動物源性抗菌肽對荷斯坦奶公牛生長性能、瘤胃發酵指標、糞便評分、血清生化和免疫指標的影響

高 鑫 李秀芝* 黃煒乾,2 林萬華 梁鶴齡 成 東 鄒弘杰 覃明祥 江明生** 林 波**

(1.廣西大學動物科學技術學院,南寧 530003;2.廣東容大生物股份有限公司,清遠 515000;3.清遠一生自然生物研究院有限公司,清遠 511500)

隨著養殖業規?；c集約化的發展,高精料飼喂已成為提高飼養肉牛生長性能的主要手段,但同時也會引發肉牛瘤胃酸中毒。莫能菌素是一種能夠改變瘤胃發酵模式、預防瘤胃酸中毒的有效抗生素類飼料添加劑,但隨著飼料行業2020年施行禁抗以來,莫能菌素等抗生素在飼料中的使用受到極大限制。因此,尋找安全、綠色、無殘留的抗生素替代品成為畜牧行業研究與應用的熱點。

抗菌肽是一類結構復雜、分子質量2～7 ku、含有20～60個氨基酸的多肽,目前發現的抗菌肽有7 000多種[1]。動物源抗菌肽因其來源于動物基因組,因此具有良好的生物安全性,適宜于作為飼料添加劑。研究表明,抗菌肽的抗菌機制是由帶正電荷的抗菌肽與帶負電荷的細菌相互結合,利用自身的α-螺旋結構插入細菌細胞膜,進而使得細菌細胞內容物流出;因此,動物源性抗菌肽對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌均有殺滅作用[2]。同時,關于抗菌肽調控瘤胃發酵模式的研究中發現,部分抗菌肽具有提高瘤胃丙酸含量、降低酸中毒風險的作用[3-4]。不同的抗菌肽具有不同的抗菌活性,從而會影響抗菌肽的瘤胃發酵調控功能,因此篩選適宜于瘤胃發酵調控的抗菌肽是替代莫能菌素等抗生素的關鍵。莫能菌素等離子載體類抗生素主要對瘤胃內革蘭氏陽性菌起抑制作用,進而抑制乙酸和丁酸的生成,提高瘤胃丙酸含量[5]。因此,選用對革蘭氏陽性菌有較強抑制作用的抗菌肽才可發揮替代莫能菌素的作用。

本研究選用一種對瘤胃細菌有抑制作用的動物源性抗菌肽,添加到飼喂高精料的荷斯坦奶公牛飼糧中,探究不同添加量的動物源性抗菌肽對荷斯坦奶公牛生長性能、瘤胃發酵指標、糞便評分、血清生化和免疫指標的影響,以期為動物源性抗菌肽替代莫能菌素發揮瘤胃發酵調控作用、確定動物源性抗菌肽在荷斯坦奶公牛飼糧中的適宜添加量提供數據支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗地點及材料

試驗地點位于南寧市廣西沃坤養殖有限公司江南區基地,所用試驗動物及粗、精飼料均由廣西沃坤養殖有限公司提供。動物源性抗菌肽由廣東某公司提供,該產品來源于健康豬腸道上皮細胞,克隆于地衣芽孢桿菌中進行表達產生,核心成分為一種具有α-螺旋結構并參與腸黏膜天然免疫的生物活性物質。

1.2 試驗設計和飼養管理

試驗采用單因素試驗設計,選擇24頭體型相近、體重為(255.35±22.43) kg的荷斯坦奶公牛,隨機分為3組,每組8個重復,每個重復1頭牛。對照組飼喂基礎飼糧,試驗組分別在基礎飼糧的基礎上添加500(A組)和800 g/t(B組)的動物源性抗菌肽。試驗期65 d,其中預試期5 d,正試期60 d。參考《肉牛飼養標準》(NY/T 815—2004)配制基礎飼糧,基礎飼糧組成及營養水平見表1。試驗牛每頭單欄飼養,組間進行間隔,早、晚(08:00、16:00)各飼喂1次,全天自由飲水。

表1 基礎飼糧組成及營養水平(風干基礎)

1.3 測定指標及方法

1.3.1 飼糧營養成分

每周采集荷斯坦奶公牛飼糧200 g,風干保存,所有風干樣品混合后粉碎過40目篩用于營養成分測定。其中,粗蛋白質(CP)含量采用Vap50s Gerhardt全自動凱氏定氮儀(GB/T 6432—2018)進行測定,粗脂肪(EE)含量采用索氏提取法(GB/T 6433—2006)進行測定,粗灰分(Ash)含量按國標法(GB/T 6438—2007)進行測定,鈣(Ca)含量根據國標法(GB/T 6436—2018)進行測定,磷(P)含量根據國標法(GB/T 6437—2002)進行測定,總能(GE)參照《飼料分析及飼料質量檢測技術》[6]中的方法進行測定,中性洗滌纖維(NDF)和酸性洗滌纖維(ADF)含量參照Van Soest等[7]的方法進行測定。

1.3.2 生長性能

試驗正式開始及結束的最后1天晨飼前對所有試驗牛逐個空腹稱重,記錄稱重數據用于計算初始體重(IBW)、終末體重(FBW)、平均日增重(ADG);在正試期內,對試驗牛每日的投料量及殘留量進行準確稱重記錄,用于計算干物質采食量(DMI)、料重比(F/G)。

1.3.3 瘤胃發酵指標

瘤胃液采集:在試驗最后1 d晨飼前,用胃管從試驗?？谇徊扇×鑫敢?棄掉剛開始采集到的瘤胃液,另抽取50 mL,經過紗布的4層過濾后,將其分裝到10 mL的凍存管中,并放置于液氮中暫存,之后-80 ℃保存,用于后續測定。

瘤胃液采集完用4層紗布過濾后,立即用便攜式pH計(雷磁PHS-25,上海儀電科學儀器股份有限公司)測定pH,每個樣品測3次,取平均值。氨態氮(NH3-N)含量參照馮宗慈等[8]改進的比色法進行測定,微生物蛋白(MCP)含量參照王孝平等[9]的考馬斯亮藍法進行測定,揮發性脂肪酸(VFA)含量參照Yeo等[10]的方法進行測定。

1.3.4 糞便評分

在正試期內,每隔1 d的10:00,按照奶牛糞便評分標準[11]對試驗牛糞便進行主觀評分并記錄。

1.3.5 血清生化和免疫指標

在試驗最后1 d,每組隨機選取6頭試驗牛,于晨飼前用一次性采血針與真空采血管采取尾靜脈血液10 mL,在3 500 r/min、10 min條件下離心分離血清。將分離好的血清置于2 mL離心管中于-20 ℃暫存,送至廣西國際壯醫醫院,用于總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、球蛋白(GLOB)、尿素氮(UN)、肌酐(CREA)、總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、葡萄糖(GLU)、谷丙轉氨酶(ALT)、谷草轉氨酶(AST)、堿性磷酸酶(ALP)、乳酸脫氫酶(LDH)等血清生化指標和免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白M(IgM)等血清免疫指標的測定。

1.4 數據分析

所有試驗數據用Excel 2021進行初步整理,采用SPSS 20.0進行單因素方差分析(one-way ANOVA),差異性結果用LSD法進行多重比較。P<0.05表示差異顯著,0.05≤P<0.10表示有變化趨勢,數據采用平均值和均值標準誤(SEM)表示。

2 結 果

2.1 動物源性抗菌肽對荷斯坦奶公牛生長性能的影響

由表2可知,各組之間荷斯坦奶公牛的FBW和DMI無顯著差異(P>0.05)。B組的ADG顯著高于對照組(P<0.05),F/G顯著低于對照組(P<0.05)。A組的ADG和F/G與對照組無顯著差異(P>0.05)。

表2 動物源性抗菌肽對荷斯坦奶公牛生長性能的影響

2.2 動物源性抗菌肽對荷斯坦奶公牛瘤胃瘤胃發酵指標及糞便評分的影響

由表3可知,各組之間荷斯坦奶公牛的瘤胃丙酸、丁酸和NH3-N含量無顯著差異(P>0.05)。與對照組相比,A、B組的瘤胃總揮發性脂肪酸(TVFA)含量有降低趨勢(P=0.080)。A、B組的瘤胃pH顯著高于對照組(P<0.05),瘤胃乙酸含量及乙丙比(A/P)顯著低于對照組(P<0.05)。B組的瘤胃MCP含量顯著高于對照組(P<0.05),A組的瘤胃MCP含量與對照組無顯著差異(P>0.05)。A、B組的糞便評分顯著高于對照組(P<0.05)。

表3 動物源性抗菌肽對荷斯坦奶公牛瘤胃發酵指標及糞便評分的影響

2.3 動物源性抗菌肽對荷斯坦奶公牛血清生化和免疫指標的影響

由表4可知,各組之間荷斯坦奶公牛的血清TP、ALB、GLOB、UN、CREA、TC、TG、GLU、IgA、IgG含量和ALT、AST、ALP活性及ALB/GLOB、AST/ALT無顯著差異(P>0.05)。A、B組的血清LDH活性顯著低于對照組(P<0.05)。B組的血清IgM含量顯著高于對照組(P<0.05),A組的血清IgM含量與對照組無顯著差異(P>0.05)。

表4 動物源性抗菌肽對荷斯坦奶公牛血清生化和免疫指標影響

3 討 論

3.1 動物源性抗菌肽對荷斯坦奶公牛生長性能的影響

本試驗結果顯示,飼糧中添加動物源性抗菌肽能夠提高荷斯坦奶公牛的ADG,降低F/G,表明動物源性抗菌肽作為飼料添加劑應用于荷斯坦奶公牛,可以使其更大限度地利用飼料中的營養物質?？咕牟坏梢詺缬泻?提高有益菌群的相對豐度,而且還能夠提升腸道絨毛高度,減少隱窩深度,擴大與飼料接觸的表面積,使得機體可以從飼糧中獲得更多的營養物質來促進生長[12]。李世易[13]在蜜蜂肽對育肥湖羊生長性能的研究中發現,不同添加量的蜜蜂肽對育肥湖羊ADG、平均日采食量(ADFI)及飼料效率均具有積極影響,能夠提高育肥湖羊生長性能;苗建軍等[14]研究發現,在育肥牦牛的飼糧中添加2.25%的小肽能夠顯著增加其ADG和ADFI,降低F/G。本研究中,B組的ADG較對照組提高了24.3%,F/G降低了18.3%,均具有顯著性差異,這與前人研究結果一致;A組的ADG和F/G與對照組相比雖無顯著性差異,但在數值上均優于對照組。造成本研究結果的原因,一方面是本試驗所用動物源性抗菌肽具有α-螺旋結構,能夠更好地插入到細菌細胞膜發揮殺菌作用,減少有害菌,營造更健康的胃腸道環境;另一方面動物源性抗菌肽因其來自動物體內,與其他源性抗菌肽相比,針對性及胃腸道的適應性都更強,并且可以耐受胃蛋白酶和胰蛋白酶等酶類的水解,在動物胃腸道內能夠更穩定的發揮作用。

3.2 動物源性抗菌肽對荷斯坦奶公牛瘤胃發酵指標及糞便評分的影響

3.2.1 動物源性抗菌肽對荷斯坦奶公牛瘤胃發酵指標的影響

瘤胃pH的穩定是瘤胃微生物生長繁殖及發揮作用的重要條件。其正常范圍在6.0～7.0,適宜范圍是6.6～7.0[15]。本試驗結果表明,添加動物源性抗菌肽的A、B組瘤胃pH顯著高于對照組,但仍在正常范圍內。這表明在荷斯坦奶公牛飼糧中添加動物源性抗菌肽能夠防止瘤胃pH的降低,利于瘤胃微生物在瘤胃內發揮正常功能。這與Ren等[16]、姚任杰[17]的研究結果相一致?？赡茉蚴莿游镌葱钥咕目梢种飘a酸菌的活性,減少有機酸產生的同時增加有機酸的消耗來促生長,使得瘤胃pH升高,預防瘤胃酸中毒的發生。

反芻動物瘤胃內的微生物將飼料中的碳水化合物等營養成分分解,產生乙酸、丙酸和丁酸等VFA供機體利用[18]。當生成乙酸時,乙酸在各種酶的催化作用下會進一步生成甲烷排出體外而浪費資源[19]。丙酸是機體內唯一能凈生成葡萄糖的物質,因此丙酸含量高時,代表向機體提供更多的有效能,促進生長。莫能菌素應用于反芻動物飼喂中,最重要的作用就是調節瘤胃內乙酸、丙酸含量,調控丙酸發酵模式的形成[20]。而瘤胃發酵模式常以A/P來作為標志,當A/P<3,即為丙酸發酵模式,而A/P>3為乙酸發酵模式[21]。本試驗結果顯示,A、B組乙酸含量及A/P顯著低于對照組,且瘤胃發酵模式為丙酸發酵模式(A/P<3),這與劉靖康[22]、高爽[23]在羔羊和山羊飼糧中添加抗菌肽的研究結果一致,也與Martinez等[24]在肉牛飼糧中添加莫能菌素的研究結果一致。但與Hino等[25]研究中使用抗菌肽來調節瘤胃發酵模式的方式不同,本試驗通過顯著減少乙酸含量來實現丙酸發酵模式的調控。造成本研究結果的原因,可能是本試驗所用動物源性抗菌肽攜帶正電荷,而瘤胃細菌攜帶負電荷,并且革蘭氏陽性菌等電點的pH(2～3)小于革蘭氏陰性菌等電點的pH(4～5),革蘭氏陽性菌會攜帶更多的負電荷,因此動物源性抗菌肽與革蘭氏陽性菌靜電吸引作用更強,表現較強殺滅作用。而乙酸產生菌為革蘭氏陽性菌,因此乙酸含量減少,A/P降低。這說明動物源性抗菌肽可以替代莫能菌素等離子載體類抗生素,應用于荷斯坦奶公牛的飼糧中改變瘤胃發酵模式,使其變為丙酸發酵模式,故而能給反芻動物提供更多的有效能,這也可能是本研究中B組荷斯坦奶公牛的生長性能顯著高于對照組的原因。A、B組奶公牛的瘤胃TVFA含量與對照組相比,下降超過10%,有降低趨勢,表明飼糧中添加動物源性抗菌肽會降低瘤胃TVFA含量,而瘤胃TVFA含量與瘤胃pH呈負相關,這也可能是本試驗A、B組瘤胃pH顯著高于對照組的原因。

NH3-N和MCP含量變化反映反芻動物瘤胃微生物對氮源的利用情況[22]。本試驗中,各組之間瘤胃NH3-N含量雖無顯著差異,但在數值上A、B組瘤胃NH3-N含量與對照組相比分別降低了7%和18%;B組瘤胃MCP蛋白含量顯著高于對照組。這與高俊玲等[26]在綿羊基礎飼糧中添加抗菌肽有降低瘤胃NH3-N含量趨勢、Liu等[27]添加抗菌肽顯著降低瘤胃NH3-N含量、高爽[23]應用復合抗菌肽顯著增加瘤胃MCP含量等的研究結果一致。造成該結果的原因,一方面可能是動物源性抗菌肽提高瘤胃菌群活躍度,利用NH3-N為氮源生成了更多的MCP;另一方面動物源性抗菌肽在瘤胃內發揮作用促進蛋白酶等的分泌,加速對飼糧中蛋白質的分解,產生更多的氨,合成更多的MCP。但該結果與陳園[28]在奶牛飼糧中添加莫能菌素提高瘤胃NH3-N含量、降低MCP含量的結果相反,具體原因還需進一步探究。

3.2.2 動物源性抗菌肽對荷斯坦奶公牛糞便評分的影響

通過對糞便顏色、結構、質地等方面的評分,可以反映瘤胃內的發酵狀況以及飼糧在牛體內的消化情況[29]。不僅如此,腹瀉作為反芻動物發生亞急性瘤胃酸中毒(SARA)的常見癥狀之一,對糞便進行評分也可作為SARA的初步判定[30-31]。當糞便pH較低,顏色偏黃,含水量多呈粥樣甚至水樣,內含氣泡,并含有未消化的超過1 cm的顆粒纖維物質,即可初步判定為SARA[32]。本研究結果顯示,A、B組糞便評分均顯著高于對照組。雖然3組試驗牛糞便評分均在2.5～3.0分之間,未達到腹瀉狀態,但添加動物源性抗菌肽組的糞便評分更接近于3分的最理想狀態。這說明動物源性抗菌肽應用于荷斯坦奶公牛的飼糧中能夠更好地促進飼糧消化,同時對瘤胃酸中毒具有一定的抑制性。

3.3 動物源性抗菌肽對荷斯坦奶公牛血清生化和免疫指標的影響

3.3.1 動物源性抗菌肽對荷斯坦奶公牛血清生化指標的影響

血清生化指標能夠綜合反映動物機體健康狀況及營養代謝水平。其中LDH在生物體內的糖酵解途徑中扮演著關鍵的角色,它的主要功能是促使乳酸和丙酮酸的氧化還原反應發生。在無氧條件下,LDH能夠催化丙酮酸轉變為乳酸[33]。LDH活性的高低反映動物機體的健康狀況,當心臟、肝臟等出現損傷時,LDH會從損傷的心肌細胞、肝臟細胞中釋放出來,造成LDH活性升高[34]。本研究中,A、B組的血清LDH活性均顯著低于對照組,表明動物源性抗菌肽應用于奶公牛飼糧中可能會對心肌產生積極影響,進而推測動物源性抗菌肽對動物機體的心臟等內臟器官的健康程度起到正向作用。本試驗結果顯示,在TP、UN、ALT、AST、ALP、TG、GLU等血清生化指標方面,試驗組和對照組無顯著差異,表明飼糧中添加動物源性抗菌肽對荷斯坦奶公牛健康狀況無不良影響,可以作為飼料添加劑應用于荷斯坦奶公牛等后備牛的生產中。

3.3.2 動物源性抗菌肽對荷斯坦奶公牛血清免疫指標的影響

IgA、IgG和IgM等血清免疫球蛋白能夠反映機體抵抗細菌及病毒等病原體入侵的能力,其含量增加代表機體免疫功能增強。楊顏銥等[35]在川中黑山羊基礎飼糧中添加抗菌肽,顯著增加了血清免疫球蛋白的含量;孔祥雨[36]在麻羊飼喂中應用抗菌肽,顯著提高了血清IgM含量,以前關于抗菌肽的應用研究也證實了它具有提高免疫球蛋白含量的作用[37-38]。本試驗結果顯示,B組的血清IgM含量相較于對照組顯著升高,A、B組血清IgA含量相較于對照組也略有升高,與前人研究結果一致。

4 結 論

① 飼糧中添加800 g/t的動物源性抗菌肽能夠顯著提高荷斯坦奶公牛的ADG,顯著降低F/G。

② 飼糧中添加500和800 g/t的動物源性抗菌肽能夠顯著提高荷斯坦奶公牛的瘤胃pH,顯著降低瘤胃乙酸含量及A/P,顯著提高糞便評分;飼糧中添加800 g/t的動物源性抗菌肽能夠顯著提高瘤胃MCP含量。

③ 飼糧中添加500和800 g/t的動物源性抗菌肽能夠顯著降低荷斯坦奶公牛的血清LDH含量,飼糧中添加800 g/t的動物源性抗菌肽能夠顯著提高血清IgM含量。

④ 綜合本試驗結果,動物源性抗菌肽應用于奶公牛生產中,能夠提高荷斯坦奶公牛的生長性能,調控瘤胃發酵模式為丙酸發酵,對瘤胃酸中毒具有一定的預防作用,并且800 g/t的添加量作用效果更好。