基于代謝組學探究調教訓練對速步型伊犁馬血漿代謝物的影響

李鵬程 曾亞琦,2 王建文,2 陳偉剛 巴音別勒克 王川坤 楊利平 韓紫祥 薛宇恒 孟 軍,2* 姚新奎,2*

(1.新疆農業大學動物科學學院,烏魯木齊 830052;2.新疆馬繁育與運動生理重點實驗室,烏魯木齊 830052;3.伊犁哈薩克自治州昭蘇馬場畜牧獸醫科,昭蘇 835600)

伊犁馬原產于新疆,具有繁殖性能好和力速兼備等優點[1-2],在我國速步、速度賽中取得了優異成績。中國進行的速歩賽主要以騎乘為主,比賽中常見的引用品種主要為法國速步馬、奧爾洛夫馬和美國速步馬等[3]。伊犁馬是中國速步賽馬中表現較好的品種,但與世界著名速歩賽馬品種相比其速步性能還有一定的差距,調教訓練水平有待進一步提高,以提高速步性能。

Pohjanen等[4]于2007年首次對運動代謝組的多元模型進行了研究,發現其中有402種血清代謝物可用于預測運動前或運動后的狀態。Berton等[5]通過代謝組學研究方法發現,單次抗阻訓練后血清中乳酸、丙酮酸、琥珀酸和多種丁酸酯的濃度增加,氨基酸的濃度降低。Enea等[6]通過代謝組學方法研究發現,單次30 s功率自行車沖刺后30 min,尿液中乳酸、丙酮酸和琥珀酸的濃度升高,可作為運動前和運動后的判別指標。Jang等[7]評估急性運動對馬骨骼肌代謝組影響的研究中,使用核磁共振波譜確定了35種代謝物,并顯示了運動誘導對氨基酸和能量代謝相關物質的改變。Klein等[8]對8匹美國速步馬進行12周的運動訓練后,用活檢針取其骨骼肌進行非靶向代謝組學分析,發現訓練顯著提高了馬的最大有氧和跑步能力,并顯著改變了骨骼肌代謝組。雖然代謝組學技術在運動領域的研究已經應用了十多年,但目前只有少數試驗研究了訓練狀態、比賽經驗等對馬匹代謝組的影響,在訓練階段、運動方式和品種等方面代謝組學研究仍存在空白,而代謝組學篩選出的差異代謝物可以提供關于馬匹訓練時的機體狀態,有助于在高強度調教訓練間更好地管理馬匹[9]。

本研究以速步型伊犁馬為研究對象,采集伊犁馬調教訓練前后的血液樣本,應用液相色譜-質譜(LC-MS)技術分析血漿代謝物,篩選出標志性的差異代謝物,以期為速步型伊犁馬運動訓練的監控以及訓練計劃的制定提供更多的理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

本試驗以新疆維吾爾自治區伊犁哈薩克自治州昭蘇馬場的6匹2歲速步型伊犁馬公馬為試驗對象。

1.2 試驗條件

所有馬匹體尺相近、健康狀態良好,處于同一環境條件下,試驗間馬匹分圈飼養,分別于07:00、12:30、16:00、19:30、24:00時進行青干草飼喂,并分別于07:30和20:30將準備好的精料飼喂給馬匹,全天自由飲水,每天定期給馬舍消毒和清理糞便。試驗馬匹統一開展為60 d的調教訓練。試驗跑道為昭蘇縣天馬文化旅游園沙質跑道,寬28 m,周長2 000 m。具體調教訓練方案見表1。

表1 專項速步型伊犁馬調教訓練方案

1.3 血樣采集

分別在調教訓練前(第0天)和調教訓練后(第60天)晨飼3 h后采集6匹速步馬的血樣,立即進行3 500 r/min離心15 min,取血漿于2 mL凍存管,液氮保存,用于血漿代謝組檢測。

1.4 血漿代謝組檢測

所有樣本在室溫條件下解凍,取100 μL解凍后的血漿樣品轉移至EP管中加入400 μL的80%甲醇水溶液,渦旋振蕩,冰浴靜置5 min,15 000×g、4 ℃離心15 min得上清;取一定量的上清加質譜級水稀釋至甲醇含量為53%;15 000×g、4 ℃離心15 min,收集上清,在LC-MS上進行分析。以53%甲醇水溶液作為空白樣本。液相色譜中流動相的梯度洗脫程序見表2。

1.5 數據處理與分析

使用KEGG數據庫、HMDB數據庫和LIPID MAPS數據庫對鑒定到的代謝物進行注釋。多元統計分析部分,使用代謝組學數據處理軟件metaX對數據進行轉換后進行主成分分析(PCA)和偏最小二乘法判別分析(PLS-DA),進而得到每個代謝物的變量投影重要度(VIP)值。計算代謝物在2組間的差異倍數(fold change,FC)。差異代謝物篩選的默認標準為VIP>1,P值<0.05且FC≥1.5或FC≤0.667。

2 結果與分析

2.1 PCA

由圖1可知,在正離子模式下,主成分1(PC1)=33.78%、主成分2(PC2)=11.50%;在負離子模式下,PC1=26.72%、PC2=12.72%,各散點均可以緊密地聚集在一起,說明本試驗質量控制很好,并且調教訓練前后具有一定的離散趨勢,可以進行區分,表明調教訓練前后血漿代謝物發生了明顯的變化。

A:正離子模式下PCA圖;B:負離子模式下PCA圖。Q1表示調教訓練前,Q3表示調教訓練后。下圖同。

2.2 PLS-DA

為了更好地區分速步型伊犁馬調教訓練前后血漿代謝物的變化,在PCA的基礎之上進一步進行PLS-DA。由圖2可知,在正離子模式下,R2Y=1.00、Q2Y=0.77;在負離子模式下,R2Y=1.00、Q2Y=0.89。模型中R2Y均高于0.5,Q2Y介于0.6～1.0,表明模型解釋率高,預測能力可以接受。對正、負離子模式數據PLS-DA模型進行置換檢驗。在正離子模式下,Q2截距為-0.68(Q2<0);在負離子模式下,Q2截距為-0.69(Q2<0)。以上模型Q2均小于1,表明PLS-DA模型未過度擬合,伊犁馬在調教訓練前后血漿代謝物存在差異。

A:正離子模式下PLS-DA得分散點圖;B:正離子模式下PLS-DA排序驗證圖;C:負離子模式下PLS-DA得分散點圖;D:負離子模式下PLS-DA排序驗證圖。R2Y表示模型的解釋率,Q2Y表示模型的預測能力。

2.3 不同訓練階段速步型伊犁馬血漿差異代謝物篩選

由表3、表4可知,伊犁馬在調教訓練后血漿中原亮氨酸、癸二酸、尿囊酸、順烏頭酸、核黃素磷酸鈉等16種物質的濃度顯著高于調教訓練前(P<0.05),腺苷酸、雄酮、麥角硫因和對羥基苯甲醇等10種物質的濃度顯著低于調教訓練前(P<0.05)。

表3 伊犁馬調教訓練前后血漿差異代謝物(正離子模式下)

表4 伊犁馬調教訓練前后血漿差異代謝物(負離子模式下)

2.4 代謝通路分析

對伊犁馬在調教訓練后血漿中差異代謝物進行KEGG通路富集分析,結果見圖3。伊犁馬在調教訓練后血漿中差異代謝物富集到的代謝途徑有核黃素代謝(riboflavin metabolism)、腎素分泌(renin secretion)、苯丙氨酸代謝(phenylalanine metabolism)、咖啡因代謝(caffeine metabolism)、腺苷酸活化蛋白激酶信號通路(AMPK signaling pathway)、檸檬酸循環(citrate cycle)和組氨酸代謝(histidine metabolism)等。

A:正離子模式下KEGG通路富集氣泡圖;B:負離子模式下KEGG通路富集氣泡圖。

3 討 論

3.1 速步型伊犁馬的糖代謝

腺苷酸(AMP)可由三磷酸腺苷(ATP)失去1個焦磷酸基團得到,它們的比例在一般生理狀況下處于一種比較穩定的狀態[10]。本研究發現,調教訓練前伊犁馬血漿中腺苷酸(AMP)濃度顯著高于調教訓練后,這可能表明了伊犁馬調教訓練前的血漿AMP/ATP顯著高于調教訓練后,即調教訓練后伊犁馬血漿中ATP濃度高于調教訓練前。有研究表明,16周高強度間歇(HIIT)運動可以提高增齡大鼠血漿中ATP濃度,從而提高增齡大鼠最大攝氧量(VO2max)和有氧運動能力[11]。這與本研究結果相似,說明調教訓練增強了伊犁馬的供能能力。TCA循環是三大能源物質徹底氧化的最終代謝途徑,也是大多數活細胞中的主要代謝途徑[12]。順烏頭酸是三羧酸(TCA)循環的重要中間產物,可以反映有氧代謝的活躍程度。有研究發現,經過運動后,TCA循環中間產物主要在血液和尿液中增加,在血液中,TCA循環中間產物的濃度會顯著增加[13]。本研究發現,調教訓練后伊犁馬血漿中順烏頭酸的濃度顯著高于調教訓練前,這可能是由于調教訓練加快了伊犁馬有氧代謝的活躍程度,從而增加了TCA循環的中間產物順烏頭酸的濃度。

3.2 速步型伊犁馬的氨基酸代謝

支鏈氨基酸是人類和許多動物的必需營養素。異亮氨酸作為支鏈氨基酸之一,在整個人體的生理功能(例如生長、免疫力、蛋白質代謝、脂肪酸代謝和葡萄糖轉運)中至關重要。異亮氨酸可以改善免疫系統,包括免疫器官和反應性物質等[14]。本研究發現,調教訓練后伊犁馬血漿中異亮氨酸的濃度顯著高于調教訓練前,這可能表示調教訓練提高了伊犁馬的免疫能力。苯丙酮酸對動物機體的生長發育具有重要的調節作用[15]。有研究發現,給小鼠飼糧添加苯丙酮酸能顯著提高小鼠爪握力,增加其運動耐力和爆發力[16]。本研究發現,調教訓練后伊犁馬血漿中苯丙酮酸的濃度顯著高于調教訓練前,說明調教訓練增加了伊犁馬的耐力和爆發力。麥角硫因是稀有氨基酸的一種,具有優良的抗炎性及抗氧化性[17]。有學者發現,給小鼠飼糧中添加麥角硫因可以顯著地改善小鼠的體力消耗時間,提高了它的有氧運動能力,更好的管理運動引起的肌肉損傷和恢復[18]。另有學者發現,補喂麥角硫因會緩解馬的應激反應,對其訓練產生積極作用[19]。本研究發現,調教訓練前伊犁馬血漿中麥角硫因的濃度顯著高于調教訓練后,這可能是由于調教訓練后期伊犁馬已基本適應,因調教訓練受到的應激減少,伊犁馬機體無需分泌更多的麥角硫因來緩解應激,具體機制還需進一步研究。

3.3 速步型伊犁馬的脂質代謝

機體內血睪酮濃度與運動能力密切相關,雄酮是睪酮代謝物之一,以葡糖醛酸抱合體的形式排出[20]。有研究表明,19名U18(即18周歲以下)男子運動員在經過為期12周的最大力量和單次爆發力訓練后尿中雄酮濃度顯著下降[21]。董成[22]的研究也發現,運動員在單次爆發力訓練周時其血清睪酮濃度達到最低。本研究結果與其相似,調教訓練后伊犁馬血漿中雄酮的濃度顯著低于調教訓練前,這表明調教訓練增加了伊犁馬的運動爆發能力。左旋甲狀腺素可以通過轉變為游離三碘甲狀腺原氨酸(FT3)進而促進人體代謝[23]。有研究表明,服用左旋甲狀腺素不會對身體成分、能量消耗和呼吸商產生積極影響,但它可以提高力量、活動能力和耐力表現[24]。本研究發現,調教訓練后伊犁馬血漿中左旋甲狀腺素的濃度顯著高于調教訓練前,說明調教訓練提高了伊犁馬的運動能力和耐力表現。

3.4 速步型伊犁馬的其他物質代謝

當機體能量極度匱乏時,馬尿酸可以抑制骨骼肌對葡萄糖的使用,并促進能量物質優先供應機體最重要的生命活動,激發身體的保護性抑制機制[25]。有研究發現,馬匹運動后血漿中馬尿酸的濃度會顯著上升[26]。在本研究中,調教訓練后伊犁馬血漿中馬尿酸的濃度顯著高于調教訓練前,這可能說明,隨著調教訓練的進行,伊犁馬體內的馬尿酸濃度也隨之增加,將能源物質優先供應給大腦、神經等重要活動?？煽蓧A是可可中濃度最高的甲基黃嘌呤[27]。有研究表明,當可可堿的劑量為600 mg/kg時,可提高受試者3 km跑步機的跑步速度[28]。本研究發現,調教訓練后伊犁馬血漿中可可堿的濃度顯著高于調教訓練前,說明調教訓練提高了伊犁馬的運動速度。漆黃素是一種具有多種生物活性的天然類黃酮物質,具有很強的抗氧化活性和抗炎能力[29]。有學者發現,給帕金森病模型小鼠灌胃漆黃素不僅可以顯著提高小鼠的運動總距離、運動速度,降低爬桿總時間、縮短轉頭時間,還增加了小鼠的抗氧化能力[30]。Carbonare等[31]也發現,漆黃素可防止炎癥引起的骨質流失,從而對成骨有著積極作用。本研究發現,調教訓練后伊犁馬血漿中漆黃素的濃度顯著高于調教訓練前,說明調教訓練增強了伊犁馬的抗炎、抗氧化能力和骨骼的發育。

4 結 論

本試驗通過對調教訓練前后速步型伊犁馬血漿代謝物進行分析發現,調教訓練使血漿中的原亮氨酸、癸二酸、尿囊酸、順烏頭酸、核黃素磷酸鈉等16種物質的濃度顯著升高,腺苷酸、雄酮、麥角硫因和對羥基苯甲醇等10種物質的濃度顯著降低;調教訓練增強了速步型伊犁馬的有氧運動能力和耐力,降低了應激反應,涉及的代謝通路有核黃素代謝、腎素分泌、苯丙氨酸代謝、咖啡因代謝、AMPK信號通路、檸檬酸循環和組氨酸代謝等。