不同纖維源對斷奶仔豬生長性能、血清生化指標、腸道通透性和糞便微生物的影響

劉 寧 劉 攀 郎育杰 盧小斌 褚瑰燕 曾祥芳 譙仕彥 蔡傳江*

(1.西北農林科技大學動物科技學院,楊凌 712100;2.中國農業大學動物科技學院,北京 100193)

斷奶仔豬的消化系統和免疫系統尚在發育之中,其消化機能和調節能力均處于較弱的階段。仔豬在斷奶前后的時期通常表現為腸道菌群紊亂以及腸道形態和腸道屏障受損,從而導致仔豬生長受阻并伴有腹瀉,嚴重時可引起死亡[1]。因此,制定有效的飼糧配方來維持斷奶仔豬腸道健康和改善生產性能是至關重要的。在傳統營養學研究中,纖維被認為是一種抗營養因子,因為其不能被內源性消化酶分解,會降低營養物質的消化率,從而影響動物的生產性能[2]。而今,越來越多的研究已經揭示纖維對動物健康的積極作用。纖維可提高動物機體的免疫防御功能,并對動物的腸道健康起著重要作用,因為它不僅改善了腸道上皮屏障功能,而且可以通過調節腸道微生物組成來維持宿主腸道菌群環境的穩態[3-4]。麥麩(wheat bran,WB)是面粉加工過程中產生的副產品,主要由阿拉伯木聚糖、纖維素和β-葡聚糖組成[5]。甜菜粕(sugar beet pulp,SBP)是甜菜在制糖過程產生的副產品,主要由纖維素、半纖維素、果膠和葡聚糖組成,且含有豐富的甜菜堿[6-7]。研究發現,WB可使斷奶仔豬的平均日增重(average daily gain,ADG)增加,腹瀉率降低,腸道屏障增強;SBP可使腸道乳酸菌相對豐度提高但對生長性能無積極作用[8]。也有報道稱,SBP可使斷奶仔豬后腸中乙酸含量產生增加[9],且SBP的量不同,對生長性能的影響亦不同[10]。目前,WB和SBP對斷奶仔豬的影響差異研究較少且尚不明確。因此,本試驗旨在研究WB和SBP這2種纖維來源對斷奶豬生長性能、血清生化指標、腸道通透性和糞便微生物的影響,以期為WB和SBP在斷奶仔豬中的應用提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗設計和試驗飼糧

試驗選取75頭28日齡平均體重為(8.25±0.83) kg、健康的三元(杜×長×大)雜交斷奶仔豬,隨機分為5個組,每組5個重復(欄),每個重復3頭豬。5個組分別飼喂基礎飼糧(CON組)、4%和8%WB替代基礎飼糧的飼糧(WB4組和WB8組)以及4%和8%SBP替代基礎飼糧的飼糧(SBP4組和SBP8組)。試驗飼糧參照NRC(2012)豬營養需要標準進行配制,其組成及營養水平見表1。試驗期28 d,分為第1～14天和第15～28天2個階段。

表1 試驗飼糧組成及營養水平(風干基礎)

1.2 飼養管理

試驗在西北農林科技大學畜禽生態養殖場進行,采用全進全出制飼養管理模式,全漏縫地面飼養。每個圈舍均配有1個乳頭式飲水器和1個3孔不銹鋼可調節自動料槽,保證試驗豬自由采食和飲水。每天打掃圈舍,保持豬舍干燥、通風,記錄豬只健康狀況。

1.3 測定指標及方法

1.3.1 營養物質含量測定

飼糧中粗蛋白質、粗脂肪、粗灰分、中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維、鈣和總磷含量分別參考GB/T 6432—2018、GB/T 6433—2006、GB/T 6438—2007、GB/T 20806—2022、NY/T 1459—2022、GB/T 6436—2018和GB/T 6437—2018的方法進行測定。飼糧和糞便總能參照國際標準ISO 9831:1998方法,采用氧彈式熱量儀(IKA C200,德國)進行測定,飼糧消化能=飼糧總能-糞便總能。

1.3.2 生長性能

分別于試驗期第1、14和28天早晨,以個體為單位對全部的試驗豬進行空腹稱重,試驗過程中每天記錄投放飼糧量,計算試驗第1階段(第1～14天)、試驗第2階段(第15～28天)和試驗全期(第1～28天)仔豬的ADG、平均日采食量(average daily feed intake,ADFI)和料重比(feed to gain raito,F/G)。在試驗期間,每天定時進行糞便評分,依據糞便形狀評為1～5分[11]。觀察并記錄每個圈舍仔豬的腹瀉及健康狀況,統計腹瀉仔豬頭數,糞便連續2 d評分在4～5分則為腹瀉,計算腹瀉率,公式如下:

腹瀉率(%)=100×Σ[(腹瀉頭數×腹瀉天數)/(每欄仔豬頭數×試驗天數)]。

1.3.3 血清生化指標

于試驗期第28天早晨,經過12 h空腹后,從每個重復中選取1頭中等體重的豬,經前腔靜脈采集血液樣本到10 mL的真空采血管中,3 000 r/min離心10 min后得到血清。將血清樣品在-80 ℃冰箱中冷凍保存,直到分析。使用邁瑞BC-30S全自動生化分析儀測定血清中葡萄糖(glucose,GLU)、甘油三酯(triglyceride,TG)、總膽固醇(total cholesterol,TC)、尿素氮(urea nitrogen,UN)、總蛋白(total protein,TP)、白蛋白(serum albumin,ALB)、高密度脂蛋白(high density lipoprotein,HDL)和低密度脂蛋白(low density lipoprotein,LDL)含量。

1.3.4 血清中腸道通透性標志物含量

采用酶聯免疫吸附測定(ELISA)試劑盒(上海恒遠生物科技有限公司)測定血清中二胺氧化酶(diamine oxidase,DAO)活性以及內毒素和D-乳酸含量,具體操作步驟根據試劑盒說明書進行。

1.3.5 血清免疫指標

采用ELISA試劑盒(上海恒遠生物科技有限公司)測定血清炎癥因子和免疫球蛋白含量,炎癥因子包括白細胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、白細胞介素-10(interleukin-10,IL-10)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α),免疫球蛋白包括免疫球蛋白A(immunoglobulin A,IgA)、免疫球蛋白G(immunoglobulin G,IgG)和免疫球蛋白M(immunoglobulin M,IgM),具體操作步驟根據試劑盒說明書進行。

1.3.6 糞便微生物群落

分別于試驗期第14天和第28天,從每個重復中選擇1頭試驗豬收集其直腸新鮮糞便樣本,裝入2 mL的無菌凍存管中,并立即用液氮快速冷凍,儲存在-80 ℃用于測定微生物群落結構。采用Omega Soil DNA提取試劑盒提取糞便的DNA樣品并進行PCR擴增,并送至上海美吉生物醫藥科技有限公司進行16S rRNA測序,測序流程包括DNA質檢、Illumina文庫構建和Illumina測序。通過對所得原始測序序列進行質控、過濾和雙端拼接獲得優化數據,使用序列降噪方法處理優化數據,獲得擴增子序列變異(amplicon sequence variant,ASV)代表序列和豐度信息。利用美吉生物云平臺進行菌群的多樣性分析、組成分析、物種差異分析和相關性分析。

1.4 數據統計與分析

采用Excel 2021對試驗數據進行初步整理,并采用SAS 9.4軟件對數據進行完全隨機設計的方差分析,通過正交多項式對比評估隨著WB和SBP替代量增加的線性和二次效應,當線性和二次效應都顯著時,只討論二次效應。數據結果以平均值和均值標準誤(SEM)表示,P<0.01表示差異極顯著,P<0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 不同纖維源對斷奶仔豬生長性能和腹瀉率的影響

由表2可知,試驗第1階段(第1～14天),與WB4組相比,SBP8組斷奶仔豬ADG顯著提高(P<0.05),F/G顯著降低(P<0.05);ADG隨飼糧中SBP替代量的增加呈線性升高(P<0.05)。試驗全期(第1～28天),ADG隨飼糧中SBP替代量的增加呈線性升高(P<0.05)。各組間腹瀉率均無顯著差異(P>0.05)。

表2 不同纖維源對斷奶仔豬生長性能和腹瀉率的影響

2.2 不同纖維源對斷奶仔豬血清生化指標的影響

由表3可知,SBP8組斷奶仔豬血清TC含量顯著低于WB8組(P<0.05)。各組間其他血清生化指標均無顯著差異(P>0.05)。

表3 不同纖維源對斷奶仔豬血清生化指標的影響

2.3 不同纖維源對斷奶仔豬血清中腸道通透性標志物含量的影響

由表4可知,SBP4組斷奶仔豬血清DAO活性極顯著低于WB4組和WB8組(P<0.01);與CON組和WB8組相比,SBP4組、SBP8組和WB4組血清內毒素含量極顯著降低(P<0.01);與CON組和SBP4組相比,SBP8組血清D-乳酸含量顯著降低(P<0.05)。此外,血清內毒素含量隨飼糧中WB替代量的增加呈先降低后提高的二次變化(P<0.05),血清D-乳酸含量隨飼糧中SBP替代量的增加呈先提高后降低的二次變化(P<0.05)。

表4 不同纖維源對斷奶仔豬血清中腸道通透性標志物含量的影響

2.4 不同纖維源對斷奶仔豬血清免疫指標的影響

由表5可知,WB8組、SBP4組和SBP8組斷奶仔豬血清IL-1β含量極顯著低于CON組(P<0.01);SBP8組血清IL-10含量極顯著高于CON組和WB4組(P<0.01);SBP8組血清TNF-α含量極顯著低于WB4組、WB8組和SBP4組(P<0.01);與CON組和WB4組相比,SBP4組和SBP8組血清IgG含量極顯著提高(P<0.01);與WB4組相比,WB8組和CON組血清IgG含量極顯著提高(P<0.01)。此外,血清IL-10含量隨飼糧中SBP替代量的增加呈線性升高(P<0.05),血清TNF-α含量隨飼糧中WB和SBP替代量的增加呈先提高后降低的二次變化(P<0.05),血清IgG含量隨飼糧中WB替代量的增加呈先降低后增加的二次變化(P<0.05),血清IgG含量隨飼糧中SBP替代量的增加呈線性升高(P<0.05)。

表5 不同纖維源對斷奶仔豬血清免疫指標的影響

2.5 不同纖維源對斷奶仔豬糞便微生物群落的影響

2.5.1 不同纖維源對斷奶仔豬糞便微生物群落多樣性的影響

如圖1-A所示,試驗第14天,CON組、WB4組、WB8組、SBP4組和SBP8組斷奶仔豬糞便微生物群落分別具有19、9、10、9和8個獨特的屬,5個組共有的屬為139個。如圖1-B所示,試驗第28天,CON組、WB4組、WB8組、SBP4組和SBP8組糞便微生物群落分別具有16、12、7、5和7個獨特的屬,5個組共有的屬為153個。不同纖維源對斷奶仔豬糞便微生物群落α多樣性的影響如表6所示,試驗第14天,WB4組、WB8組、SBP4組和SBP8組糞便微生物群落的Simpson指數顯著低于CON組(P<0.05),這表明WB4組、WB8組、SBP4組和SBP8組糞便微生物群落的α多樣性高于CON組。不同纖維源對斷奶仔豬糞便微生物群落β多樣性的影響如圖2所示,由圖2-A可知,試驗第14天,各組糞便微生物群落明顯分離,具有顯著差異(P<0.05);由圖2-B可知,試驗第28天,各組糞便微生物群落聚在一起,差異不顯著(P>0.05)。

圖1 斷奶仔豬第14天(A)和第28天(B)糞便微生物群落韋恩圖(屬水平)

圖2 斷奶仔豬第14天(A)和第28天(B)糞便微生物群落β多樣性

表6 不同纖維源對斷奶仔豬糞便微生物群落α多樣性的影響

2.5.2 不同纖維源對斷奶仔豬糞便微生物群落組成的影響

圖3為試驗第14天和第28天斷奶仔豬糞便微生物群落在門水平上的相對豐度,其中優勢菌門為厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidota)和變形菌門(Proteobacteria),第14天和第28天上述菌門在總序列中的占比分別為97.8%和96.7%。圖4-A為試驗第14天斷奶仔豬糞便微生物群落在屬水平上的相對豐度,其中優勢菌屬為普雷沃氏菌科NK3B31群(Prevotellaceae_NK3B31_group)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、普雷沃氏菌屬9(Prevotella_9)、未分類毛螺菌科(unclassified_f_Lachnospiraceae)和普雷沃氏菌屬(Prevotella)。圖4-B為試驗第28天斷奶仔豬糞便微生物群落在屬水平上的相對豐度,其中優勢菌屬為乳桿菌屬、普雷沃氏菌屬9、未分類毛螺菌科、巨球型菌屬(Megasphaera)和未分類桿菌綱(unclassified_c_Bacilli)。為明確各組間的差異微生物,對試驗第14天和第28天斷奶仔豬糞便微生物群落進行線性判別分析效應大小(LEfSe)分析,結果如圖5所示,試驗第14天,普雷沃氏菌科UCG-003(Prevotellaceae_UCG-003)在WB4組中顯著富集[線性判別分析(LDA)得分>2,P<0.05],糞球菌屬(Coprococcus)在SBP8組中顯著富集(LDA得分>2,P<0.05);試驗第28天,毛螺菌科NK4A136群(Lachnospiraceae_NK4A136_group)在SBP8組中顯著富集(LDA得分>2,P<0.05)。

圖3 斷奶仔豬第14天(A) 和第28天(B) 糞便微生物群落在門水平上的分布

圖4 斷奶仔豬第14天(A) 和第28天(B) 糞便微生物群落在屬水平上的分布

圖5 LEfSe分析斷奶仔豬第14天(A) 和第28天(B) 在屬水平上顯著富集的糞便微生物

2.5.3 斷奶仔豬糞便微生物群落與血清免疫指標的相關性分析

斷奶仔豬糞便微生物群落與血清免疫指標的相關性分析如圖6所示,糞便未分類毛螺菌科相對豐度與血清IL-1β含量呈顯著負相關(P<0.05),糞便狹義梭菌屬1(Clostridium_sensu_stricto_1)相對豐度與血清IL-1β含量呈顯著正相關(P<0.05);糞便普雷沃氏菌科NK3B31群相對豐度與血清IL-10含量呈顯著正相關(P<0.05);糞便普雷沃氏菌屬9相對豐度與血清TNF-α含量呈顯著正相關(P<0.05);分別未定級梭菌屬UCG-014(norank_f_norank_o_Clostridia_UCG-014)相對豐度與血清IgA含量呈顯著正相關(P<0.05);糞便狹義梭菌屬1和普雷沃氏菌科UCG-003相對豐度與血清IgG含量呈顯著負相關(P<0.05)。

*表示差異顯著(P<0.05)。* indicated significant difference (P<0.05).

3 討 論

3.1 不同纖維源對斷奶仔豬生長性能和腹瀉率的影響

在本研究中,與WB4組相比,SBP8組斷奶仔豬在試驗第1階段的ADG顯著提高,F/G顯著降低。結果表明,纖維對斷奶仔豬生長性能的影響取決其來源,SBP對于提高斷奶仔豬的生長性能更加有效。Wang等[10]研究表明,飼喂60 g/kg的SBP可提高斷奶仔豬的生長性能,而飼喂240 g/kg的SBP時則會降低生長性能,這是因為240 g/kg的SBP降低了總能和粗蛋白質的全腸道表觀消化率,由此說明纖維對斷奶仔豬的影響也取決于其添加量。本研究結果表明,SBP對斷奶仔豬的腹瀉率無顯著影響。Yan等[12]研究表明,飼糧中的SBP可預防仔豬斷奶后腹瀉,并對生長性能無不利影響,有一定的替抗作用。Berrocoso等[13]研究發現,在最佳的環境衛生條件下飼養仔豬時,纖維(燕麥殼、SBP、小麥中糧和秸稈)使仔豬斷奶后腹瀉增加;然而,當斷奶仔豬在較差的衛生條件下飼養時,纖維對其生長性能無負面影響。試驗結果的差異可能歸因于纖維的來源、水平以及試驗條件的不同。

3.2 不同纖維源對斷奶仔豬血清生化指標的影響

血清生化指標在很大程度上可以反映動物體內營養物質的代謝情況和動物機體的健康狀況[14]。本研究中,與WB8組相比,SBP8組斷奶仔豬血清TC含量顯著降低,這與之前的研究結果[15]一致。研究發現,可溶性纖維在后腸中發酵產生短鏈脂肪酸,而短鏈脂肪酸可以降低豬體內膽固醇的內源性合成[16-17]。SBP作為一種可溶性纖維可能通過增加消化液黏度來降低膽固醇和膽汁酸的吸收,并進一步改變肝臟膽固醇代謝,從而降低血清中的膽固醇含量[18]。血清TC含量的升高會導致炎癥介質如IL-1β、IL-6和TNF-α等含量的升高,導致蛋白質功能障礙以及氧化還原反應和免疫失調[19]。

3.3 不同纖維源對斷奶仔豬腸道通透性的影響

DAO是由腸上皮細胞合成的胞內酶,主要分布于細胞質[20]。腸道屏障的破壞通常會導致DAO釋放到血液中[21]。腸道的主要功能之一是阻止腸腔內細菌和內毒素移位至其他組織,當腸道屏障功能下降時,會導致腸腔內大量細菌和內毒素向腸外組織遷移。腸黏膜對D-乳酸具有屏障作用,機體產生的大量D-乳酸通過糞便被排出體外,而當腸道屏障功能下降時,腸道通透性增加,D-乳酸會進入到血液中。因此,血清DAO活性以及內毒素和D-乳酸含量可以作為監測腸道屏障完整性的標志,是代表腸道通透性的標志物[22]。本研究中,與WB4組和WB8組相比,SBP4組斷奶仔豬血清DAO活性極顯著降低;與CON組和WB8組相比,SBP4組、SBP8組和WB4組血清內毒素含量極顯著降低;與CON組和SBP4組相比,SBP8組血清D-乳酸含量顯著降低,這說明SBP可使腸道通透性降低,增強腸道屏障功能。腸道屏障功能增強可以防止致病菌和抗原的入侵,從而促進斷奶仔豬的生長。

3.4 不同纖維源對斷奶仔豬血清免疫指標的影響

研究表明,纖維具有免疫調節特性[23]。IL-1β和TNF-α是2種重要的促炎細胞因子,在調節免疫中起著關鍵作用[24-25],促炎細胞因子過度產生可能通過降低緊密連接蛋白的表達從而導致腸道屏障功能的破壞[26]。本研究發現,與CON組相比,WB8組、SBP4組和SBP8組斷奶仔豬血清IL-1β含量極顯著降低;與WB4組、WB8組和SBP4組相比,SBP8組血清TNF-α含量極顯著降低。飼喂SBP的仔豬血清促炎因子含量降低可能是改善腸道屏障功能的原因之一。IL-10可以促進B細胞的分化和增殖以及抗體的分泌[27],抑制多種細胞因子的合成從而起到抗炎作用,是重要的抗炎因子[28]。本研究中,與CON組和WB4組相比,SBP8組血清IL-10含量極顯著提高。此外,本研究結果表明,與CON組和WB4組相比,SBP4組和SBP8組血清IgG含量極顯著提高。血清免疫球蛋白是體液免疫的主要組成部分,是反映機體免疫功能的重要指標[29]。免疫球蛋白分泌增加,進而可以增強腸道黏膜屏障,這可能是SBP增強腸道屏障功能的原因之一[30]。由此可見,SBP可以通過調節炎癥細胞因子和免疫球蛋白來增強仔豬的免疫能力。

3.5 不同纖維源對斷奶仔豬糞便微生物群落的影響

飼糧中的纖維成分是影響腸道菌群的重要因素[31],腸道菌群對腸道形態、腸道屏障、免疫功能和宿主健康都有重要的影響[32]。本試驗使用16S rRNA測序測定了各組斷奶仔豬直腸糞便的微生物群落組成,結果表明,通過降低Simpson指數,WB4組、WB8組、SPB4組和SBP8組斷奶仔豬糞便微生物群落α多樣性均有所提高,這與之前的研究結果[33-34]一致。通過LEfSE分析可知,試驗第14天,普雷沃氏菌科UCG-003在WB4組中顯著富集,普雷沃氏菌科UCG-003可引起炎癥反應,增加腸道通透性[35-36];糞球菌屬在SBP8組中顯著富集,糞球菌屬能夠積極發酵碳水化合物產生丁酸,可能通過產生IgG來調節免疫反應[37],SBP8組血清IgG含量較高可能與糞球菌屬的相對豐度提高有關。試驗第28天,毛螺菌科NK4A136群在SBP8組中顯著富集,毛螺菌科NK4A136群廣泛存在于胃腸道中,可以利用果膠等纖維,是產丁酸和丙酸的有益微生物[38],在宿主的能量調節和腸道屏障功能方面發揮著重要作用[39-40]。通過糞便微生物群落與血清免疫指標的相關性分析發現,糞便未分類毛螺菌科相對豐度與血清IL-1β含量呈負相關,糞便普雷沃氏菌屬9相對豐度與血清TNF-α含量呈正相關,糞便普雷沃氏菌科UCG-003相對豐度與血清IgG含量呈負相關。結果表明,斷奶仔豬糞便微生物群落組成的改善可能是SBP8組機體免疫反應改善和腸道屏障功能增強的原因之一。

4 結 論

8%SBP替代基礎飼糧可以提高斷奶仔豬生長性能,增強機體免疫功能和腸道屏障功能,并通過調節腸道菌群結構,提高有益菌豐度,促進腸道健康。