奶牛乳源外泌體提取方法的優化及效果評價

趙 瑩 王靖雷 王 萌 王立斌,2 張 倩 李志杰 馬 鑫 余四九,2 潘陽陽,2*

(1.甘肅農業大學動物醫學院,蘭州 730070;2.甘肅省牛羊胚胎工程技術研究中心,蘭州 730070 )

外泌體是一種外形呈圓形或橢圓形,有部分凹陷,樣似“茶托”形,介于30～200 nm雙層膜結構的納米級細胞外囊泡[1]。外泌體是由活細胞內出芽方式分泌產生形成的內吞小體,并以胞吐方式釋放到細胞間隙,當受體細胞接收后發揮作用,從而達到細胞間信息交流[2]。外泌體可存在于機體大部分體液中,如乳液、唾液、羊水、腹水、血液、尿液、腦脊液等[3],且免疫系統細胞、脂肪細胞、腫瘤細胞、內皮細胞、間質細胞、肥大細胞、成纖維細胞等許多細胞均可分泌外泌體[4]。外泌體由脂質、蛋白質和核酸(DNA、mRNA、miRNA、lncRNA、circRNA等)組成[5],因有脂質雙分子層保護,可穩定存在。

荷斯坦奶牛乳中含豐富外泌體[6],由乳腺上皮細胞分泌產生,并包裹蛋白質、核酸、聚糖、脂質等具有生物活性的內含物,內含物被受體接收后進行細胞間信息傳遞、細胞傳遞、血管新生、免疫應答、炎癥反應、抗氧化、腫瘤細胞生長等[7]。Munagala等[8]研究發現,乳源外泌體可作為藥物載體達到靶向治療作用;Hock等[9]研究發現,乳源外泌體可提高腸道上皮細胞活力,促進細胞增殖并刺激腸道干細胞活性的提高,用乳源外泌體給藥可防止壞死性結腸炎發生;Samuel等[10]研究發現,乳源外泌體富含與免疫應答和生長有關的蛋白質,通過調節這些蛋白質可調節機體免疫機能和生長修復;駱駝乳來源外泌體可抑制乳腺腫瘤細胞生長[11];牦牛乳源外泌體可提升細胞抗低氧能力[12];Li等[13]研究發現,乳源外泌體可作為包封親水性大分子藥物并口服的載體,可見開發乳源外泌體具有重要的生物學和商業價值,雖通過細胞培養也可收集到大量外泌體,但操作過程耗時費力,需要特殊設備,成本高,獲取量少且質量不穩定,不適用于用量大的試驗研究。因此,眾多試驗通過建立不同的技術方法,從乳汁中分離提取大量外泌體。

目前已知外泌體可通過差速超速離心法、化學沉淀法、蔗糖密度梯度離心法、超濾分離法、尺寸排阻色譜法、免疫親和法、微流控法和其他商業試劑盒等提取方法得到。超濾分離法主要通過濾膜孔徑不同來分離外泌體,該方法操作簡單、耗時短,且保證外泌體生物活性,但易堵塞濾膜,與外泌體同等大小的蛋白質雜質與之混雜,且過膜壓力會對外泌體造成機械性損傷,導致分離純度低,因此僅適用于尿液、細胞培養液等的外泌體提取;尺寸排阻色譜法是通過固定相多孔凝膠孔徑大小分離外泌體,方法簡單高效,純度高且色譜柱可重復使用,但操作耗時費力,需要特殊設備,成本高且獲取量少,且存在高密度脂質顆粒,不適用處理大量樣品及乳源外泌體的試驗研究;免疫親和法是通過外泌體表面蛋白抗原與抗體特異性結合來分離外泌體,該方法操作簡單,特異性高,可保證外泌體的完整,但效率低,特異性抗體貴且易受其他因素影響;微流控法是通過控制微通道中流體行為來分離外泌體,該方法耗時短,純度高,常在醫學領域使用,但目前未見其在乳源外泌體研究中的應用;不對稱流場流分餾法通過分流技術分離大尺徑范圍內樣品,如聚合物、蛋白質、脂質等,該方法獲取外泌體較完整,但耗時長,設備昂貴[14]。綜上所述,仍需通過比較不同外泌體提取方法的優缺點,結合乳汁特性,挖掘高效穩定的乳源外泌體提取方法。

牛乳含大量酪蛋白,提取外泌體較其他組織困難。乳源外泌體分離常使用差速超速離心法、蔗糖密度梯度離心法和化學沉淀法,但前人發現,差速超速離心法、凝乳酶法、乙酸法和蔗糖密度梯度離心法都存在提取數量少、純度低、步驟復雜、耗時長、過程外泌體損傷等問題,本試驗通過改變乙酸或凝乳酶用量、調整蔗糖密度梯度,減少離心步驟先將4種提取方法進行優化,并通過透射電子顯微鏡(TEM)、納米粒子跟蹤分析(NTA)、蛋白濃度檢測(BCA)、免疫印跡(WB)方法鑒定提取到的乳源外泌體,比較分析每種優化后提取乳源外泌體方法的優缺點,旨在確定最佳提取乳源外泌體的方法,為進一步研究奶牛乳源外泌體生物功能及應用提供新的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及樣品采集

選用甘肅省蘭州市某奶牛場20頭4～5歲齡、4～6胎次、處于泌乳期且無乳房炎的健康荷斯坦奶牛,在收集牛奶之前,用溫水清洗乳房和酒精徹底擦拭。用無菌瓶采集乳汁樣本,并將其混勻,用冰袋快速帶回實驗室,儲存于-80 ℃冰箱。

1.2 乳源外泌體提取方法的優化

參照前人提取方法,對其中各項參數進行優化,達到減少操作步驟和時間,快速提取到大量雜蛋白少、純度高的外泌體。乳源外泌體提取過程均在無菌環境下進行,每種提取方法均先將200 mL荷斯坦奶牛乳從-80 ℃冰箱取出,于25 ℃恒溫水浴鍋解凍。每種乳源外泌體主要優化超高速離心前的乳清提取步驟。

1.2.1 差速超速離心法的優化

優化前,差速超速離心法[15](多步離心)乳清提取需3步:①全脂牛奶離心10 min(300×g,4 ℃)取上清;②上清液離心10 min(2 000×g,4 ℃)取上清;③上清液離心30 min(10 000×g,4 ℃)取上清。

優化后,差速超速離心法乳清提取只需1步,原奶離心30 min(16 500×g,4 ℃)取上清,除去細胞、蛋白質、脂肪等,再超高速離心取沉淀,使用0.45 μm過濾器過濾,轉移乳清至超速離心管中;再離心120 min(120 000×g,4 ℃)除上清液,用磷酸鹽緩沖溶液(PBS)重懸收集達到清洗作用;使用0.22 μm過濾器過濾除去細菌、凋亡小體和聚集囊泡,超高速離心60 min(120 000×g,4 ℃)除上清液,用100 μL PBS重懸收集外泌體;轉移至無菌離心管中,立即使用或-80 ℃儲存用于進一步試驗。

1.2.2 凝乳酶法的優化

優化前,1)凝乳酶法[16](添加乙酸)乳清提取需6步:①全脂牛奶離心15 min(277×g,4 ℃)取上清,重復2次;②上清液中添加10%乙酸溶液,將pH調至6;③加入0.035 mg/mL凝乳酶(NaCl溶液溶解),37 ℃水浴30 min;④加上清液中,37 ℃水浴30 min;⑤離心30 min(9 983×g,4 ℃)取上清;⑥上清液離心60 min(9 983×g,4 ℃)取上清。2)凝乳酶法[17](孵育6 h)乳清提取需4步:①全脂牛奶離心30 min(8 000×g,4 ℃)取上清;②上清液離心60 min(13 200×g,4 ℃)取上清;③上清液添加凝乳酶0.025 g/L;④37 ℃孵育6 h。

優化后,凝乳酶法前期乳清準備只需2步:①常溫下原奶中添加pH 5.5的0.2 g/L凝乳酶氯化鈉溶液,在28 ℃恒溫水浴20 min使酪蛋白沉淀后;②離心30 min(16 500×g,4 ℃)去除細胞、蛋白質、脂肪、酪蛋白等,后續步驟與本試驗優化后正常差速超速離心法相同。

1.2.3 乙酸法的優化

優化前,1)乙酸法[16](pH 4.6)乳清提取需4步:①全脂牛奶樣品離心15 min(277×g,4 ℃)取上清,去除細胞,重復2次;②上清液中加入10%乙酸溶液,將pH調至4.6靜置10 min;③上清液離心30 min(9 983×g,4 ℃)取上清;④上清液離心60 min(9 983×g,4 ℃)取上清。2)乙酸法[18](牛奶和乙酸體積比為100∶5)乳清提取需3步:①脫脂牛奶37 ℃預熱10 min,②室溫添加乙酸(牛奶和乙酸體積比為100∶5)混合5 min;③離心10 min(10 000×g,4 ℃)取上清。

優化后,乙酸法乳清提取只需2步:①常溫下每1 mL原奶中添加4 μL純乙酸溶液至pH 5.0,靜置10 min使酪蛋白沉淀;②離心30 min(16 500×g,4 ℃)去除細胞、蛋白質、脂肪、酪蛋白等。后續步驟與本試驗優化后差速超速離心法相同。

1.2.4 蔗糖密度梯度離心法的優化

優化前,1)蔗糖密度梯度離心法[19](43%、35%、20%蔗糖梯度)的乳清提取需5步:①去除牛奶中細胞、脂肪、酪蛋白等物質;②上清液離心70 min(150 000×g,4 ℃)取沉淀,添加5 mL PBS吹勻為混懸液;③超高速管中依次加入43%、35%、20%濃度蔗糖溶液,混懸液加入頂層;④離心90 min(110 000×g,4 ℃)取43%和35%(平均密度1.7 g/mL)沉淀液體;⑤沉淀液體離心90 min(110 000×g,4 ℃)取沉淀。2)蔗糖密度梯度離心法[20](30%蔗糖)的乳清提取需5步:①樣品離心10 min(300×g,4 ℃)取上清;②上清液離心30 min(10 000×g,4 ℃)取上清;③超高速離心管中依次加入PBS、30%蔗糖溶液,上清液加入頂層;④離心90 min(100 000×g,4 ℃)取沉淀,添加PBS吹勻為混懸液;⑤混懸液離心90 min(100 000×g,4 ℃)取沉淀。

優化后,蔗糖密度梯度離心法只需3步:①在超高速離心管中依次添加40%、30%、20%、10%、5%濃度蔗糖溶液,優化后差速超速離心法提取的最終混懸液加入頂層;②離心120 min(120 000×g,4 ℃)除上清液,取40%、30%沉淀液體,使用0.22 μm過濾器過濾除去細菌、凋亡小體和聚集囊泡,使用PBS重懸收集沉淀吹勻為混懸液,達到清洗作用;③混懸液離心60 min(110 000×g,4 ℃)取沉淀,用100 μL PBS重懸收集乳源外泌體。

1.3 乳源外泌體鑒定

1.3.1 TEM鑒定乳源外泌體

TEM可分辨直徑1 nm內圖像,鑒定原理是將外泌體固定在網上并染色干燥,用TEM調整視野觀察拍照,對比形態鑒定外泌體。取混勻奶牛乳源外泌體20 μL滴加在銅網;加入2%醋酸雙氧鈾1滴,負染乳源外泌體30 min,日光燈干燥;TEM觀察選擇電壓80 kV,視野調整到直徑200 nm,找到合適視野觀察拍照保存。

1.3.2 WB鑒定乳源外泌體

將奶牛乳源外泌體裂解離心的上清液,與4×蛋白上樣緩沖液混勻,100 ℃煮沸15 min;蛋白上樣量10 μL,Marker上樣量4 μL;電壓70 V電泳30 min;電壓轉120 V電泳60 min;裁剪與膠相等大小的聚偏二氟乙烯(PVDF)膜浸泡甲醇激活30 s;橫流200 mA轉膜80 min;封閉液室溫孵育120 min;去除封閉液,將PVDF膜分別加入抗體:腫瘤易感基因101蛋白(TSG101)、熱休克蛋白70(HSP70)、四次跨膜蛋白家族中CD81和CD9,4 ℃封閉過夜;回收抗體PVDF膜用Tris-HCl緩沖鹽溶液+吐溫(TBST)溶液洗30 min;將PVDF膜相應加入抗兔二抗和鼠二抗室溫孵育120 min;回收抗體PVDF膜用TBST溶液洗40 min;配制好化學發光顯色液,使用化學發光儀曝光成像并保存。

1.3.3 NTA鑒定乳源外泌體

NTA是納米粒子常用一束光照射,當光被納米粒子散射并發生布朗運動時,便可記錄納米粒子運動路徑、擴散系數和平均速度。將乳源外泌體放置冰上,PBS稀釋,使用粒徑分析儀檢測,對懸浮液中特定直徑30～1 000 nm外泌體和囊泡,實時進行逐個直接成像及觀察;最后通過Zeta view 8.04. 02.軟件計算出乳源外泌體粒徑分布。

1.3.4 BCA鑒定乳源外泌體

奶牛乳源外泌體中添加蛋白裂解液,4 ℃裂解30 min,離心5 min(12 000×g,4 ℃),取上清至無菌離心管,按BCA蛋白檢測試劑盒說明書操作,制定蛋白標準曲線,在562 nm處測吸光度值,通過公式計算樣品蛋白濃度。

1.4 數據統計分析

采用SPSS 20.0統計軟件對BCA蛋白濃度測定和NTA所得數據進行獨立樣本t檢驗,比較優化后4種方法提取的蛋白濃度和粒子濃度差異顯著性。對比分析WB優化前和優化后4種方法提取的外泌體條帶。使用ImageJ2x軟件進行WB條帶灰度值分析。使用GraphPad Prism 8軟件進行繪制差異性顯著分析。P<0.05為差異顯著,P<0.01為差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 對比每種優化前和優化后的乳源外泌體提取方法

2.1.1 對比優化前和優化后3種提取方法的乳清

本試驗將優化前和優化后差速超速離心法、凝乳酶法和乙酸法提取的乳清進行拍照對比,如圖1所示,差速超速離心法優化后比優化前(多步離心)提取的乳清沉淀效果更好;凝乳酶法優化后比優化前提取的乳清沉淀效果更好;乙酸法優化后比優化前提取的乳清沉淀效果更好。因蔗糖密度梯度離心法的篩選,主要在超高速離心且蔗糖濃度濾過部分,所以無乳清對比圖。因此,3種方法均顯示優化后提取的乳清比優化前沉淀更多。

A:差速超速離心法;B:凝乳酶法;C:乙酸法。下圖同。A: differential overspeed centrifugal method; B: rennet method; C: acetic acid method. The same as below.

2.1.2 TEM鑒定對比每種優化前和優化后的乳源外泌體形態

TEM是鑒定外泌體的金標準,可直觀對比外泌體典型形態和密度。分別對優化前和優化后4種方法對比分析,如圖2所示,通過對圖像結果觀察對比,優化前和優化后的4種方法取得乳源外泌體均具有外形呈圓形有部分凹陷樣似“茶托”形典型結構,粒徑均在30～200 nm,差速超速離心法優化后比優化前提取的外泌體含量高;凝乳酶法優化后比優化前提取的外泌體含量高;乙酸法優化后比優化前提取的外泌體含量高,且外泌體表面光滑;蔗糖密度梯度離心法優化后比優化前提取的外泌體含量高。因此,本試驗優化后4種方法提取的外泌體含量均明顯高于優化前提取方法,且部分優化前提取的外泌體表面粗糙,形態結構被損傷。

D:蔗糖密度梯度離心法,其中(1)為優化前蔗糖密度梯度離心法(43%、35%、20%蔗糖梯度),(2)為優化前蔗糖密度梯度離心法(30%蔗糖)。下圖同。D:sucrose density gradient centrifugation method, (1) is the gradient centrifugation of sucrose density before optimization (43%, 35%, 20% sucrose gradients), and (2) is the gradient centrifugation of sucrose density before optimization (30% sucrose). The same as below.

2.1.3 WB鑒定對比每種優化前和優化后的乳源外泌體特異性蛋白表達量

利用WB條帶分別對優化前和優化后4種方法提取的乳源外泌體進行對比鑒定,如圖3所示,特異性標記蛋白CD81均有表達,4種方法均顯示優化后提取的外泌體蛋白表達量比優化前高。

圖3 優化前和優化后4種提取方法的WB條帶對比

對比優化前和優化后的4種方法提取的乳源外泌體WB條帶灰度值,如表1所示,差速超速離心法優化后提取的外泌體含量顯著高于優化前(多步離心)(P<0.05);凝乳酶法優化后提取的外泌體含量最多,顯著高于優化前(P<0.05);乙酸法優化后提取的外泌體含量顯著高于優化前(P<0.05);蔗糖密度梯度離心法優化后提取的外泌體含量顯著高于優化前(P<0.05)。因此,本試驗優化后4種方法提取的外泌體含量均顯著高于優化前。

表1 優化前和優化后4種提取方法的WB條帶灰度值對比結果

2.2 鑒定比較優化后的4種最優乳源外泌體提取方法

2.2.1 優化后乳源外泌體提取方法

對優化后乳源外泌體提取方法進行歸納,如圖4所示,優化后的提取方法主要分為乳清提取和外泌體沉淀,高速離心去除酪蛋白、脂肪、細胞及蛋白質等,使用0.45 μm過濾器過濾,第1次超高速離心,使用0.22 μm過濾器過濾去除細菌、凋亡小體和聚集囊泡,第2次超高速離心,最終獲得外泌體沉淀。

Centrifugal:離心;washing:溶液;filtration:過濾;exosomes:外泌體;casein:酪蛋白;cell debris:細胞碎片;fat:脂肪;chymosin:凝乳酶;acetic acid:乙酸;sucrose solution:蔗糖溶液;milk:牛乳。

2.2.2 TEM鑒定比較優化后4種方法提取乳源外泌體的形態

分別對優化后4種方法提取的乳源外泌體進行TEM鑒定,通過對圖像結果觀察對比,如圖5所示,優化后4種方法提取的乳源外泌體均具有外形呈圓形、有部分凹陷樣似“茶托”形結構,表面光滑,背景雜質少,粒徑均在30～200 nm,乙酸法提取的乳源外泌體鏡下視野密度高達80%以上,蔗糖密度梯度離心法提取的乳源外泌體鏡下視野密度可達50%左右,凝乳酶法提取的乳源外泌體鏡下視野密度可達20%左右,差速超速離心法提取的乳源外泌體鏡下視野密度可達5%左右。因此,優化后乙酸法提取的乳源外泌體含量最高。

圖5 優化后4種方法提取奶牛乳源外泌體形態和密度對比圖

2.2.3 NTA鑒定比較優化后4種方法提取乳源外泌體的大小

分別對優化后4種方法提取的乳源外泌體進行NTA鑒定,通過對圖像結果觀察對比,如圖6所示,優化后4種方法提取的乳源外泌體粒徑均在30～200 nm,符合外泌體粒徑范圍。

該圖表示不同優化方法的不同倍比稀釋后的峰值濃度。

通過對NTA鑒定結果對比,如表2所示,優化后差速超速離心法提取的乳源外泌體粒徑大小為(144.1±48.2) nm;優化后凝乳酶法提取的乳源外泌體粒徑大小為(143.9±56.9) nm;優化后乙酸法提取的乳源外泌體粒徑大小為(151.0±47.2) nm;優化后蔗糖密度梯度離心法提取的乳源外泌體粒徑大小為(155.0±49.9) nm。優化后乙酸法提取的乳源外泌體粒子濃度最高,其次是優化后蔗糖密度梯度離心法提取的乳源外泌體,最后是優化后凝乳酶法提取的乳源外泌體,均高于優化后差速超速離心法提取的乳源外泌體粒子濃度。因此,優化后乙酸法提取的乳源外泌體含量最高。

表2 優化后4種方法提取奶牛乳源外泌體粒徑、粒子濃度和粒徑峰值對比結果

2.2.4 BCA蛋白濃度測定鑒定比較優化后4種方法提取的乳源外泌體的濃度

因BCA蛋白濃度檢測的非純外泌體濃度,所以分別對優化后4種方法提取的乳源外泌體樣品進行BCA蛋白濃度測定,標準曲線為y=2.342 8x-0.198 8(x:樣品蛋白濃度,mg/mL;y:樣品吸光度值),r2=0.989 5。如表3所示,優化后乙酸法提取的乳源外泌體樣品蛋白濃度最低,顯著低于優化后差速超速離心法提取的乳源外泌體樣品蛋白濃度(P<0.05),其次是優化后蔗糖密度梯度離心法提取的乳源外泌體,最后是優化后凝乳酶法提取的乳源外泌體,均低于優化后差速超速離心法提取的乳源外泌體樣品蛋白濃度。根據TEM方法和NTA濃度結果,可對比得出乙酸法提取得到的乳源外泌體雜蛋白含量少且純度高。

表3 優化后4種方法提取奶牛的乳源外泌體樣品蛋白濃度對比結果

2.2.5 WB鑒定比較優化后4種方法提取的乳源外泌體特異性蛋白表達量

外泌體表面和內部有許多特異性標記蛋白,如HSP70、TSG101、CD9、CD81等,而HSP70是外泌體位于胞漿內的蛋白,因WB可特異性測定乳源外泌體表面及內部蛋白表達量,所以分別對優化后4種方法提取的乳源外泌體進行鑒定,如圖7所示,優化后乙酸法提取到的乳源外泌體可明顯表達表面及內部特異性標記蛋白CD81、CD9、TSG101和HSP70,而其他3種優化后方法均有不同程度表面及內部蛋白標記物損傷。因此,優化后乙酸法提取的乳源外泌體含量最高,且可用于轉錄組學、蛋白質組學等進一步試驗。

TSG101:腫瘤易感基因101 tumor susceptibility gene 101;HSP70:熱休克蛋白70 heat shock protein 70。

分別對優化后4種方法提取的乳源外泌體WB條帶灰度值進行對比,如表4所示,優化后乙酸法提取的乳源外泌體WB條帶灰度值顯著高于其他3種方法(P<0.05),其次是優化后蔗糖密度梯度離心法提取的乳源外泌體,WB條帶灰度值高于優化后凝乳酶法和優化后差速超速離心法。

表4 優化后4種方法提取的乳源外泌體WB條帶灰度值比較結果

2.2.6 WB法鑒定篩選優化后乙酸法最優乙酸添加量

將優化后4種方法進行對比后發現,優化后乙酸法提取的乳源外泌體含量最高,通過WB方法檢測外泌體特異性表面蛋白CD81和內部蛋白HSP70,根據蛋白表達水平篩選優化后乙酸法的最佳乙酸添加量,如圖8所示,每毫升乳中添加4 L乙酸(pH 5.0)時蛋白表達量最高,且外泌體內部蛋白HSP70未受損傷。HSP70是外泌體內部蛋白,位于胞漿內,應激下可進入核,并包圍核仁,具有與核苷酸結合的特性,表明外泌體內部及核糖體未受乙酸的損傷,可用于進一步的核酸試驗。

HSP70:熱休克蛋白70 heat shock protein 70。

分別對優化后乙酸法不同乙酸添加量提取的乳源外泌體WB條帶灰度值對比,如表5所示,每毫升乳中添加4 μL乙酸至乳的pH為5.0時提取的外泌體含量最高,其次是每毫升乳添加8 μL乙酸至乳的pH為4.6時提取的外泌體,最后是每毫升乳添加12 μL乙酸至乳pH為4.3時提取的外泌體,均比每毫升乳添加20 μL乙酸至乳pH為4.0時提取的外泌體含量高。因此,每毫升乳添加4 μL乙酸至乳pH為5.0時提取的外泌體含量高且穩定。

表5 優化后乙酸法不同乙酸添加量提取的乳源外泌體WB條帶灰度值比較結果

3 討 論

近幾年國內外學者不斷發現乳源外泌體可作為載體,通過靶向傳遞生物大分子、核酸、基因、藥物等,達到抵抗炎癥、治療腫瘤、制作疫苗、疾病診斷等功效,極具醫學潛力及應用價值,所以研究乳源外泌體的提取就成為重中之重。

牛奶中含有大量蛋白質、脂肪和酪蛋白等化合物,提取乳源外泌體有難度。本試驗根據前人已建立的差速超速離心法、凝乳酶法、乙酸法和蔗糖密度梯度離心法,通過不斷優化和改進,可有效除去乳中化合物,精簡乳源外泌體的提取方法的步驟。根據國際外囊泡學會發布的鑒定標準,對優化前和優化后4種方法提取到的乳源外泌體進行鑒定及比較。Yamauchi等[21]通過加入鹽酸進行等電點沉淀,發現提取的乳源外泌體表面粗糙,受到酸性條件的損傷,而本試驗優化后乙酸法提取得到乳源外泌體,通過TEM和NTA觀察,發現該外泌體數量和粒子濃度都高于其他3種方法,而且在酸性條件下,形態也未遭受破壞。Rahman等[22]研究發現,加入乙酸進行等電點沉淀,提取乳源外泌體粒子濃度高于超速離心法和加入鹽酸等電點沉淀法提取效果,與本試驗研究結果具有相似性。研究同時發現,在酸性條件下,外泌體表面及內部特異性標記蛋白的表達易受損傷,而本試驗優化后乙酸法提取的乳源外泌體表面及內部特異性標記蛋白均未受到破壞,可見添加乙酸至乳pH為5.0時可有效保護外泌體內部結構。綜上所述,本試驗優化的乙酸外泌體提取方法可有效除去乳中酪蛋白及其他化合物,提高外泌體純度及濃度,保持形態結構完整性,同時可減少提取步驟及時間,具有一定的應用價值。

4 結 論

本試驗通過增加離心速度,改變乙酸或凝乳酶用量、調整蔗糖密度梯度,減少離心步驟成功優化了4種乳源外泌體提取方法,優化的奶牛乳源外泌體乙酸提取法在減少提取步驟和時間的基礎上,可獲得純度高、特異性標記蛋白不易降解的優質外泌體。研究結果為乳源外泌體大量制備和工業化生產奠定方法基礎。