發酵玉米芯對肉牛生長性能、瘤胃發酵參數及菌群的影響

劉依莎 張巧娥 許 遲 吳仙花 李 濤 梁小軍

(1.寧夏大學動物科技學院,銀川 750021;2.中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所動物營養學國家重點實驗室,北京 100193;3.寧夏大北農科技實業有限公司,銀川 750200;4.寧夏農林科學院動物科學研究所,銀川 750002)

反芻動物瘤胃內定植了多種多樣的微生物,包括細菌、古菌和真菌以及原蟲等。這些微生物參與飼料消化,且其互作維持著瘤胃發酵環境的穩定,對反芻動物機體的生理機能具有重要的意義[1]。玉米經脫穗處理后的玉米芯為常見農副產品,其成分主要是大量的木質素及纖維素、葡萄糖和淀粉等[2]。由于玉米芯較高的木質素含量,其經干燥、粉碎處理后在反芻動物瘤胃內仍不易消化吸收,且適口性較差,常出現挑食、剩料等問題,極大影響了玉米芯作為粗飼料的利用率。

發酵處理是目前改善飼料品質的常用方式。該處理能夠降解抗營養因子、破壞木質纖維結構,進而改善飼料原料適口性,提升飼料營養價值。此外,發酵工藝中引入的益生菌能夠促進反芻動物瘤胃健康,改善瘤胃微生態環境[3]。李元新等[4]研究顯示,用發酵蘋果渣飼料飼喂肉牛能夠顯著提高肉牛的平均日增重,極顯著降低料重比;極顯著提高血清中的生長激素(GH)、白細胞介素-6(IL-6)含量;顯著降低血清中白蛋白、尿素氮含量。彭忠利等[5]研究發現,在肉牛飼糧中添加以玉米黃漿液、噴漿玉米纖維、醬糟和木薯渣等食品工業廢棄物為原料的發酵飼料能夠提高肉牛的采食量、平均日增重及粗纖維消化率。Rodrigues等[6]和Dagaew等[7]的研究也獲得了與上述研究一致結果。張國玉等[8]研究發現,添加發酵番茄皮渣能改善飼糧的適口性,顯著提高新疆褐牛的平均日增重。侯鵬霞等[9]研究發現,在肉牛飼糧中添加發酵枸杞枝條能夠提高育肥期肉牛的平均日增重及血清免疫球蛋白含量。本試驗在西門塔爾雜交牛飼糧中添加不同水平發酵玉米芯,旨在探究發酵玉米芯對肉牛生長性能、瘤胃發酵參數的影響,并運用高通量測序技術測定其對瘤胃菌群結構和多樣性的影響,為發酵玉米芯在反芻動物生產中的應用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 發酵玉米芯的制作

發酵玉米芯的底物由50%玉米芯、40%馬鈴薯渣、8%甜菜絲和2%復合菌混合糖蜜組成;發酵菌液由乳酸菌、釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)等十幾種微生物制成。制作流程為:將未經處理的玉米穗軸用去皮機將玉米皮和玉米芯剝離后粉碎至5 mm的顆粒狀,馬鈴薯渣和甜菜絲作為載體加入混合均勻,將發酵菌液于糖蜜中活化處理后均勻噴灑于發酵底物中,隨后裝窖。在填充前,將有機酸均勻地噴灑在窖池以防止玉米芯霉變,并保證發酵期內的新鮮度。在加工裝窖過程中,每8 h噴灑1次有機酸,封窖前在頂層噴灑有機酸覆蓋玉米芯后封窖保存。發酵溫度為35～38 ℃,發酵15 d后開窖并進行裹包存放。使用MP2000-X裹包機(ORKEL,挪威)和裹包膜進行裹包處理,配電機功率為55 kW,捆包直徑×寬度為115 cm×120 cm,捆包體積為1.25 m3。玉米芯發酵前后常規營養成分比較見表1。

表1 玉米芯發酵前后常規營養成分比較

1.2 試驗時間與地點

飼養試驗于2022年6—9月在寧夏壹泰牧業有限公司進行。

1.3 試驗動物與試驗設計

選用60頭13月齡、體重(395±32) kg的健康西門塔爾雜交牛作為試驗動物,將其隨機分為3組,每組20個重復,每個重復1頭牛,以單欄模式飼養。對照組飼喂不添加發酵玉米芯的全混合日糧(TMR),試驗1組飼喂添加10%發酵玉米芯的全混合日糧,試驗2組飼喂添加20%發酵玉米芯的全混合日糧。根據NASEM(2016)肉牛飼養標準配制全混合日糧,3組飼糧營養水平基本一致,飼糧組成及營養水平見表2。采用小型飼料混合機將飼糧混合均勻后飼喂,試驗牛只全天自由活動、自由采食和飲水。試驗共持續100 d,其中預試期7 d,正試期93 d。

表2 飼糧組成及營養水平(干物質基礎)

1.4 樣品采集

在飼養試驗結束當天,從每組隨機選取10頭試驗牛,晨飼前從口腔采集瘤胃液。首先將試驗牛只趕入防疫通道保定欄內,以牛鼻鉗和粗麻繩固定頭部后,用胃管式采樣器采集瘤胃液,瘤胃液取出后棄去最初50 mL(避免唾液影響),經4層紗布過濾后立即使用便攜式pH酸度計(TPS公司,澳大利亞)測定pH,然后分裝到10支5 mL無菌凍存管中,投入液氮罐內冷凍,迅速帶回實驗室置于-80 ℃冰箱內保存,用于微生物DNA提取和瘤胃揮發性脂肪酸及發酵參數的測定。

1.5 測定指標與方法

1.5.1 主要營養成分測定

干物質(DM)含量參考GB/T 6435—2014[10]測定,粗蛋白質(CP)含量參考GB/T 6432—2018[11]測定,粗脂肪(EE)含量參考GB/T 6433—2006[12]測定,中性洗滌纖維(NDF)含量參照GB/T 20806—2006[13]測定;酸性洗滌纖維(ADF)含量參考NY/T 1459—2007[14]測定;鈣(Ca)含量參考GB/T 6436—2018[15]測定,總磷(TP)含量參考GB/T 6437—2018[16]測定。

1.5.2 生長性能測定

每天07:00和17:00進行飼喂,于晨飼前收集前1天的剩料并稱量記錄,用于計算試驗期內各組的平均日采食量。試驗牛只于試驗正式開始前1天空腹測定初始體重,在正試期第93天試驗結束后空腹測定終末體重,計算各組的平均日增重和料重比。

1.5.3 瘤胃發酵參數測定

瘤胃液氨態氮(NH3-N)濃度按照馮宗慈等[17]的方法測定,微生物蛋白(MCP)濃度采用差速離心法(考馬斯亮藍法),參照徐曉鋒等[18]的操作測定。利用氣相色譜儀(7890A,Agilent,美國)測定瘤胃液各VFA的濃度,計算總揮發性脂肪酸(TVFA)的濃度以及各VFA的摩爾百分比。

1.5.4 瘤胃微生物多樣性測定

采用OMEGA Soil DNA Kit (M5635-02,Omega Bio-Tek,美國)試劑盒提取瘤胃液DNA。對抽提完成的DNA進行0.8%瓊脂糖凝膠電泳判斷分子大小,利用Nanodrop對DNA進行定量。30個微生物DNA樣本通過Illumina公司的MiSeq PE-300平臺進行測序(由上海拜譜生物醫藥科技有限公司完成),對高通量測序數據進行分析。

1.6 數據統計與分析

利用SPSS 19.0軟件進行單因素方差分析,并采用Duncan氏法進行多重比較,數據均以平均值±標準差表示。以P<0.05表示差異顯著。

2 結 果

2.1 發酵玉米芯對肉牛生長性能的影響

由表3可知,試驗1、2組的平均日增重和平均日采食量顯著高于對照組(P<0.05),同時試驗2組還顯著高于試驗1組(P<0.05);試驗1、2組料重比顯著低于對照組(P<0.05),同時試驗2組還顯著低于試驗1組(P<0.05)。

表3 發酵玉米芯對肉牛生長性能的影響

2.2 發酵玉米芯對肉牛瘤胃發酵參數的影響

由表4可知,肉牛飼喂發酵玉米芯后瘤胃液pH無顯著變化;2個試驗組瘤胃液總VFA濃度均顯著低于對照組(P<0.05);各組之間瘤胃液乙酸、丙酸、戊酸摩爾百分比及乙酸/丙酸值無顯著差異(P>0.05);2個試驗組瘤胃液丁酸摩爾百分比顯著低于對照組(P<0.05),而異丁酸和異戊酸摩爾百分比均顯著高于對照組(P<0.05);瘤胃液NH3-N濃度以試驗1組最高,試驗2組次之,對照組最低,組間差異顯著(P<0.05);試驗2組瘤胃液MCP濃度顯著高于對照組和試驗1組(P<0.05)。

表4 發酵玉米芯對肉牛瘤胃發酵參數的影響

2.3 發酵玉米芯對肉牛瘤胃菌群多樣性的影響

2.3.1 Venn圖

Illumina MiSeq測序后,將30個瘤胃液樣品中獲得的序列進行操作分類單元(OTUs)聚類,剔除稀有OTUs后,對樣品進行OTUs統計。由圖1可知,對照組共獲得了5 395個OTUs,試驗1組共獲得了5 747個OTUs,試驗2組共獲得了5 793個OTUs,3組共有OTUs為2 179個,對照組特有OTUs為2 077個,試驗1組特有OTUs為2 261個,試驗2組特有OTUs為2 568個。上述結果說明3組肉牛瘤胃菌群組成存在差異。

D:對照組;T1:試驗1組;T2:試驗2組。下圖同。

2.3.2 α多樣性分析

由表5可知,3組肉牛瘤胃菌群的Shannon指數、Simpson指數、Ace指數和Chao指數差異均不顯著(P>0.05)。

表5 瘤胃菌群α多樣性指數

2.3.3 β多樣性分析

β多樣性分析是通過對3組肉牛瘤胃菌群的物種多樣性進行比較分析,探索3組樣品間菌群組成的相似性或差異性。主坐標分析(PCoA)可顯示每個樣品間的差異,物種組成越大,各樣品之間的距離越遠。由圖2可知,主成分1貢獻率為29.7%,主成分2貢獻率為20.2%,試驗2組與對照組樣品距離較遠,說明這2組菌群多樣性差異較大。

圖2 PCoA圖

2.4 發酵玉米芯對肉牛瘤胃菌群結構的影響

本試驗的30個樣品經過比對共得到25個門,47個綱,80個目,111個科,204個屬的細菌。

由表6可知,在門水平上,3組均由擬桿菌門(Bacteroidetes)、厚壁菌門(Firmicutes)、軟壁菌門(Tenericutes)、浮霉菌門(Planctomycetes)、廣古菌門(Euryarchaeota)以及其他相對豐度<1%的菌門組成。3組中Bacteroidetes均為第一優勢菌門,試驗1、2組Bacteroidetes的相對豐度顯著高于對照組(P<0.05);第二優勢菌門為Firmicutes,試驗2組Firmicutes的相對豐度顯著低于對照組(P<0.05);另外,試驗2組Euryarchaeota的相對豐度顯著低于對照組(P<0.05);其他菌門的相對豐度3組間差異不顯著(P>0.05)。

表6 發酵玉米芯對肉牛瘤胃菌群門水平上(相對豐度>1%)組成的影響

由表7可知,在屬水平上,對照組的優勢菌屬依次為普雷沃氏菌屬(Prevotella)、擬桿菌目未鑒定屬(unidentified Bacteroidales)、梭菌目未鑒定屬(unidentified Clostridiales)、擬桿菌目S24-7未鑒定屬(unidentified Bacteroidales S24-7)、普雷沃氏菌科未鑒定屬(unidentified Prevotellaceae)、瘤胃球菌屬(Ruminococcus);試驗1組的優勢菌屬依次為unidentified Bacteroidales、Prevotella、unidentified Bacteroidales S24-7、unidentified Prevotellaceae、擬桿菌目RF16未鑒定屬(unidentified Bacteroidales RF16)、unidentified Clostridiales;試驗2組的優勢菌屬依次為unidentified Bacteroidales、Prevotella、unidentified Bacteroidales S24-7、擬桿菌目BS11未鑒定屬(unidentified Bacteroidales BS11)、unidentified Bacteroidales RF16、unidentified Clostridiales。3組的優勢菌屬相對豐度均在5%以上。試驗1、2組unidentified Prevotellaceae的相對豐度顯著高于對照組(P<0.05),同時試驗1組還顯著高于試驗2組(P<0.05);對照組Ruminococcus和甲烷短桿菌屬(Methanobrevibacter)的相對豐度顯著高于試驗1、2組(P<0.05);試驗2組的梭菌目未分類屬(unclassified Clostridiales)和毛螺菌科未鑒定屬(unidentified Lachnospiraceae)的相對豐度顯著低于對照組和試驗1組(P<0.05)。

表7 發酵玉米芯對肉牛瘤胃菌群屬水平上(相對豐度>1%)組成的影響

3 討 論

3.1 發酵玉米芯對肉牛生長性能的影響

肉牛的生長性能在養殖中最為重要,其主要指標為采食量、日增重、料重比。本試驗中,與對照組相比,試驗1、2組的平均日采食量和平均日增重顯著升高,料重比顯著降低。這與趙凱強等[19]在肉牛飼糧中添加發酵玉米芯能夠顯著提高肉牛平均日增重和平均日采食量的結果一致。肉牛平均日增重升高可能和發酵玉米芯中的枯草芽孢桿菌所產生的酶類促進了飼料營養成分的分解,進而提高了飼料消化率和肉牛的育肥效果有關;此外,乳酸菌在發酵過程中所產生的乳酸能夠降低動物腸道pH,同時其產生的維生素、酶和氨基酸等營養物質[20]可能也與飼料效率的提高有關。

3.2 發酵玉米芯對肉牛瘤胃發酵參數的影響

反芻動物的瘤胃發酵情況與瘤胃微生物區系直接相關,而這些微生物僅在特定的pH范圍內生長和活動,因此瘤胃液pH的維持對于反芻動物的正常生理功能至關重要。一般而言,瘤胃液通常為酸性,pH為5.5～7.5,而本試驗各組牛只的瘤胃液pH維持在6.75～6.81,表明發酵玉米芯未帶來酸中毒風險。

VFA是反芻動物瘤胃中碳水化合物發酵的主要產物,是能量來源的重要渠道,包括乙酸、丙酸和丁酸等。乙酸、丙酸和丁酸在反芻動物瘤胃內占總揮發性脂肪酸的95%左右。本研究中,2個試驗組瘤胃液丁酸摩爾百分比顯著低于對照組,與Foley等[21]得出的發酵飼料能夠抑制瘤胃發酵及VFA產生的結論一致,其原因可能是發酵對玉米芯纖維的分解限制了瘤胃丁酸的主要來源,減少了纖維降解菌生長所需的底物。

NH3-N主要為瘤胃微生物生長提供氮源。Norrapoke等[22]研究發現,發酵木薯渣飼喂婆羅門雜交肉牛能夠顯著增加瘤胃液NH3-N濃度與MCP的合成。Devant等[23]、Van Dung等[24]和Ghorbani等[25]證明,隨著飼糧中蛋白質水平的提高,瘤胃液中NH3-N濃度增加。本試驗中,試驗1、2組瘤胃液NH3-N濃度顯著高于對照組,這與上述研究結果一致,表明玉米芯經過發酵處理后,其蛋白質具有更高的利用效率。

MCP是反芻動物小腸氨基酸主要的來源,添加益生菌可顯著提高瘤胃液MCP濃度。本試驗中,試驗2組瘤胃液MCP濃度顯著高于對照組和試驗1組,說明發酵玉米芯能夠提高瘤胃內MCP產量。

3.3 發酵玉米芯對肉牛瘤胃菌群的影響

反芻動物的瘤胃微生物群落復雜多樣,由多種細菌、真菌原生動物和古細菌等組成[26]。ACE指數和Chao指數能夠反映瘤胃菌群的豐富度,Simpson指數越小,Shannon指數越大,說明瘤胃菌群的多樣性越大。本研究中,各組的ACE指數、Chao指數、Simpson指數和Shannon指數均無顯著差異,表明飼糧里添加發酵玉米芯對肉牛瘤胃菌群多樣性無顯著影響。

劉垚等[27]研究發現,在西門塔爾雜交牛瘤胃菌群中,門水平上的優勢菌群有Bacteroidetes和Firmicutes,這與本試驗結果相同。本試驗中,各組肉牛瘤胃菌群中的優勢菌門均為Bacteroidetes,且其相對豐度隨發酵玉米芯添加水平的增加而增加,這和王錦等[28]和李茂龍等[29]得出的飼喂發酵飼料或益生菌會提高反芻動物生長性能與瘤胃菌群中Bacteroidetes相對豐度的結果一致。

Prevotella是瘤胃中最主要的蛋白質降解菌之一,它不僅能夠降解瘤胃中的蛋白質和淀粉,還能夠發酵糖和氨基酸[30]。本試驗中,Prevotella在各組肉牛瘤胃菌群中均為優勢菌屬,與前人研究結果[31]一致;此外,試驗1、2組unidentified Prevotellaceae的相對豐度顯著高于對照組。郭威等[32]發現,飼喂發酵玉米秸稈的綿羊瘤胃中Prevotella相對豐度更高,這與本試驗結果。

Ruminococcus是動物胃腸道內重要的纖維分解菌,能夠產生大量纖維素酶、半纖維素酶以及木聚糖酶,消化粗飼料中的纖維素和半纖維素。本試驗中,3組肉牛瘤胃菌群中都含有Ruminococcus,對照組Ruminococcus的相對豐度顯著高于試驗1、2組,提示發酵處理降低了玉米芯的纖維水平,且發酵過程中引入的其他纖維分解菌可能導致Ruminococcus因底物競爭而被抑制。而擬桿菌目的一些未鑒定屬的相對豐度隨著發酵玉米芯添加水平的增加有升高趨勢,可能是隨著發酵玉米芯添加水平的增加,底物含量及成分的差異刺激了擬桿菌屬的生長。上述結果表明發酵玉米芯可能引起了瘤胃菌群組成結構的改變。

4 結 論

① 發酵玉米芯能提高肉牛的平均日增重和平均日采食量,提高飼料效率。本試驗條件下,以肉牛全混合日糧中添加20%發酵玉米芯時效果最佳。

② 發酵玉米芯能夠改善肉牛瘤胃發酵環境,提升瘤胃液NH3-N和MCP濃度,并影響瘤胃菌群在門水平和屬水平上的組成。