酸(SDMA)升高。ADMA是一氧化氮合酶抑制劑,SDMA則與精氨酸競爭攝取,此項研究結果支持了一氧化氮調節途徑作為青光眼的治療靶點[55]。Tang等[56]的最新研究調查了POAG患者房水和血漿中的代謝組學特征,房水中的環AMP、2-甲基苯甲酸、3’-唾液酸乳糖和血漿中的N-乳酰苯丙氨酸(N-lac-phe)是POAG的潛在生物標志物,此外POAG的代謝特征還指向嘌呤代謝途徑的改變。

在PACG相關的研究中,Rong等[57]在PACG患者的血清樣本中發現了長鏈不飽和脂肪酸譜的顯著變化:棕櫚油酸和γ-亞麻酸增加,其中γ-亞麻酸水平與眼壓呈正相關;亞油酸和花生四烯酸減少,與眼壓呈負相關。該研究表明長鏈不飽和脂肪酸是與PACG相關的重要代謝產物,對PACG的篩查具有潛在的臨床意義。黃悅等[58]總結了基因組學、轉錄組學、蛋白組學、代謝組學以及脂質組學對PEXG生物標志物的研究進展,目前關于PEXG代謝改變的研究相對較少,應有更多的研究來完善PEXG的代謝生物標志物。

綜上,糖代謝紊亂、脂代謝紊亂和其他代謝紊亂在青光眼的疾病發生中均發揮了作用,針對各種代謝損傷的潛在治療靶點也已被提出。需要更多的研究來驗證各型青光眼中獨特的代謝失調,尋找新的生物標志物和治療機會。

4 代謝組學在DES中的研究進展

DES已成為一個日益嚴重的公共衛生問題,全球患病率高,對其致病機制的了解仍有待深入[59]。DES是一種由淚膜不穩定、眼表高滲狀態、眼表損傷和神經感覺異常等多種因素導致的眼表疾病[60]。分析和識別DES的代謝標志物,可為DES的診斷和治療提供新的途徑。

目前已有多項研究表明脂質代謝紊亂是DES的顯著特征之一。Lam等[61]發現淚液中膽固醇硫酸鹽和糖鞘脂的水平與淚液的生理分泌量呈正相關,而低分子量蠟酯和含有飽和脂肪?；糠值南烏ヅcDES發生呈負相關,提示淚液中脂質成分的改變可作為評估DES的指標。激素作為脂質組的重要組成部分之一,在DES中的作用也備受關注。Pieragostino等[62]發現,DES女性患者的淚液中皮質醇、4-雄烯-3,17-二酮和17-α-羥孕酮水平降低。這三種類固醇的聯合測定顯示出良好的診斷能力,提示淚液類固醇有望成為在DES診斷的潛在指標。Vehof等[63]發現DES患者的血清雄激素水平降低,其中硫酸雄酮、硫酸表雄酮與DES的相關性最強。雄激素缺乏在DES的病理過程中起到作用,并有望成為生物標志物[64],已經進行的臨床試驗證實雄激素可以緩解DES相關癥狀并增加淚液分泌,支持了雄激素治療DES的潛力[65]。

除脂質代謝外,DES的其他代謝特征也得到了廣泛的研究。Galbis-Estrada等[66]分析了DES患者的反射性淚液的代謝組學變化,發現膽固醇、N-乙酰氨基葡萄糖、谷氨酸、肌酸、氨基正丁酸、膽堿、乙酰膽堿、精氨酸、磷酸乙醇胺、葡萄糖和苯丙氨酸等代謝物水平均有不同程度的變化,這些代謝物的改變有助于區分DES的不同亞型,推進對發病機制的了解和治療方法的改進。Lee等[67]使用1H-NMR測定了大鼠干眼模型中血漿和尿液的內源性代謝物。對照組和DES組大鼠之間的血漿代謝物變化未達到統計學的顯著意義;尿液中的苯丙氨酸、苯乙酸鹽、泛酸酯、甘氨酸、琥珀酸鹽、甲醇、纈氨酸、丙二醇、組氨酸、蘇氨酸、乳酸和乙酸鹽則存在顯著差異。Chen等[68]通過蛋白質組學和代謝組學綜合分析確定了在DES患者淚液中顯著表達的190種蛋白質和34種代謝物,主要與免疫和炎癥途徑相關,糖酵解、糖異生和氨基酸代謝途徑也參與了DES的疾病進展。Chen等[69]的最新研究中,通過基質輔助激光解吸電離質譜成像(MALDI-MSI)測定了大鼠特定眼部區域(中央角膜、周圍角膜、穹窿結膜、眼瞼結膜和房水)的代謝物,綜合通路分析表明在大鼠干眼組織的特定區域,甘油磷脂、鞘脂苯丙氨酸、甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸等代謝途徑發生了顯著改變,提示了具有時空特征的代謝途徑參與DES的過程,是代謝組學探究DES疾病進展的新方向。

綜上,代謝組學在DES中的研究拓展了目前對DES代謝標志物的認識,為DES的治療提供了新的潛在靶點。代謝組學在DES疾病中仍有較大的研究空間,以淚液為檢測樣本的代謝組學研究,因其非侵入的采集過程,可用于大規模的臨床研究,是DES和其他眼表疾病代謝組學研究的新方向。

5 總結和展望

代謝組學在眼部疾病的研究中顯現出巨大的潛力,為深入了解正常眼部組織的代謝以及各種疾病的發病機制提供了新的途徑。目前,已發表的關于這四種眼部疾病代謝組學的各自研究已經很多了,本文主要對各疾病已有的重大研究進展按代謝途徑進行了梳理,為廣大臨床和科研工作者提供代謝組學在眼部疾病中的研究背景和研究思路,其具體的發病機制和詳盡的生物標志物,需要聚焦在各個疾病進行更系統的綜述(表1)。

表1 近3 a代謝組學在四種眼部疾病中的代表性研究匯總

同時,代謝組學的廣泛應用還存在一些限制和挑戰:(1)盡管眼睛是代謝組學研究的理想器官,但樣本的獲取并不容易。采集眼部組織樣本通常需要侵入性手術,而對照樣本通常只能從接受眼部手術的患者獲得,限制了臨床代謝組學研究的樣本數量。(2)眼部疾病具有很大的異質性,地域、種族等因素對代謝組學研究結果的解釋和推廣影響很大;代謝組學涉及多種技術平臺和數據處理方法,需要更多的標準化工作以確保分析結果的一致性和可比性。(3)代謝組學分析產生大量的數據,而代謝物參與的代謝途徑復雜多樣,因此確定代謝物變化對特定途徑的影響,以及解釋這些變化的生物學意義也是巨大的挑戰。

充分發揮代謝組學在眼部疾病研究中的潛力,需要更多的樣本、更長的隨訪時間,以及更加嚴謹的驗證。同時,多組學整合是一個重要的方向,通過整合代謝組學、基因組學、表觀基因組學、轉錄組學和蛋白質組學等多個層次的數據,可以提供更全面的信息,以加深對生物過程的理解。

代謝組學在眼部疾病的生物標志物鑒定、疾病預測和早期診斷、預防策略測定和治療靶點的確定等方面具有廣闊的應用前景。眼科學領域的代謝組學研究目前仍處于相對初期階段,但有望成為未來眼部疾病研究和治療的有力工具。