蒲公英水提物對熱應激條件下奶牛產奶性能、血清生化指標、乳中體細胞數及糞便微生物多樣性的影響

李趙嘉 孟 然* 楊文嬌 馮 薇 李名雪 陳志穎 王秀萍* 毛立娟 陳 娜

(1.河北省農林科學院濱海農業研究所,唐山市蒲公英工程技術研發中心,唐山市植物耐鹽研究重點實驗室,河北省鹽堿地綠化技術創新中心,曹妃甸 063200;2.唐山拓普生物科技有限公司,河北酵母技術創新中心,開平 063000;3.河北桃晟堂農業科技開發有限公司,涉縣 056400;4.中科康源(唐山)生物技術有限公司,遷安 064400)

夏季高溫高濕的養殖環境極易誘發奶牛產生熱應激,爆發乳房炎,導致其抗氧化能力下降、免疫力低下、腸道菌群紊亂,并使牛乳中體細胞數(somatic cell count,SCC)急劇增加,降低牛乳品質,且極易變質,直接或間接造成奶牛產奶性能下降,給奶農造成巨大的經濟損失[1]。目前,抗生素的使用作為防治奶牛乳房炎的主要手段,盡管取得了較好的防治效果,但由于養殖戶過快地追求經濟效益而造成抗生素被濫用,使其對人、動物、生態環境的危害日益凸顯。同時,自2020年7月1日起,我國全面禁止抗生素在飼料端的添加,為保障我國畜牧業持續健康發展,尋找安全、綠色的飼料添加劑尤為重要[2]。蒲公英(TaraxacummongolicumHand.-Mazz.)及其提取物因具有良好的抗菌、消炎功效,且安全、綠色、無殘留,能有效抑制奶牛乳房炎病原菌,可緩解炎癥反應、增強生產性能、提升免疫力等,成為奶牛健康養殖的熱點研究課題。

蒲公英又名黃花地丁,菊科多年生草本植物[3],是較為傳統且常用的中草藥,已入選國家衛健委頒布的“藥食同源”植物目錄。據《本草綱目》記載,蒲公英有清熱解毒、消腫散結之功效,且富含胡蘿卜素類、維生素、蛋白質、礦物質等多種營養成分,具有抗應激、促生長的作用;除此之外,蒲公英還富含酚酸類、黃酮類等多種活性成分,具有廣譜的抗菌消炎作用,更有“藥草皇后”和“天然抗生素”的美譽,尤其對金黃色葡萄球菌表現出較強的抑制作用[4-5]。研究表明,天然化合物酚酸類物質不能由人和動物自身合成,必須通過食物獲得[6],該類物質具有抗氧化、抗炎、抑菌等多種生物活性,常被用于傳統藥物成分或作為膳食補充劑應用在現代營養品中[7]。據報道,蒲公英提取物中總酚酸類化合物含量高達120.5 mg/g[8],可通過調節蛋白激酶作用于細胞核內轉錄因子核因子-κB(NF-κB),調節炎癥反應過程中的腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素-6(IL-6)、白細胞介素-1β(IL-1β)、誘導型一氧化氮合成酶(iNOS)、環氧化酶-2(COX-2)等和細胞黏附分子,從而抑制炎癥的發生[9];同時,酚酸類化合物具有較強的抗氧化能力,可通過直接清除機體內活性氧自由基,抑制脂質過氧化,以及與變價金屬離子螯合等途徑發揮抗氧化作用[7]。因此,蒲公英及其提取物被廣泛地應用在畜禽健康養殖中。

研究發現,蒲公英提取物可以顯著降低1～28日齡仔豬的腹瀉率,顯著提高營養物質表觀消化率,提高機體免疫功能,改變仔豬糞便微生物組成[10]。Samolińska等[11]證實,蒲公英根粉對74～137日齡育肥豬的增重具有促進作用。張鵬舉等[12]研究表明,患乳房炎奶牛飼喂公英翹蘆散(蒲公英、連翹、王不留行等)1 d后,乳液中SCC極顯著降低;飼喂7 d后,患病乳區由75個減少至28個,治愈率達62.67%。另有研究指出,公英散對奶牛乳房炎臨床治療效果良好,總治愈率高達93.33%,不產生抗奶,且無棄奶期[13]。Li等[14]研究指出,飼糧中添加蒲公英可增加奶牛瘤胃中厚壁菌門(Firmicutes)相對豐度,并調節瘤胃的代謝,進而促進食物在瘤胃中被充分發酵和吸收。飼糧中添加0.5%的蒲公英提取物即可緩解奶牛的氧化應激反應,并使其泌乳性能得到改善[15];當蒲公英添加水平達到6.0%時,放牧肉牛血清球蛋白含量升高,極大程度改善了其血液代謝能力和集體免疫力[16]。但針對熱應激所導致的奶牛產奶性能、抗氧化能力及免疫機能降低等問題,目前關于蒲公英水提物(dandelion water extract,DWE)對其影響的研究鮮有報道。因此,本試驗旨在探討飼糧中添加蒲公英水提物對熱應激條件下奶牛產奶性能、血清抗氧化和免疫指標、SCC及糞便微生物多樣性的影響,旨在為蒲公英水提物作為奶牛飼料添加劑提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

蒲公英水提物:采用自主研發的提取方法(專利號:202010339629.4)對自主選育的優質、高產蒲公英新品種“濱蒲1號”(省登記號:20181421)進行提取,經噴霧干燥后得蒲公英水提物。提取工藝條件:蒲公英∶水=1∶15,提取溫度92 ℃,提取壓力0.07 MPa,提取時間4.6 h。

蒲公英水提物的活性成分含量采用液相色譜-質譜聯用(LC-MS)法定性、定量分析。蒲公英水提物中主要活性成分含量見表1,蒲公英總離子流(TIC)圖見圖1、圖2。

圖1 蒲公英總離子流圖(正離子模式)

圖2 蒲公英總離子流圖(負離子模式)

表1 蒲公英水提物中主要活性成分含量

1.2 試驗設計

試驗選用120頭泌乳日齡、體重、胎次、產奶量均相近的產奶期荷斯坦奶牛,采用完全隨機試驗設計原則分為3組,每組5個重復,每個重復8頭牛。對照組(DZ組)飼喂基礎飼糧,試驗組分別在基礎飼糧中添加50(DWE50組)和70 g/(頭·d)(DWE70組)的蒲公英水提物(根據課題組前期預試驗結果確定)。各組試驗牛體況見表2。試驗牛自由采食和飲水,試驗時間為2023年7月1—31日,預試期3 d,正試期28 d。

表2 各組試驗牛體況

1.3 試驗飼糧

參照NRC(2001)奶牛飼養標準配制,以全混合日糧(TMR)形式飼喂,基礎飼糧組成及營養水平見表3。

表3 基礎飼糧組成及營養水平(干物質基礎)

1.4 飼養管理

牛群進舍前7 d,對牛舍進行全面消毒。試驗牛采用散欄飼養(帶臥床),各組飼養管理條件一致。TMR車每天投料3次(06:00、14:00、22:00),自由采食,控制每天飼喂量,保持3%～5%剩料量。自由飲水,水槽每2 d清洗、消毒1次,保證水質清潔、健康、充足。糞便每天打掃2次,牛舍每周消毒2～3次,保持牛舍通風、清潔、干燥、衛生。每天04:00、12:00和20:00機械擠奶3次。

1.5 樣品采集及指標測定

1.5.1 牛舍溫濕度監測

正試期內,在試驗牛舍兩邊及中間離地1.5 m處各懸掛1個溫濕度計,分別記錄每天08:00、14:00、20:00的溫度及相對濕度,計算牛舍內每天環境的溫濕度指數(THI)。計算公式為:

THI=td-(0.55-0.55×RH)×(td-58);td=T×9/5+32。

式中:td為華氏溫度(℉),td=攝氏溫度(℃)×1.8+32;RH為相對濕度(%)。

THI<68表示未受熱應激;68≤THI<72表示熱應激臨界度;72≤THI<80表示輕度至中度熱應激;80≤THI<90表示中度至嚴重熱應激,THI≥90表示嚴重熱應激。

1.5.2 飼糧營養成分測定

飼糧營養成分測定均參考國家標準或行業標準測定,具體如下。

干物質(DM):GB/T 6435—2014;粗蛋白質(CP):GB/T 6432—2018;粗脂肪(EE):GB/T 6433—2006;粗灰分(Ash):GB/T 6438—2007;中性洗滌纖維(NDF):GB/T 20806—2006;酸性洗滌纖維(ADF):NY/T 1459—2007;鈣(Ca):GB/T 6436—2018;磷(P):GB/T 6437—2018。

1.5.3 產奶量及乳成分測定

產奶量測定:通過自動擠奶設備記錄每頭牛每日總產奶量。

乳成分測定:正試期內,第1、7、14、21、28天用無菌采樣瓶在擠奶的早、中、晚時間段分別采集各組生鮮牛乳100 mL,將采樣瓶密封并標識,立即送至無菌室,在無菌超凈操作臺分別將每組對應的奶樣混合、搖勻。用無菌移液器移取奶樣,測定乳脂率、乳蛋白率,并做好記錄。采用全自動乳成分分析儀(HM-SAP,山東恒美電子科技有限公司)進行測定。

SCC測定:正試期內,第1、4、7、10、13、16、19、22、25、28天進行采樣,采樣操作同乳成分測定采樣操作。采用流動細胞熒光計數儀(Countess Ⅱ FL,美國Thermo Fisher公司)進行SCC計數,并做好記錄。

1.5.4 血清抗氧化和免疫指標測定

正試期內,于第1天和第28天晨飼3～4 h后,各組隨機抽取奶牛血樣15個:采用真空抗凝采血管于牛尾靜脈處采血5 mL,將所采集血液樣品在冰水混合模式中(0 ℃)靜置30 min后于冷凍離心機中1 006.2×g離心10 min,分離得血清,并于-80 ℃超低溫冰箱中保存。用于測定血清抗氧化和免疫指標。

抗氧化指標:超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性及總抗氧化能力(T-AOC)、丙二醛(MDA)含量。

免疫指標:總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、球蛋白(GLB)、免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白M(IgM)、免疫球蛋白G(IgG)含量。

以上指標均采用試劑盒進行測定,試劑盒由北京索萊寶科技有限公司提供。

1.5.5 糞便微生物多樣性測定

正試期內,于第28天晨飼前,每組選取6頭試驗牛,帶無菌手套刮取直腸末端糞樣約20 g,裝于無菌凍存管中,液氮速凍后于-80 ℃冰箱保存。利用16S rRNA基因測序技術測定糞便微生物多樣性,以各試驗組奶牛糞便總DNA為模版,對細菌16S rRNA基因V3～V4區進行PCR擴增,通過Illumina NovaSeq 6000測序平臺進行微生物多樣性檢測,分析群落生物在門水平和屬水平的組成及相對豐度。測定工作由百邁客生物科技有限公司完成。

1.6 統計與分析

原始數據經Excel 2019初步整理后,采用SPSS 23.0軟件中t檢驗進行差異顯著性分析,以P<0.05為差異顯著性判斷標準,結果以平均值和均值標準誤(SEM)表示。

2 結 果

2.1 牛舍溫度、相對濕度及THI變化

根據每日監測的牛舍溫度、相對濕度,計算牛舍THI,并繪制成圖。由圖3可知,正試期內,牛舍日平均THI>72,表明試驗牛均處于熱應激狀態,滿足試驗所需的熱應激條件。

圖3 牛舍溫度、相對濕度及THI

2.2 蒲公英水提物對熱應激條件下奶牛產奶性能的影響

由表4可知,第14、21、28天,DWE50組、DWE70組的產奶量均顯著高于DZ組(P<0.05)。第7、14、21、28天,DWE70組的乳蛋白率顯著高于DZ組(P<0.05);第21、28天,DWE50組的乳蛋白率顯著高于DZ組(P<0.05)。第14、21、28天,DWE70組的乳脂率顯著高于DZ組(P<0.05);第28天,DWE50組的乳脂率顯著高于DZ組(P<0.05)。

表4 蒲公英水提物對熱應激條件下奶牛產奶性能的影響

2.3 蒲公英水提物對熱應激條件下奶牛血清抗氧化指標的影響

由表5可知,與第1天相比,DWE50組、DWE70組的第28天血清SOD、CAT、GSH-Px活性及T-AOC均呈有所升高,血清MDA含量則有所下降。第28天,DWE70組的血清SOD、GSH-Px活性及T-AOC顯著高于DZ組(P<0.05),DWE50組的血清GSH-Px活性及T-AOC顯著高于DZ組(P<0.05),DWE50組、DWE70組的血清MDA含量均顯著低于DZ組(P<0.05)。

表5 蒲公英水提物對熱應激條件下奶牛血清抗氧化指標的影響

2.4 蒲公英水提物對熱應激條件下奶牛血清免疫指標的影響

由表6可知,與第1天相比,DWE50組、DWE70組的第28天血清TP、ALB、GLB、IgA、IgM、IgG含量均有所增加。第28天,DWE50組的血清IgG含量顯著高于DZ組(P<0.05),DWE70組的血清GLB含量顯著高于DZ組(P<0.05)。

表6 蒲公英水提物對熱應激條件下奶牛血清免疫指標的影響

2.5 蒲公英水提物對熱應激條件下奶牛乳中SCC的影響

由圖4可知,從第1天至第28天,DZ組的乳中SCC略有升高,但整體趨于平穩;DWE50組、DWE70組的乳中SCC均表現出下降趨勢。DWE50組第4天至第22天乳中SCC下降,第22天至第28天乳中SCC趨于平穩;DWE70組第4天至第13天乳中SCC下降,第13天至第28天乳中SCC趨于平穩。與DWE50組相比,DWE70組的乳中SCC下降較為迅速,且第28天乳中SCC更低。

圖4 蒲公英水提物對熱應激條件下奶牛乳中SCC的影響

2.6 蒲公英水提物對熱應激條件下奶牛糞便微生物多樣性的影響

2.6.1 糞便微生物Venn圖

結束測序后,對Reads在97%的相似度水平下進行聚類,獲得操作分類單元(OTUs)。根據OTUs表格分析聚類信息并繪制韋恩圖。由圖5可知,3組奶牛糞便中共有OTUs數量為828個,DZ組和DWE50組共有OTUs數量為835個,DZ組和DWE70組共有OTUs數量為842個,DWE50組和DWE70組共有OTUs數量為852個,DZ組、DWE50組、DWE70組分別含有853、864、876個OTUs,DZ組獨有4個OTUs,DWE50組獨有5個OTUs,DWE70組獨有10個OTUs。

圖5 OTUs分布韋恩圖

2.6.2 糞便微生物α多樣性分析

基于OTUs分類水平對各組奶牛糞便微生物α多樣性指數進行分析,由圖6可知,與DZ組相比,DWE50組的糞便微生物ACE指數、Chao1指數、Shannon指數、Simpson指數及DWE70組的糞便微生物Shannon指數、Simpson指數均無顯著差異(P>0.05),DWE70組的糞便微生物ACE指數、Chao1指數顯著升高(P<0.05)。

圖6 糞便微生物α多樣性分析

2.6.3 糞便微生物β多樣性分析

基于OTUs分類水平對各組奶牛糞便微生物β多樣性指數進行分析,由圖7可知,第1主成分貢獻率為15.02%,第2主成分貢獻率為9.02%。DZ組、DWE50組的糞便微生物樣點基本集中分布,DWE70組的糞便微生物樣點相對分散,可以明顯區分并聚成3個類群,說明糞便微生物群落結構差異明顯。

圖7 糞便微生物β多樣性分析

2.6.4 糞便微生物相對豐度在門和屬水平上的變化

在門水平上,對DZ組、DWE50組、DWE70組相對豐度排行前10的菌門進行統計,由圖8可知,3個組的糞便優勢菌門均為擬桿菌門(Bacteroidetes)、厚壁菌門。由表7可知,與DZ組相比,DWE50組、DWE70組的糞便擬桿菌門相對豐度顯著升高(P<0.05),DWE50組的糞便厚壁菌門相對豐度顯著升高(P<0.05)。

Bacteroidetes:擬桿菌門;Firmicutes:厚壁菌門;Proteobacteria:變形菌門;Fusobacteria:梭桿菌門;Euryarchaeota:廣古菌門;Actinobacteria:放線菌門;Acidobacteria:酸桿菌門;Epsilonbacteraeota:ε變形菌門;Spirochaetes:螺旋菌門;Elusimicrobia:迷蹤菌門;Others:其他:Unknown:未知。

表7 門水平優勢微生物相對豐度

在屬水平上,對DZ組、DWE50組、DWE70組相對豐度排行前10的菌屬進行統計,由圖9可知,DZ組的糞便擬桿菌屬(Bacteroides)相對豐度最高,其次為未培養的擬桿菌目(uncultured_bacterium_o_Bacteroidales);DWE50組、DWE70組的糞便擬桿菌屬相對豐度最高,其次為理研菌科RC9腸道群(Rikenellaceae_RC9_gut_group)。

Bacteroides:擬桿菌屬;Rikenellaceae_RC9_gut_group:理研菌科RC9腸道群;uncultured_bacterium_o_Bacteroidales:未培養的擬桿菌目;uncultured_bacterium_f_Ruminococcaceae:未培養的瘤胃菌科;Ruminococcaceae_UCG-014:瘤胃菌科UCG-014;uncultured_bacterium_f_Lachnospiraceae:未培養的毛螺菌科;uncultured_bacterium_f_Clostridiales_vadinBB60_group:未培養的梭狀芽孢桿菌科vadinBB60群;[Ruminococcus]_torques_group:瘤胃球菌屬組;Desulfovibrio:脫硫弧菌屬;Phascolarctobacterium:考拉桿菌屬;Others:其他:Unknown;未知。

2.6.5 糞便微生物線性判別分析效應大小(LEfSe)分析

由圖10可知,采用糞便微生物進化分支圖評估組間微生物豐富度的差異,在線性判別分析(LDA)值>3.5條件下,共計28個不同分類水平優勢微生物,DZ組、DWE50組、DWE70組分別為4、11、13個。當LDA值>4.0,DZ組較其他組具有顯著差異的物種有未培養的普雷沃氏菌科(uncultured_bacterium_f_Prevotellaceae),DWE50組較其他組具有顯著差異的物種有酸桿菌門(Acidobacteria)、酸桿菌綱(Acidobacteriia),DWE70組較其他組具有顯著差異的物種有梭狀芽孢桿菌綱(Clostridia)、梭狀芽孢桿菌目(Clostridiales)、厚壁菌門、未培養的擬桿菌目等。

f_Acidobacteriaceae_Subgroup_1:酸桿菌科-子群1;f_Solibacteraceae_Subgroup_3:索力氏菌科-子群3;o_Solibacterales:索利氏菌目;g_uncultured_bacterium_f_Prevotellaceae:未培養的普雷沃氏菌科;g_Parabacteroides:狄氏副擬桿菌屬;g_uncultured_bacterium_o_Bacteroidales:未培養的擬桿菌目;f_uncultured_bacterium_o_Bacteroidales:未培養的擬桿菌目;g_Mucispirillum:黏液螺旋菌屬;f_Deferribacteraceae:脫鐵桿菌科;o_Deferribacterales:脫鐵桿菌目;g_Elusimicrobium:迷蹤菌屬;f_Elusimicrobiaceae:迷蹤菌科;o_Elusimicrobiales:迷蹤菌目;o_Lactobacillales:乳桿菌目;g_uncultured_bacterium_f_Clostridiales_vadinBB60_group:未培養的梭狀芽孢桿菌屬vadinBB60群;f_Clostridiales_vadinBB60_group:梭狀芽孢桿菌科vadinBB60群;g_Tyzzerella:泰勒菌屬;g_Faecalibacterium:普拉梭菌屬;g_Intestinimonas:顫螺旋菌屬;o_Clostridiales:梭狀芽孢桿菌目;f_Succinivibrionaceae:琥珀酸弧菌科;o_Aeromonadales:氣單胞菌目;g_Massilia:馬賽菌屬;o_Chthoniobacterales:西索恩氏菌目。

3 討 論

3.1 蒲公英水提物對熱應激條件下奶牛產奶性能的影響

奶牛熱應激是奶牛處于高溫、高濕環境中對熱暴露所做出的非特異性生理反應,研究表明,熱應激加快機體自身營養物質消耗,造成機體代謝機能紊亂,并抑制免疫功能,最終導致產奶性能下降[17]。產奶性能的提升是增加經濟效益的關鍵,是反映奶牛生產最直接的指標。植物提取物中所富含的多種活性物質能夠增強奶牛胃腸道蠕動,調節腸道微生物群[18],促進腸道細胞對養分的消化吸收,提升奶牛對飼料的轉化率,提高營養物質的消化吸收,改善奶牛產奶性能,減緩熱應激帶來的不利影響[19]。

Olagaray等[20]研究發現,黃芩提取物中黃酮類化合物可顯著增長奶牛全期泌乳量,同時牛乳中乳脂肪、乳蛋白等營養成分含量明顯增加。杜仲提取物中綠原酸等有機酸類化合物、黃酮類化合物可提升牛乳中乳脂率和乳糖率,顯著改善牛乳的品質[21]。當奶?？诜耐墓麑嵦崛∥?奶牛中營養成分含量發生積極變化,乳液中pH、電導率均顯著降低,產奶性能得到積極改善[22]。另外,植物多糖類化合物可以調節生產期畜禽動物的氣血,提高畜禽動物本身的機體抵抗熱應激能力,維持畜禽動物正常的內環境平衡,保持旺盛的生殖能力,提高畜禽動物的生產性能[23]。乳腺上皮細胞是奶牛哺乳期分泌乳汁的主要場所,熱應激極易使乳腺組織產生炎癥,進而受到損傷,使乳腺上皮細胞數量和活性受到影響,導致奶牛產奶量的降低[24]。有文獻指出,熱應激會抑制機體下丘腦活動,影響生產性能激素的分泌[25],而蒲公英可作用于機體下丘腦-腦垂體系,通過促進卵泡刺激素(FSH)、黃體生成素(LH)、孕激素P分泌來改善乳腺的泌乳性能。

本試驗期內,牛舍內THI>72,表明試驗奶牛均處于熱應激狀態,試驗結果顯示,當奶牛飼糧中添加蒲公英水提物飼喂一段時間,DWE50組、DWE70組奶牛的產奶量、乳蛋白率、乳脂率等較DZ組顯著提高。產生該結果的原因可能是因為本試驗所用蒲公英水提物包括碳水化合物、多糖、多肽等多種營養物質成分,且包含酚酸類化合物、黃酮類化合物、多糖類化合物、生物堿類化合物等多種活性成分,具有減緩奶牛熱應激效應、促進奶牛乳腺上皮細胞增殖、促進乳成分合成的作用,提升了奶牛泌乳功能,與前人研究結果[20-23]基本一致。綜上所述,奶牛飼糧中添加適量的蒲公英水提物可改善奶牛熱應激狀態,增強奶牛產奶性能。

3.2 蒲公英水提物對熱應激條件下奶?？寡趸芰Φ挠绊?/h3>

當奶牛機體健康時,體內抗氧化系統處于動態平衡狀態,但隨著奶牛受到熱應激效應影響時,體內抗氧化系統酶活性會逐漸降低,自由基逐漸積累,并引起脂質過氧化反應,間接加速機體細胞功能的損傷。SOD、CAT、GSH-Px、T-AOC是奶牛機體細胞內清除自由基的內源性抗氧化酶,能夠清除體內超氧自由基(·O2-)和脂質過氧化產物MDA[26],同時,MDA含量能夠準確地反映出機體脂質過氧化的程度,并間接反映細胞膜脂質雙分子層受·O2-破壞程度,MDA含量越低,機體的抗氧化能力越強,對機體熱應激的緩解作用越強。研究表明[27],植物提取物中酚酸類化合物對SOD、CAT、GSH-Px、T-AOC等內源性抗氧化酶的活性具有增強效果。Liu等[28]研究發現,植物單寧可降低牛乳中SCC和MDA含量,抑制奶牛血漿和肝臟的脂質過氧化;在斷奶仔豬飼糧中添加銀杏葉提取物可顯著增強斷奶仔豬血清SOD、CAT、GSH-Px等抗氧化酶活性[29];植物提取物菊苣酸顯著提高了牦牛血清SOD、GSH-Px等抗氧化酶活性,并顯著降低了血清MDA含量[30];植物多糖類物質可以顯著提高肉仔雞血清T-AOC、SOD等抗氧化酶活性,且降低血清MDA含量[4]。

在本試驗中,與DZ組相比,DWE50組、DWE70組奶牛血清GSH-Px活性及T-AOC均顯著升高,血清MDA含量均顯著降低,說明蒲公英水提物具有提高熱應激條件下泌乳期奶牛機體抗氧化能力的作用。根據現有研究推測,這可能是由于蒲公英水提物中所含的大量酚酸類化合物等活性成分激活了泌乳期奶牛內源性抗氧化系統,增強奶牛機體抗氧酶的表達能力,進而防御機體因熱應激所導致過氧化反應而產生的自由基,并及時將自由基清除,從而提高奶牛的抗氧化能力,減輕泌乳期奶牛機體內的氧化應激與熱應激效應。

3.3 蒲公英水提物對熱應激條件下奶牛免疫功能的影響

免疫是指機體識別自我和非我物質,通過產生免疫應答清除非我物質,維持自身生理平衡和穩定的過程。熱應激使外界環境溫度超過奶牛自身等熱區上限時,便會抑制巨噬細胞的活化,阻礙淋巴細胞分裂和分化,導致淋巴細胞數量減少,抑制細胞免疫和體液免疫,影響自身的免疫功能[31]。因此,如何提高機體免疫力,成為泌乳期奶牛機體健康的關鍵。由于血清的組成成分和組織間液較為相近,因此血清生化指標可以較為準確地反映出機體內環境的變化,并在一定程度上反映動物機體的代謝情況和健康情況[32]。血清中TP由ALB和GLB組成,參與血液中營養物質的運輸和保持組織蛋白的動態平衡,維持血漿滲透壓,在一定程度上反映機體營養代謝水平、肝臟功能以及免疫功能狀況,血清ALB含量的提升有助于提高機體免疫力[33]。本試驗中,與DZ組相比,DWE50組、DWE70組的血清TP、ALB、GLB含量均有不同程度的增加,且DWE70組的血清GLB含量顯著增加。

另有研究表明,中草藥及提取物中的活性成分可促進奶牛胸腺、脾臟等免疫器官發育[34],維持機體體液和細胞免疫狀態平衡[35]。B淋巴細胞作為體液免疫的重要活性細胞,在奶牛抵抗熱應激過程中產生特異抗體,發揮體液免疫功能[35],當B淋巴細胞受到特定抗原刺激后,便會產生免疫球蛋白,如IgA、IgM、IgG等,其中,IgA有抑制黏附、調理吞噬等作用,占血清免疫球蛋白總量的10%～15%[24];IgM作為體液免疫應答時最先產生的免疫球蛋白,有溶菌、溶血等作用,在機體免疫防護早期不可被替代[27];IgG有抗菌、抗病毒等作用,參與機體體液抗感染免疫過程[36]。因此,IgA、IgM、IgG常被用來判斷動物體液免疫功能的強弱。本試驗中,與DZ組相比,DWE50組、DWE70組的血清IgA、IgM、IgG含量均有不同程度的增加,且DWE50組的血清IgG含量顯著增加。當奶牛飼糧中補飼瘤胃蛋氨酸和肉桂醛時,血清TP、ALB含量得到顯著提升[37];枸杞多糖可顯著增加泌乳期奶牛血清IgA含量,極顯著增加血清IgM、IgG含量[38]。由此可見,富含多糖類化合物、酚酸類化合物等多種活性成分的蒲公英水提物可刺激泌乳期奶牛B淋巴細胞的增殖,增加其血清抗體水平,提高細胞免疫和體液免疫水平,從而增強奶牛機體免疫功能,減緩熱應激效應。

3.4 蒲公英水提物對熱應激條件下奶牛乳中SCC的影響

乳中SCC指每毫升原乳中的細胞總數,包含巨噬細胞、淋巴細胞、多形核嗜中性白細胞以及少量乳腺組織上皮細胞等,乳中SCC在20萬個/mL以內時,通常認為奶牛處于健康狀態。當泌乳期奶牛處于熱應激時,機體抗氧化能力和免疫功能便會隨著熱應激時間的延長而降低,乳腺組織極易被金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌等病原菌入侵感染,增強乳腺血管通透性,使血液中的白細胞進入乳中,導致乳中SCC升高,產生大量的炎性因子,進而引起炎癥反應,最終破壞牛乳營養成分。因此,乳中SCC是牛乳分級的重要依據之一[39]。

研究證實,蒲公英水提物中含有黃酮類化合物、酚酸類化合物等多種活性成分,具有增強機體免疫力及廣譜的抑菌作用,對預防奶牛乳房炎的發生及降低牛乳中SCC具有不可比擬的作用。韓映梅等[40]采用蒲公英、黃芪、杜仲、當歸等多種中藥組方形式治療患乳房炎的奶牛,使乳中SCC得到顯著降低;祝海嘯等[41]用以蒲公英為主要原材料的“公英散”中藥制劑灌服21頭乳房炎病牛,乳中SCC顯著降低,且乳房炎治愈率高達90.47%。本試驗中,飼喂蒲公英水提物后,乳中SCC均下降,且下降趨勢明顯,而DZ組乳中SCC趨于平穩且仍有升高趨勢,因此,本試驗結果表明,飼糧中添加蒲公英水提物可以降低奶牛乳中SCC,對預防因熱應激而引發的奶牛乳房炎的發生具有積極作用,進一步證實了前人的試驗結果。

3.5 蒲公英水提物對熱應激條件下奶牛糞便微生物多樣性的影響

腸道微生物是腸道內環境的重要組成部分,各種微生物之間相互作用,處于動態平衡狀態,共同維持機體的腸道健康。研究發現,熱應激可打破腸道微生物動態平衡狀態,抑制腸道微生物活動和內攝作用[31]。本試驗為了探究蒲公英水提物是否影響熱應激條件下奶牛糞便微生物多樣性的變化,對飼糧中添加不同水平蒲公英水提物的奶牛糞便微生物生物多樣性進行了分析,Venn圖顯示,DWE50組、DWE70組總的OTUs數量及獨有OTUs數量均多于DZ組。α多樣性指數分析結果表明,DWE70組奶牛糞便微生物的ACE指數、Chao1指數與DZ組之間具有顯著差異,Simpson指數、Shannon指數不具有顯著差異。ACE指數和Chao1指數反映微生物群落的豐富度,Simpson指數和Shannon指數反映微生物的多樣性[42]。由此推斷,當蒲公英水提物的添加水平為70 g/(頭·d)時,奶牛糞便中微生物物種數量增多,與DWE70組獨有的OTUs數量多于DZ組、DWE50組的研究結果一致。β多樣性指數分析結果表明,3組奶牛糞便微生物樣點相對分散,可以明顯區分并聚成3個類群,說明糞便微生物群落結構差異明顯。

本試驗通過LEfSe法分析糞便微生物組間差異性。當LDA值>4.0,與DZ組、DWE50組相比,DWE70組具有顯著差異的物種更多,主要為梭狀芽孢桿菌綱、梭狀芽孢桿菌目、厚壁菌門、未培養的擬桿菌目等。在門水平上,3組奶牛糞便中微生物優勢菌門均為擬桿菌門和厚壁菌門,與其他反芻動物后腸道和糞便微生物的研究結果[43-44]一致。厚壁菌門促進碳水化合物分解,并加快機體代謝,擬桿菌門主要降解食物中纖維素成分,將纖維素轉化為更容易吸收的糖類物質,進而增強奶牛對飼料中營養物質的吸收,促進奶牛產奶性能的提升[45]。在本試驗中,DWE50組、DWE70組奶牛的產奶量在第14、21、28天時顯著高于DZ組,進一步證實現有的研究結論。由此可以推斷,當奶牛飼糧中添加蒲公英水提物后,后腸道微生態環境受到顯著影響,但其優勢菌門種類并未改變,表明奶牛腸道中優勢菌群在門水平上受飼糧因素影響較小。在屬水平上,DWE50組、DWE70組最大的優勢菌屬為理研菌科RC9腸道群,該菌屬可將腸道中的膳食纖維進行分解和發酵,產生乙酸、丙酸、丁酸及其他短鏈脂肪酸。有研究指出,腸道微生物發酵產生的短鏈脂肪酸可為腸道上皮細胞的正常代謝活動提供能量,保護腸道完整性,調節機體的免疫力,改善宿主健康[46-48]。當飼糧中添加蒲公英水提物后,奶牛血清IgA、IgM、IgG含量均有增加,說明本試驗條件下奶牛的機體免功能得到增強。產生該結果可能是因為蒲公英水提物含有大量酚酸類、黃酮類等化合物,可提高奶牛后腸道中理研菌科RC9腸道群的相對豐度,加強腸道微生物自身的代謝能力,產生大量短鏈脂肪酸,進而增強奶牛機體免疫功能。

4 結 論

飼糧中添加蒲公英水提物可提高奶牛產奶量、乳蛋白率、乳脂率,降低乳中SCC,增加奶牛糞便微生物多樣性及相對豐度,正向調節機體抗氧化能力和免疫功能。