犬源抗氧化益生菌的篩選及功效評定

陳 楠 余澤旭 季 暄 章思奕 任大喜 師福山

(浙江大學動物科學學院,杭州 310058)

寵物在人們的生活中扮演著越來越重要的角色。根據美國Packaged Facts的分析,2012年到2022年,美國養寵家庭中,擁有1只老年犬(年齡在7歲及以上)的養狗家庭占比從41.60%上升到了53.50%[1]。隨著寵物醫療的發展,寵物犬的壽命將會更長,寵物衰老相關產業一定會是寵物行業的發展趨勢之一。衰老是生物體生命進程中必須經歷的環節,它表現為隨著年齡的增長,機體的細胞、組織和器官等功能逐漸下降,大腦認知和記憶功能下降[2]。衰老過程中,許多慢性疾病也會隨之而來,例如產科疾病、肝腎疾病、心臟疾病等[3],不僅給寵物犬帶來生理上的痛苦,也給寵物犬主人帶來情感上的折磨與經濟上的壓力。因此,為了預防衰老相關疾病,維持寵物犬的健康衰老,找到有效的抗衰老干預措施是十分必要的[4]。

氧化衰老是衰老的一個重要機制,是指由氧化應激引起的細胞衰老。生物體內,活性氧簇(ROS)的產生和內源抗氧化劑對ROS的清除是動態平衡的。但當機體中的ROS增多,內源抗氧化劑不足以清除時,ROS積累就會導致氧化應激。若氧化應激持續存在,會引發DNA損傷、蛋白質錯誤折疊、線粒體突變和細胞損傷,最終導致細胞衰老[5]。此時就需要添加外源性抗氧化劑來幫助機體清除ROS,抵御氧化損傷。Han等[6]、Paulino等[7]研究發現益生菌在體內外具有良好的抗氧化功能,有作為外源性抗氧化劑抵抗氧化衰老的潛能。

目前犬用益生菌制劑在迅速發展,但主要集中在細菌性腹瀉治療[8-9]、炎癥性腸病(IBD)治療[10]、急性腸病治療[11]、提高生長性能[12]等方面,且這些益生菌多來源于人、豬、羊,犬來源的較少,用犬源益生菌進行犬抗氧化的研究更是鮮見,相關的益生菌僅在國外的少數公司有開發利用。因此,開發我國自主知識產權的寵物抗氧化益生菌對提升我國寵物的營養與健康等具有重要意義。

鑒于此,本試驗擬篩選出1株或幾株犬源抗氧化益生菌,通過體外抗氧化試驗評定其抗氧化功效,以期可為犬抗氧化益生菌產品的開發提供儲備菌株。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

健康犬糞便采自浙江大學教學動物醫院,樣品采集選用肛拭子的方式,具體操作如下:在無菌1.5 mL EP管中提前加入1 mL無菌生理鹽水,無菌棉簽用生理鹽水濕潤后取肛拭子,然后把棉簽插入EP管浸泡在生理鹽水中,剪去木制部分。

1.2 抑菌指示菌株

大腸桿菌O157∶H7(EscherichiacoliO157∶H7)ATCC25922和鼠傷寒沙門氏菌(Salmonellatyphimurium)ATCC13311購于美國典型培養物保藏中心,單核細胞增生李斯特氏菌(Listeriamonocytogenes)CMCC54007和金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)CMCC26003購于中國醫學細菌保藏管理中心。

1.3 主要試驗試劑

MRS肉湯(貨號:M8540-250 g),北京索萊寶科技有限公司;LB肉湯(貨號:M0230),杭州微生物試劑有限公司;牛膽鹽(貨號:B875069-5 g),上海麥克林生化科技股份有限公司;人工胃液(USP,無菌;貨號:R22155),上海源葉生物科技有限公司。

1.4 主要儀器設備

FiveGoTMpH計,上海雷磁儀器廠;TGL-16M低溫高速離心機,上海盧湘儀離心機儀器有限公司;DPX-9002B-1恒溫恒濕培養箱,上海?，斣囼炘O備有限公司;SW-CJ-2F超凈工作臺,蘇州凈化設備有限公司。

1.5 菌株的分離純化

取100 μL 1.1中浸泡肛拭子的生理鹽水,不進行稀釋,涂布于MRS平板,37 ℃培養48 h后挑取形態大小明顯不同的單菌落于新MRS平板上劃線培養,連續劃線培養3代得到純化菌株。

1.6 細菌16S rDNA分子生物學鑒定

將培養好的菌液送至華大基因進行16S rDNA測序,測序結果在NCBI中進行同源性比對。

1.7 體外抗氧化試驗

1.7.1 樣品制備

待測菌株在MRS固體培養基上劃線分離,37 ℃培養48 h。用接種環挑取單菌落接種于滅菌MRS液體培養基中,37 ℃靜置培養24 h,得到培養液。1)發酵上清液的制備:將培養液用蒸餾水調整至菌體濃度為109CFU/mL,4 ℃、8 000 r/min離心15 min,收集上清液即為發酵上清液。2)菌懸液(IC)的制備:用0.02 mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS,pH=7.4)將離心后的菌體沉淀重懸洗滌,4 ℃、8 000 r/min離心15 min,重復3次。將洗滌干凈的菌體重懸于PBS中,并調整菌體濃度為109CFU/mL,即得到菌懸液。3)無菌體破碎物(CFE)的制備:取上述菌懸液進行超聲破碎(在冰上進行),破碎后離心取上清,即得到無菌體破碎物。超聲破碎參數為:變幅桿Ф6、超聲開1 s關2 s、功率200 W;15 min。

1.7.2 2,2-二苯基-1-苦基肼(DPPH)自由基清除試驗

參照Pourramezan等[13]的方法,測定犬源益生菌3種樣品液(菌懸液、無菌體破碎物、發酵上清液)的DPPH自由基清除能力。將1 mL樣品液與1 mL 0.20 mmol/L的DPPH無水乙醇溶液,振蕩混合1 min后,在室溫下避光反應30 min,離心取上清液于517 nm處測吸光度,以95%乙醇代替DPPH做對照,PBS代替樣品液做空白(樣品液為發酵上清液時,用MRS液體培養基代替樣品液做空白)。

DPPH自由基清除率(%)=[1-(Ai-Aj)/Ac]×100。

式中:Ai為樣品液+DPPH吸光度;Aj為樣品液+95%乙醇吸光度;Ac為PBS或MRS+DPPH吸光度。

1.7.3 羥自由基清除試驗

羥自由基清除率(%)=[(As-Ap)/

(Ab-Ap)]×100。

1.7.4 還原能力試驗

參照Chen等[15]的方法,測定犬源益生菌3種樣品液(菌懸液、無菌體破碎物、發酵上清液)的還原能力。將0.5 mL樣品液、0.5 mL鐵氰化鉀(質量分數為1%)和0.5 mL PBS(pH=6.6)混合后50 ℃水浴20 min,反應后冷卻并加入0.5 mL三氯乙酸(TAC,質量分數為10%)沉淀蛋白,離心后取1 mL上清液與1 mL三氯化鐵(FeCl3,質量分數為0.1%)反應5 min,于700 nm處測吸光度為As;用PBS代替樣品液做空白對照(樣品液為發酵上清液時,用MRS液體培養基代替樣品液做空白對照),測吸光度為Ab。

還原能力(%)=[(As-Ab)/Ab]×100。

1.8 益生特性試驗

1.8.1 生長曲線

將待測菌株連續活化3代液體擴增培養后,離心,棄上清。用無菌PBS重懸菌體,并調整菌體濃度至600 nm處吸光度為0.55。按1∶9的比例將菌液接種到無菌液體MRS培養基中,37 ℃靜置培養,每2 h測1次發酵混合物的600 nm處的吸光度。以未接種菌液的無菌液體MRS培養基作為對照。

1.8.2 膽鹽耐受性

將待測菌株連續活化3代液體擴增培養后,按1∶9的比例將菌液接種到牛膽鹽質量濃度為0.20%的PBS中,混勻后于37 ℃培養箱中培養,分別在培養0和4 h時取菌液進行平板計數。菌株的膽鹽耐受性計算公式為:

膽鹽耐受性(%)=(N4/N0)×100。

式中:N4為4 h時活菌數(CFU/mL);N0為0 h時活菌數(CFU/mL)。

1.8.3 酸耐受性

將待測菌株連續活化3代液體擴增培養后,按1∶9的比例將菌液接種到pH=2的PBS中,混勻后于37 ℃培養箱中培養,分別在0和4 h時取菌液進行平板計數。菌株的酸耐受性計算公式為:

酸耐受性(%)=(N4/N0)×100。

式中:N4為4 h時活菌數(CFU/mL);N0為0 h時活菌數(CFU/mL)。

1.8.4 人工胃液耐受性

將待測菌株連續活化3代液體擴增培養后,按1∶9的比例將菌液接種到人工胃液中,混勻后于37 ℃培養箱中培養,分別在0和3 h時取菌液進行平板計數。菌株的人工胃液耐受性計算公式為:

人工胃液耐受性(%)=(N3/N0)×100。

式中:N3為3 h時活菌數(CFU/mL);N0為0 h時活菌數(CFU/mL)。

1.8.5 抑菌特性

采用牛津杯法對待測菌株發酵上清液的抑菌特性進行測定。將4株抑菌指示菌株濃度調整至109CFU/mL后,分別按1%的接種量接種到LB固體培養基(55 ℃)中,混勻后,倒入事先放好無菌牛津杯[直徑為(8.00±0.01) mm]的培養皿中。待培養基凝固后,將牛津杯拔出,每孔中加入200 μL的待測菌株發酵上清液,37 ℃培養36 h后用游標卡尺測量抑菌圈直徑(包含牛津杯直徑)。

1.8.6 抗生素敏感性

采用紙片擴散法對待測菌株的抗生素敏感性進行測定。將100 μL待測菌株的菌懸液(菌體濃度調整至109CFU/mL)涂布于MRS固體培養基上,并用無菌鑷子將藥敏紙片置于培養基表面,輕壓藥敏片使其貼牢,37 ℃培養36 h后測量藥敏片的抑菌圈直徑。

1.9 數據統計與分析

每個試驗均設置3次重復,試驗數據均以平均值±標準差形式表示。試驗數據由SPSS 23.0分析軟件進行單因素方差分析和LSD多重比較,顯著性水平為P<0.05。

2 結果與分析

2.1 菌株的分離

本試驗從浙江省杭州市浙江大學教學動物醫院13只健康犬只中采集到13份肛拭子樣本,犬只信息見表1。從這13份肛拭子樣本中共分離出19株菌,這些菌株的菌落在MRS平板上普遍呈乳白色或為黃色,菌落表面光滑,革蘭氏染色為陽性,多為桿菌和球菌。分離菌株ZJUIDS-D016和ZJUIDS-D034的菌落形態圖及革蘭氏染色圖見圖1。

圖1 分離菌株ZJUIDS-D016(A)和ZJUIDS-D034(B)的菌落形態圖及革蘭氏染色圖

表1 提供肛拭子的犬只信息

2.2 體外抗氧化試驗結果

2.2.1 菌株DPPH自由基清除率

對19株分離菌株的發酵上清液、菌懸液以及無菌體破碎物進行了體外抗氧化試驗。如表2所示,19株分離菌株的發酵上清液、菌懸液、無菌體破碎物均有一定的DPPH自由基清除能力,其中發酵上清液的DPPH自由基清除率在(24.01±3.79)%～(117.98±3.16)%,菌懸液的DPPH自由基清除率在(1.15±1.10)%～(56.65±6.07)%,無菌體破碎物的DPPH自由基清除率在(4.92±2.74)%～(32.35±5.28)%。

表2 犬源益生菌DPPH自由基清除率

2.2.2 菌株羥自由基清除率

如表3所示,19株分離菌株中有3株菌株不具備羥自由基清除能力;有12株菌株的發酵上清液能夠清除羥自由基,羥自由基清除率在(4.41±0.52)%～(32.32±12.99)%;有9株菌株的菌懸液能夠清除羥自由基,羥自由基清除率在(0.79±0.34)%～(38.94±2.02)%;有9株菌株的無菌體破碎物能夠清除羥自由基,羥自由基清除率在(4.75±1.76)%～(34.27±4.78)%。

表3 犬源益生菌羥自由基清除率

2.2.3 菌株還原能力

如表4所示,19株分離菌株的菌懸液均具有還原能力,還原能力在(3.90±0.83)%～(173.77±1.31)%;16株菌株的無菌體破碎物具有還原能力,還原能力在(1.92±0.65)%～(151.30±12.79)%;僅7株菌株的發酵上清液具備還原能力,還原能力在(1.18±0.19)%～(315.13±24.99)%。

表4 犬源益生菌還原能力

綜合DPPH自由基清除率、羥自由基清除率和還原能力3項體外抗氧化能力指標的測定結果,菌株ZJUIDS-D016、ZJUIDS-D034的抗氧化能力較為突出,這2株菌株發酵上清液的DPPH自由基清除率分別為86.21%、89.47%,發酵上清液的羥自由基清除率分別為4.41%、32.32%,菌懸液的還原能力分別為109.30%、36.54%,故選取這2株菌進行后續的研究。

2.3 菌株鑒定結果

將上述選定的菌株ZJUIDS-D016、ZJUIDS-D034的16S測序結果上傳到Blast進行比對,并利用MEGA中的N-J算法Bootstrap 500次構建進化樹。由圖2可知,菌株ZJUIDS-D016與糞腸球菌(Enterococcusfaecalis)ATCC19433的同源性為100%,菌株ZJUIDS-D034與融合魏斯氏菌(Weissellaconfusa)JCM1093的同源性為100%,故這2株菌分別為糞腸球菌和融合魏斯氏菌,將其分別命名為糞腸球菌ZJUIDS-D016和融合魏斯氏菌ZJUIDS-D034。

Enterococcus faecalis:糞腸球菌;Enterococcu pallens:淡黃腸球菌;Weissella confusa:融合魏斯氏菌。

2.4 生長曲線

由圖3可知,融合魏斯氏菌ZJUIDS-D034生長較快,2～6 h為其對數生長期,8 h后進入平臺期,之后生長緩慢;糞腸球菌ZJUIDS-D016生長較慢,2～10 h為其對數生長期,14 h后進入平臺期,之后生長緩慢。

圖3 菌株ZJUIDS-D016和ZJUIDS-D034的生長曲線

2.5 膽鹽耐受性、酸耐受性和人工胃液耐受性

根據表5可以看出,菌株ZJUIDS-D016和ZJUIDS-D034在0.20%牛膽鹽條件下培養4 h的存活率分別為86.36%、69.63%,在pH=2條件下培養4 h的存活率分別為 96.95%、92.42%;在人工胃液中培養3 h的存活率分別為55.78%、57.80%。

表5 菌株ZJUIDS-D016和ZJUIDS-D034的膽鹽耐受性、酸耐受性和人工胃液耐受性

2.6 抑菌特性

圖4為菌株ZJUIDS-D016、ZJUIDS-D034對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、單核細胞增生李斯特氏菌、鼠傷寒沙門氏菌的抑菌效果圖。根據表6可以看出,菌株ZJUIDS-D016和ZJUIDS-D034對4種腸道常見致病菌均有較好的抑制作用。

(1)、(2)、(3)、(4)分別為菌株ZJUIDS-D016、ZJUIDS-D034對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、單核細胞增生李斯特氏菌、鼠傷寒沙門氏菌的抑菌效果圖,其中A為ZJUIDS-D016作用孔,B為ZJUIDS-D034作用孔,C為MRS空白對照孔。

表6 菌株ZJUIDS-D016和ZJUIDS-D034對4種腸道常見致病菌的抑菌圈直徑

2.7 抗生素敏感性

抗生素敏感性試驗結果依據臨床和實驗室標準協會(CLSI)標準進行判定,判定標準如表7所示。

表7 不同抗生素敏感性判定標準

表8為菌株ZJUIDS-D016和ZJUIDS-D034的抗生素敏感性試驗結果,可以看出菌株ZJUIDS-D016、ZJUIDS-D034均對5種抗生素(氯霉素、紅霉素、四環素、氨芐西林、青霉素)無耐藥性。

表8 ZJUIDS-D016和ZJUIDS-D034的抗生素敏感性抑菌圈直徑

3 討 論

益生菌是指適當攝入能對機體產生有益影響的活的微生物[16]。益生菌的益生特性必須符合宿主腸道菌群的特點[17]。Kumar等[18]的研究發現,在益生菌對犬的有益影響上,犬源益生菌優于乳制品來源的益生菌。所以本研究選擇從犬糞便中篩選益生菌,以期在犬上更好的發揮菌株的益生功效。

ROS產生與消除的長期不平衡會導致機體氧化應激[5]。有研究表明益生菌能提高機體的抗氧化能力,例如,益生菌可以使癡呆患者的總抗氧化水平提高的同時降低丙二醛(MDA)含量[19];活益生菌和死益生菌都具有抗氧化能力,可用于對抗不同疾病[20]。也有研究發現益生菌對老年犬的益處更為明顯[21],說明益生菌具有抗衰老的潛力。對DPPH自由基、羥自由基的清除能力、還原能力都是評判益生菌抗氧化能力的常用指標[22]。本研究通過測定這3個指標篩選出具有抗氧化衰老潛力的菌株,再對潛力菌株的膽鹽耐受性、酸耐受性、人工胃液耐受性、抑菌特性、抗生素敏感性等益生特性進行測定,最后篩選出2株具有較好體外抗氧化活性和益生特性的菌株,這2株菌株分別為糞腸球菌ZJUIDS-D016和融合魏斯氏菌ZJUIDS-D034。

糞腸球菌是應用的較多的乳酸菌,在畜牧方面得到了廣泛的應用[23]。有研究顯示,飼糧中添加5×108CFU/kg的糞腸球菌可以顯著提高肉仔雞的總抗氧化能力[24]。魏斯氏菌是一種新興的乳酸菌,雖然還未被列入飼料添加劑目錄,但已有研究表明其具備益生潛力,包括腸道定植能力,耐受低pH、高膽鹽能力,降低膽固醇和甘油三酯含量能力以及高產胞外多糖等[25]。益生菌安全性評價的一個重要指標是毒力基因的攜帶情況。Quattrini等[26]對27株食竇魏斯氏菌和7株融合魏斯氏菌的基因組進行了比較基因組分析,發現在魏斯氏菌的基因組中存在一些假定的毒力基因,但這些毒力基因也存在于其他乳酸菌中,歐洲食品安全局(EFSA)認為這些菌株是安全的。上述結果說明魏斯氏菌的使用具有一定的安全性。

本研究中,糞腸球菌ZJUIDS-D016和融合魏斯氏菌ZJUIDS-D034發酵上清液的DPPH自由基清除率分別為86.21%、89.47%,與王佳慧等[4]的研究一致,其從人腸道中篩選出的乳酸菌DPPH自由基清除率在17.12%～86.53%。一般認為DPPH自由基清除率超過30%的益生菌即具有高抗氧化活性[27],本試驗分離的2株犬源益生菌的DPPH自由基清除率均高于30%,說明均具有高抗氧化活性。糞腸球菌ZJUIDS-D016和融合魏斯氏菌ZJUIDS-D034菌懸液的還原能力分別為109.3%、36.54%。黃玉軍等[28]從人腸道中篩出的乳酸菌菌懸液的還原能力為1.36%～1.60%,本研究結果與此差距較大,這可能與菌株的來源有關。黃煜等[29]從腌制菜中篩選出的乳酸菌菌懸液還原能力為10.00%～23.30%;而吳石金等[30]從發酵食品中篩選出的乳酸菌菌懸液還原能力為76.00%～114.00%。糞腸球菌ZJUIDS-D016和融合魏斯氏菌ZJUIDS-D034發酵上清液的羥自由基清除率分別為4.41%、32.32%,略低于黃玉軍等[28]從人腸道中篩出的乳酸菌發酵上清液的羥自由基清除率52.75%～64.80%,這可能與菌株的發酵條件有關。Zhao等[31]研究表明,乳酸菌產生的胞外多糖如葡聚糖,具有良好的自由基清除活性,5 mg/mL葡聚糖的DPPH自由基清除率為45.2%,4 mg/mL葡聚糖的羥自由基清除率為86.5%。而胞外多糖的產生多少與發酵條件有關[32],后續試驗可以對2株菌的最佳發酵條件進行探討研究,以發揮其最大的抗氧化功效。

糞腸球菌ZJUIDS-D016和融合魏斯氏菌ZJUIDS-D034在pH=2條件下培養4 h時的存活率分別為96.95%、92.42%;在0.20%牛膽鹽條件下培養4 h時的存活率分別為86.36%、69.63%。上述結果優于魏雪[9]篩到的犬糞源乳酸菌,其得到的4株犬糞源乳酸菌在pH=2條件下培養2 h時存活率在80%以上,本試驗的2株菌在同等條件下培養4 h時仍有90%以上的存活率;其得到的4株犬糞源乳酸菌在0.10%膽鹽條件下培養2 h存活率在70%以上,本試驗的2株菌在0.20%膽鹽條件下培養4 h仍有70%的存活率,說明這2株菌具有較好的抗逆性。糞腸球菌ZJUIDS-D016和融合魏斯氏菌ZJUIDS-D034在人工胃液中培養3 h時的存活率分別為55.78%、57.80%,略低于張家寶等[33]篩到的雞源乳桿菌,其所分離的雞源乳桿菌在人工胃液中培養3 h時的存活率為65.92%。有研究表明益生菌發揮益生功能的機制之一就是抑制腸道病原菌[34]。糞腸球菌ZJUIDS-D016和融合魏斯氏菌ZJUIDS-D034的發酵上清液對4種常見的腸道致病菌(大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、單核細胞增生李斯特氏菌、鼠傷寒沙門氏菌)均有抑菌作用,可以看出這2株菌除了抗氧化潛力外,還具有一定抗細菌性腸道疾病的潛力,例如由大腸桿菌引起的腹瀉等;同時這2株菌對5種抗生素(氯霉素、紅霉素、四環素、氨芐西林、青霉素)無耐藥性,對寵物犬健康較為安全。

4 結 論

本試驗篩選到的2株犬源益生菌——糞腸球菌ZJUIDS-D016和融合魏斯氏菌ZJUIDS-D034,這2株菌來自犬糞便,具備高抗氧化活性;同時,這2株菌具備較高的膽鹽耐受性和酸耐受性,抗逆能力較強;對常見的腸道病原菌有抑制作用,符合常見益生菌的特性;對多種抗生素敏感。上述結果表明犬源糞腸球菌ZJUIDS-D016和融合魏斯氏菌ZJUIDS-D034可以作為開發犬抗氧化益生菌產品的儲備菌株。