補體蛋白調控靶點在糖尿病視網膜病變中的作用及臨床研究進展

王緒瑞,孫洪巖,2,劉 丹,楊明明,2

0 引言

糖尿病是一組以高血糖為特征的代謝性疾病,近年來,世界范圍內糖尿病患病率不斷增加,造成嚴重的社會負擔。糖尿病可引起大血管、微血管的多種并發癥,如代謝性白內障、動眼神經損傷、眼部炎癥、屈光不正等,其中,糖尿病視網膜病變(diabetic retinopathy,DR)被認為是最常見和損害性最嚴重的眼部并發癥,且影響人群廣泛,治療預后較差,是目前眼科領域研究的重點及熱點話題。DR的發病機制錯綜復雜,目前認為,長期暴露于高血糖和其他致病危險因素(如高血壓等)啟動了眼內的一系列生理和生化變化包括氧化應激、蛋白激酶C(PKC)的活化、炎癥反應、多元醇代謝通路的異常等,并最終導致微血管損傷和視網膜功能障礙[1-2]。近年來有越來越多的證據表明,DR中的視網膜微血管損傷與補體系統激活密切相關[3]。視網膜是一種免疫豁免組織,有其獨特的免疫系統,包括血-視網膜屏障(blood-retinal barrier,BRB)、先天免疫細胞(如小膠質細胞群等)和補體系統[4]。在衰老時,天然免疫機制(特別是補體系統)低水平激活,從而維持正常的眼穩態和視網膜完整性[5-6]。然而,如果補體持續激活的時間較長,就會導致不可逆轉的功能喪失,從而產生有害的影響。因此,本文從多種補體蛋白探討補體系統在DR發生發展中的作用。

1 補體系統

補體系統廣泛存在于人體血清、組織液和細胞膜表面,被熟知的組分包括30余種,是一個具有精密調控機制的、具有免疫效應放大的先天蛋白質反應系統。通常,多數補體成分在血漿中是無活性的前體物質(酶原),只有在被激活物激活后才具有其特殊的生物學功能。許多內源性或外源性物質(包括抗原-抗體復合物、多種微生物成分等)可通過三條既獨立又交叉的途徑,通過一系列級聯酶解反應,進而激活補體系統,三條途徑即經典途徑、旁路途徑和凝集素途徑(MBL途徑)(圖1)。所有這三條途徑所形成的活化產物具有調理吞噬異物、調節免疫應答、介導炎癥反應、清除免疫復合物和溶解細胞等功能。

圖1 補體系統激活的三條通路。

1.1經典途徑激活物首先與C1q結合,順序活化C1r、C1s、C4、C2、C3等多種補體蛋白,形成C3轉化酶(C4b2a)與C5轉化酶(C4b2a3b)的級聯酶促反應過程。C5可被裂解為C5b,在后續的級聯反應中與C6、C7、C8、C9相繼結合,最終形成攻膜復合物(membrane attack complex,MAC)。經典途徑的補體激活在多種眼科疾病中已被證實發揮重要作用,包括青光眼、年齡相關性黃斑變性(age-related macular degeneration,ARMD)、自身免疫性葡萄膜炎等,特別是本文著重論述的DR[7-9]。

1.2旁路途徑旁路途徑又稱替代激活途徑,一般是由微生物或外源異物直接激活,而不依賴于機體抗體的形成,在B因子(CFB)、D因子(CFD)和備解素P因子(CFP)等多種重要因子的參與下,多種補體蛋白形成旁路途徑的C3、C5轉化酶,進而啟動級聯酶促反應過程。旁路途徑雖然被發現較晚,但其在補體系統中具有重要地位,是目前研究的熱點話題。我們團隊的多項研究發現其與前葡萄膜炎、DR等息息相關[10-14]。

1.3凝集素途徑凝集素途徑又稱MBL途徑(MBL pathway),與經典/旁路途徑不同的是,病原體表面糖結構被血漿中的甘露糖結合凝集素(mannose-binding lectin,MBL)、纖維膠原素(ficolin,FCN)等直接識別,進而活化MBL相關絲氨酸蛋白酶(MBL-associated serine protease,MASP),隨后依次活化C4、C2、C3、C5,最后進入補體激活的末端通路。MBL途徑常被研究者忽略,但其仍擁有與眾不同的作用,它的激活物質非常廣泛,并且對經典途徑和旁路途徑的活化具有交叉促進作用[15]。

綜上所述,以上三種途徑均可通過融合并刺激C3/C5轉化酶的形成,隨后共同進入末端通路,最終形成MAC。在此基礎上形成的MAC可溶解細胞或導致細胞死亡[16],因此,常常認為補體系統的激活是把雙刃劍,不適當的補體活化會導致機體損傷,從而引發多種疾病。

2 多種補體蛋白在DR中的作用

2.1全身和局部補體激活參與DR的發生人體適當的免疫反應對于消除外源性和內源性因素引起的組織損傷是必不可少的,人眼也不例外。在正常人眼中,先天免疫系統通過精密的調節,嚴格控制免疫反應以防止不可逆的組織損傷,從而維持視網膜的穩態。免疫和炎癥機制在DR發病機制中的作用一直得到許多業內人士的重視,補體系統作為先天免疫的重要組成成分,目前多項研究證明補體系統在糖尿病眼中發揮重要作用[3-4]。Gerl等[17]報道了DR患眼的Bruch膜、脈絡膜毛細血管中廣泛補體激活的證據,通過免疫組織化學檢測發現補體相關蛋白的密集染色,提示DR患眼中存在補體激活。Pauly等[18]通過對92 000個小鼠視網膜細胞進行單細胞RNA測序,發現了小鼠視網膜細胞類型的獨特補體表達信號,表明視網膜微環境中局部補體表達的調節。這提示了一個有趣的概念,即局部視網膜補體激活可能獨立于通常由肝臟產生的補體成分。此外,Mandava等[19]研究證明這種局部激活是持續的,并且與系統性補體活性分離。因此,補體系統在DR中的作用可能包括全身系統性的作用,以及局部的激活與調節。

2.2經典途徑相關調控靶點與DR C1、C4和C2是經典途徑前段重要的補體蛋白。在經典途徑中,激活物一般是抗原-抗體復合物,其首先與C1q結合,順序活化C1r、C1s、C4、C2、C3,啟動下一步的級聯反應。相關研究表明,C1、C4和C2與DR密切相關,Huang等[20]研究發現缺乏IgG外泌體的糖尿病小鼠視網膜血管損傷相對減少,在此基礎上,通過進一步C1激活實驗推測血漿中載有IgG的外泌體可能通過結合并水解激活C1復合物,進而激活經典補體途徑,最終損傷下游視網膜血管,而其中的分子機制和通路可能是未來需要研究的方向。García-Ramírez等[21]研究增殖性糖尿病視網膜病變(PDR)患者的蛋白質譜,通過采用熒光差異凝膠電泳(DIGE)進行蛋白質組學分析,發現C4b、C3等相關補體蛋白在PDR患者的玻璃體中明顯升高,該研究進一步進行蛋白免疫印跡實驗證實C3的這種差異表達,且與視網膜中檢測到的mRNA水平差異一致,說明經典途徑補體激活參與DR的發病,且可能是參與疾病的后期階段。我們團隊在前期研究中發現,DR患者血清中C4呈高表達,C4是活化的C1s的第一個底物,因此DR病理進程中可能有經典途徑補體系統的激活和補體所誘發的炎癥反應[22]。有趣的是,在另一個炎癥性疾病視神經炎中,有學者發現血清補體C3、C4水平下降[23]。此外,Pauly等[18]研究發現Müller細胞是補體激活因子C1s、C3、C4和CFB的主要貢獻者,衰老增強C1s、CFB、CFP和I因子(CFI)表達,H因子(CFH)表達降低,短暫性視網膜缺血增加小膠質細胞、Müller細胞和視網膜色素上皮(RPE)細胞中補體的表達。

2.3旁路途經相關調控靶點與DR CFB、CFH是補體旁路途徑的重要調節蛋白。CFB裂解形成的Bb可與C3b結合形成C3bBb,此為旁路途徑C3轉化酶,啟動下一步級聯反應。CFH能夠抑制旁路途徑的C3/C5轉化酶(C3bBb/C3bBb3b),發揮負性調節作用。CFI是一種絲氨酸蛋白酶,在輔助因子存在的情況下能夠抑制C4b2a、C4b2a3b、C3bBb、C3bBb3b的形成與活性,抑制補體級聯反應。近年,CFB和CFH的基因多態性與DR的關系越來越成為眼科醫生的研究熱點。García-Ramírez等[21]通過檢測PDR患者玻璃體液中的CFB,證實了旁路途徑的參與。Toni等[24]發現rs1410996(CFH)多態性可能與1型糖尿病患者的PDR相關。我們團隊在一項研究中分析DR和糖尿病對照組CFB和CFH基因多態性的關系,結果顯示,與糖尿病對照組相比,DR患者的rs1048709(CFB)A等位基因和AA基因型頻率顯著升高;而rs800292(CFH)A等位基因和AA基因型頻率顯著降低,且rs800292/AA基因型與DR的延遲進展有關[14],因此認為CFH可能是DR的一個保護性因素。無獨有偶,另一項研究中rs800292(CFH)的AG基因型被認為可能是ARMD的保護因素[25]。關于眼內CFH的來源,有學者認為,DR中CFH來源于激活的小膠質細胞,DR患者眼內液中檢測到CFH水平的升高可能是作為抑制補體過度激活的反饋機制[26],基于此,深入靶向小膠質細胞介導的補體激活的研究可能為靶向治療DR提供新的思路。盡管CFI與DR發病之間的聯系尚未完全明確,但編碼CFI的基因突變與患ARMD的風險增加之間的關系已得到證實[27]。另有研究表明CFI參與急性前葡萄膜炎的發病過程[10]。因此,CFI與DR之間的關系值得進行更深入的研究。

2.4MBL途徑相關靶點與DR 血漿中的MBL可特異性識別表面糖結構是甘露糖、甘露糖胺等為末端糖基的多種病原體,然后活化MASP,啟動下一步級聯反應。一般情況下,MBL不與機體自身組織結合,但在糖尿病或組織缺血等情況下,細胞表面糖基化模式的改變會顯著增加MBL的自身反應性,從而導致糖尿病患者的免疫激活增加,局部和全身炎癥增加,并伴隨糖尿病晚期并發癥的風險增加。補體系統與糖尿病血管并發癥之間的聯系的潛在機制之一可能是糖尿病患者動脈壁晚期糖基化終末產物(advanced glycation end products,AGEs)的形成,這些產物為MBL的結合產生了新的結合位點[28]。在許多臨床前沿研究中,MBL途徑與糖尿病微血管和大血管改變之間的聯系已被證實。有研究分別檢測1型和2型糖尿病患者血漿MBL水平,發現其高于健康人[29-30]。另有橫斷面研究發現,DR患者MBL水平與DR嚴重程度存在正相關性,提示MBL途徑可能在DR的發病機制中發揮作用[31]。Holt等[32]隨訪研究18 a,首次發現血清中高水平MAp44(MBL途徑蛋白)與DR的發展之間存在顯著關聯,但MAp44被認為是MBL途徑的抑制劑,因此MAp44的升高可能是代償性的上調亦或是其他作用,這需要進一步探索研究。另外,該研究還發現高水平的H-ficolin與單純視網膜病變的發生相關,提示MBL途徑補體激活在DR的早期階段可能起著更為突出的作用。遺憾的是,目前關于DR患者中MBL基因和MASP基因多態性的研究仍較為空白,這值得進一步研究。

2.5核心補體蛋白C3和C5與DR C3和C5是補體活化的共同組分,C3可被C3轉化酶裂解為C3a、C3b,C3b還可以進一步裂解為C3c、C3dg、C3d等小片段,C5可被C5轉化酶裂解為C5a、C5b。C3a和C5a都游離于液相,是重要的炎癥介質,C3d可參與適應性免疫應答。已有相關研究表明,C3和C5在DR患者體內表達增加,Zhang等[33]發現DR患者血清中C3a和C5a水平高于正常人。Gao等[34]發現PDR患者玻璃體中C3等補體蛋白表達增加。另外,Muramatsu等[35]研究報告PDR患者玻璃體中檢測到C5a表達增加,并發現C5a濃度與血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、單核細胞趨化蛋白-1(monocyte chemotactic protein-1,MCP-1)等炎癥細胞因子水平顯著相關,提示C5a可能與炎癥細胞因子等協同參與病理性的血管新生,在PDR的發病機制中發揮重要作用。此外,Cheng等[36]發現,視網膜Müller細胞高表達C5aR,C5aR可與C5a結合導致白細胞介素(IL)-6和VEGF的釋放,參與DR的病理過程[36]。也有學者發現C5基因多態性與DR發生相關。我們團隊通過分析多個補體通路基因與DR發病的關聯性,首次發現rs17611(C5)與2型糖尿病患者視網膜病變之間存在弱關聯,揭示DR與C5多態性之間的關聯性,表明補體途徑與DR發病機制有關[37]。Xu等[38]發現C5基因rs2269067(C5)與2型糖尿病患者發生PDR的風險相關,且該基因型還與IL-6產生增加相關。因此,C3和C5及其相關成分可能還通過炎癥機制參與病理性的血管新生。C3、C5是補體級聯反應中的核心步驟,未來研究可進一步探討C3、C5和炎癥在DR血管新生中的具體分子機制,以及如何通過藥物或基因治療干預DR的發展。

2.6補體抑制劑CD55和CD59與DR CD55蛋白是補體通路中的一種調控蛋白,也被稱為補體衰變加速因子(DAF),其通過糖基磷脂酰肌醇(GPI)連接固定在細胞膜上,廣泛分布在不同的組織細胞表面和細胞分泌物中,CD55蛋白的主要作用是加速C3轉化酶和C5轉化酶中C2a和Bb因子的衰變解離進而抑制補體系統激活。CD59也是一種GPI錨定蛋白,大多數有核細胞的膜上都存在這種特殊蛋白,CD59能夠在補體級聯反應的末期通過競爭性結合C8上的新生表位,抑制C9與C5b678的結合,從而阻止MAC的形成。MAC可直接引起細胞裂解并刺激細胞釋放炎性細胞因子。已有多項研究表明,MAC在糖尿病患者的視網膜中沉積增加[17],MAC參與DR的發病機制肯可能是MAC沉積直接損傷視網膜細胞如周細胞[39],細胞損傷也可以促進炎癥的發生。CD55和CD59

都是補體系統的抑制劑,既往研究發現糖尿病供者的視網膜CD55和CD59水平顯著降低,表明調節機制的喪失可能是糖尿病患者視網膜補體激活增加的原因,且病程較長的糖尿病患者(9±3 a)視網膜MAC沉積增加[40]。另有研究發現一種被稱為可溶性CD59(sCD59)的MAC抑制劑能夠減輕糖尿病小鼠視網膜的損傷,該研究采用基因治療方法將腺相關病毒載體(AAV2/8-sCD59)遞送到小鼠眼部,結果發現sCD59能夠減弱視網膜血管滲漏到玻璃體,抑制視網膜血管無灌注區域的產生、視網膜神經節細胞凋亡和MAC沉積,從而發揮對視網膜的保護作用[41]。此外,該研究團隊還報道了sCD59對ARMD和自身免疫性葡萄膜炎(EAU)的作用[42-43],希望未來能應用于臨床。

3 靶向補體抑制劑的臨床應用

補體系統參與的眼科疾病眾多,針對補體系統的靶向補體藥物研究目前也在臨床中取得了重大進展,并且擁有廣闊的前景。補體C5抑制劑Eculizumab曾被研究用于ARMD的治療[44],盡管其療效不高,但其在視神經脊髓炎譜系疾病(NMOSD)的治療中是一種有效且耐受性良好的治療方法[45]。C3抑制劑Pegcetacoplan被證明可以延緩ARMD中地圖樣萎縮(GA)的進展,并且該藥的3期臨床試驗正在進行中[46-47]。此外,該藥還被應用于夜間陣發性血紅蛋白尿(PNH)的治療。另一種C5抑制劑Avacincaptad pegol(Zimura)也在ARMD的治療中取得了良好的療效[48]。此外,一款具有抑制VEGF和補體激活(C3b/C4b)雙重作用的藥物Efdamrofusp alfa被證明在體外具有良好的安全性和抗血管生成作用,并且目前也已完成用于新生血管性年齡相關性黃斑變性(neovascular age-related macular degeneration,nARMD)治療的1b期臨床試驗[49-50]。針對CFH、CFB、CFI的藥物也正在臨床研究中[51-53],我們期待有更好的成果服務眼科疾病。在其他眼科疾病中,自身免疫性葡萄膜視網膜炎[54]和青光眼[55]也在近年的臨床研究中取得了良好的效果,并且有望被列入補體靶向藥物治療的候選名單?？傊?補體靶向藥物具有廣闊的研究前景,盡管目前的藥物在眼科的應用仍著重于ARMD的治療,但隨著補體系統在各個眼科疾病的作用機制逐漸被發掘,補體靶向藥物有望應用于包括DR在內的眾多眼科疾病的治療(表1[56])。

表1 常見的應用于眼科的靶向補體藥物

4 小結與展望

DR是一種常見的嚴重危害眼健康的全球性疾病,了解其發病機制對于疾病的診斷和治療有重大意義。綜上所述,補體系統與DR的發生發展密切相關,但補體蛋白對DR的具體機制仍尚未完全闡明,期待未來相關研究能著重于各個補體蛋白在DR中的具體通路、詳細機制等,從而在此基礎上尋找更有效的治療方案。截至目前,DR的治療方案較少,包括抗VEGF藥物、激光光凝等,且有希望的新療法仍在研發中[57-58]?？紤]到DR是全身疾病糖尿病進展的一部分,控制原發病應該是DR預防和治療的重要前提。在新的治療策略中,已有學者指出,相關補體成分可靶向作為包括DR在內的視網膜疾病的合適的預測因子[59],不僅如此,針對補體系統的靶向補體藥物已在眼科其他相關疾病的治療中取得了一定成效[44-45,49-50,56],這些研究和成果也將為DR的防治提供重要的參考和借鑒。