構樹與茅臺酒糟不同混合比例對其青貯品質及微生物組成的影響

何湘江 樊雪瑩 陳玉連* 成啟明 李茂雅 雷 耀 王佳楚函 趙圓圓 陳 超 王偉東 王志軍

(1.貴州大學動物科學學院,貴陽 550025;2.興安盟農牧技術推廣中心,烏蘭浩特 137400;3.內蒙古農業大學草原與資源環境學院,草地資源教育部重點實驗室,農業農村部飼草栽培、加工與高效利用重點實驗室,呼和浩特 010021)

貴州省位于我國西南地區,擁有典型的喀斯特地貌,其主要特征是高海拔、多山及水土流失嚴重[1],不適合大量種植如苜蓿、玉米和黑麥草等傳統牧草。而隨著貴州畜牧業的快速發展,常規飼草飼料已經不能滿足畜牧業的需求[2]。因此,開發利用非常規飼料資源以解決飼料短缺問題勢在必行。

構樹(BroussonetiapapyriferaL.)是一種?？?、構樹屬的木本植物,適應性強,生長迅速,生產成本低且分布廣泛[3]。構樹的收獲季節正值雨季,十分潮濕,難以制成干草長期保存,使用青貯調制的方式貯存構樹已被證明是保存構樹營養的最佳方式[4]。在青貯過程中,附生乳酸菌(lactic acid bacteria,LAB)將飼草中的可溶性碳水化合物(water soluble carbohydrate,WSC)發酵成有機酸[主要是乳酸(lactic acid,LA)],從而降低pH,抑制有害微生物[5]。已有研究表明,構樹可以作為蛋白質飼料[6]。在牛和山羊的飼糧中添加適量的構樹青貯飼料可以提高其生長性能、肉品質以及免疫和抗氧化功能[7-8]。由于構樹富含蛋白質、維生素和氨基酸,我國已經種植了大約30萬hm2的構樹作為非常規動物飼料[9]。然而,新鮮構樹由于緩沖能值高,且WSC含量和LAB數量較低(<105CFU/g FM),導致構樹單獨青貯難以成功。

茅臺酒糟是釀酒過程中由各種糧食谷物加工后所產生的固體廢棄物[10],其中絕大部分的營養物質未被完全利用,如WSC、維生素和氨基酸等[11]。隨著我國釀酒業的蓬勃發展,酒糟產量也逐漸增加。楊玉能等[12]研究表明,飼喂茅臺酒糟生物料可以提高雜交牛的背部肌肉厚度,且通過改善肌內蛋白質和脂肪含量以及脂肪中各種脂質代謝分子表達量,使肉質得到改善。不過,酒糟由于含水量高,不易長期保存。張磊等[13]研究表明,將酒糟與其他優質原料采用適當比例進行混合青貯,可以提高酒糟及相應原料的營養物質利用率,這既能解決酒糟的保存問題,又可以提高青貯飼料營養價值,增強青貯飼料品質及適口性。因此,筆者猜想構樹與茅臺酒糟混合青貯可以制得優質青貯飼料。

目前,關于構樹與茅臺酒糟混合青貯的研究未見報道。本研究擬開展構樹與茅臺酒糟不同混合比例對其青貯品質的影響研究,通過綜合分析其養分含量、發酵品質和微生物組成等指標,篩選出構樹與茅臺酒糟混合青貯的最適比例,為開發利用非常規飼料提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗所用材料為取自貴州省安順市長順縣的構樹,以及取自貴州省仁懷市茅臺鎮茅臺集團酒廠的茅臺酒糟。2種原料通過自然風干晾曬6 h左右進行青貯。原料營養水平見表1。

表1 原料營養水平

1.2 試驗設計

本試驗共設置6個不同的構樹與茅臺酒糟混合比例,分別為:100%構樹(GCK組)、80%構樹和20%茅臺酒糟(Ⅰ組)、60%構樹和40%茅臺酒糟(Ⅱ組)、40%構樹和60%茅臺酒糟(Ⅲ組)、20%構樹和80%茅臺酒糟(Ⅳ組)以及100%茅臺酒糟(JCK組)。以鮮重為基礎,青貯60 d后,測定青貯樣品的養分含量、發酵品質及微生物組成,每個處理設置3個重復。

1.3 青貯制備

將構樹頂端50 cm左右的枝葉,切成2～3 cm的小段,按照試驗設計比例將構樹與茅臺酒糟充分混勻后,稱取330 g,裝入聚乙烯袋中,用真空機抽真空密封青貯。青貯袋封口后置于室溫下避光保存60 d。

1.4 測定指標及方法

1.4.1 樣品處理

將10 g青貯樣品與90 mL蒸餾水混合均勻,在4 ℃下浸提24 h后,通過4層紗布和定性濾紙過濾得到樣品浸提液,置于-20 ℃條件下保存,用于氨態氮(ammonia nitrogen,NH3-N)和有機酸含量的測定。其余樣品置于烘箱,65 ℃烘干至恒重,用于測定干物質(dry matter,DM)、粗蛋白質(crude protein,CP)、中性洗滌纖維(neutral detergent fiber,NDF)、酸性洗滌纖維(acid detergent fiber,ADF)和WSC含量。

1.4.2 養分含量的測定

CP含量采用凱氏定氮法利用定氮儀(KN680,ALVA)[14]測定;WSC含量采用蒽酮-硫酸法[15]測定;NDF和ADF含量采用濾袋分析法[16]利用全自動纖維測定儀(ANKOM A-200I)測定;DM含量參考張麗英[17]的方法測定。

1.4.3 發酵品質的測定

pH采用精密pH計進行測定。NH3-N、LA、乙酸(acetic acid,AA)、丙酸(propionic acid,PA)和丁酸(butyric acid,BA)含量參照DB15/T 1458—2018[18]方法使用DIONEX-2500型離子色譜分析儀測定。采用ASⅡ離子色譜柱,流動相由EG50淋洗液在線發生器產生(1%氫氧化鉀溶液),流速0.8 mL/min;采用AS50自動進樣器,進樣量10 μL,在室溫下進行測試。進樣前樣品稀釋10～25倍,45 μm濾膜過濾。

1.4.4 微生物組成分析

將每個青貯處理的3個重復樣品均勻地混合在一起,使用QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit試劑盒提取青貯飼料中的微生物總DNA,使用細菌16S rRNA基因V3～V4區引物(F:CCTAYGGGRBGCASCAG;R:GGACTACNNGGGTATCTAAT),對以上獲得的DNA模板進行序列擴增。真菌ITS擴增子測序引物為F:CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA;R:GCTGCGTTCTTCATCGATGC。使用2%凝膠電泳檢測PCR產物,根據NovaSeq 6000的PE250模式pooling上機測序。微生物數據使用北京諾禾致源科技股份有限公司提供的云平臺進行分析[19]。

1.5 數據統計分析

結果數據采用SPSS 26.0軟件進行方差分析,并利用GraphPad軟件制作圖表;結果以“平均值±標準誤”表示,P<0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 構樹與茅臺酒糟不同混合比例對其青貯飼料養分含量的影響

構樹與茅臺酒糟不同混合比例對其青貯飼料養分含量的影響見表2。在混合青貯組(Ⅰ組～Ⅳ組)中,Ⅱ組青貯飼料CP含量顯著高于GCK組和Ⅰ組(P<0.05),NDF含量顯著低于GCK組(P<0.05),ADF含量顯著低于GCK組和Ⅰ組(P<0.05)。所有混合青貯組青貯飼料WSC和DM含量均顯著低于JCK組(P<0.05),NDF和ADF含量均顯著低于GCK組(P<0.05)。

表2 構樹與茅臺酒糟不同混合比例對其青貯飼料養分含量的影響

2.2 構樹與茅臺酒糟不同混合比例對其青貯飼料發酵品質的影響

構樹與茅臺酒糟不同混合比例對其青貯飼料發酵品質的影響見表3。所有混合青貯組青貯飼料pH顯著低于GCK組(P<0.05),PA含量顯著高于GCK組(P<0.05)。在混合青貯組中,Ⅱ組青貯飼料pH最低,顯著低于Ⅰ組(P<0.05);LA含量最高,顯著高于Ⅲ組(P<0.05),同時也顯著高于JCK組(P<0.05)。Ⅳ組青貯飼料AA含量最低,顯著低于其他混合青貯組(P<0.05)。Ⅲ組青貯飼料PA含量最低,顯著低于其他混合青貯組(P<0.05);其他混合青貯組之間PA含量無顯著差異(P<0.05),但均顯著高于JCK組和GCK組(P<0.05)。各組青貯飼料均未檢測出BA存在。Ⅲ組青貯飼料NH3-N含量顯著低于GCK組和Ⅰ組(P<0.05)。

表3 構樹與茅臺酒糟不同混合比例對其青貯飼料發酵品質的影響

2.3 構樹與茅臺酒糟不同混合比例對其青貯飼料微生物組成的影響

2.3.1 青貯飼料細菌在門水平上的組成

基于門水平的構樹與茅臺酒糟混合青貯飼料細菌組成如圖1所示。GCK組、Ⅳ組和JCK組青貯飼料的優勢菌門為變形菌門(Proteobacteria),其余組的優勢菌門為厚壁菌門(Firmicutes)。除此之外,各組還含有少量的擬桿菌門(Bacteroidota)和放線菌門(Actinobacteria),JCK組存在部分疣微菌門(Verrucomicrobiota)。Ⅰ組、Ⅱ組和Ⅲ組青貯飼料的厚壁菌門相對豐度相較于Ⅳ組均有所提高,同時變形菌門的相對豐度均有所降低。

圖1 青貯飼料細菌在門水平上的組成

2.3.2 青貯飼料細菌在屬水平上的組成

基于屬水平的構樹與茅臺酒糟混合青貯飼料細菌組成如圖2所示。與混合青貯組相比,GCK組或JCK組青貯飼料的乳桿菌屬(Lactobacillus)相對豐度較低,其他(others)和假單胞菌屬(Pseudomonas)相對豐度較高,因此單獨青貯不易成功。Ⅱ組青貯飼料的優勢菌屬為乳桿菌屬,相對豐度為41.75%。隨著茅臺酒糟混合比例的提高,乳桿菌屬的相對豐度呈現先升高后降低的趨勢,當茅臺酒糟混合比例達到40%時乳桿菌屬相對豐度最高,說明Ⅱ組的青貯效果較好。

圖2 青貯飼料細菌在屬水平上的組成

2.3.3 青貯飼料真菌在門水平上的組成

基于門水平的構樹與茅臺酒糟混合青貯飼料真菌組成如圖3所示。各組青貯飼料真菌的優勢菌門為子囊菌門(Ascomycota),其中JCK組青貯飼料的子囊菌門相對豐度最高。隨著茅臺酒糟混合比例的提高,混合青貯組青貯飼料中子囊菌門相對豐度逐漸提高。

圖3 青貯飼料真菌在門水平上的組成

2.3.4 青貯飼料真菌在屬水平上的組成

基于屬水平的構樹與茅臺酒糟混合青貯飼料真菌組成如圖4所示。JCK組青貯飼料的哈薩克斯坦酵母屬-假絲酵母屬分支(Kazachstania-Candida_clade)相對豐度達20.00%,而Ⅱ組青貯飼料未檢測到哈薩克斯坦酵母屬-假絲酵母屬分支。隨著茅臺酒糟混合比例的提高,青貯飼料的畢赤酵母屬(Pichia)相對豐度呈現先降低后升高的趨勢,Ⅱ組青貯飼料的畢赤酵母屬相對豐度低于JCK組和GCK組,Ⅰ組青貯飼料的畢赤酵母屬相對豐度高于JCK組和GCK組。

圖4 青貯飼料真菌在屬水平上的組成

3 討 論

3.1 構樹與茅臺酒糟不同混合比例對其青貯飼料養分含量的影響

研究發現,新鮮原料中足夠的WSC含量(6%～8% DM)對于保證青貯發酵質量至關重要[20]。新鮮構樹中NDF和ADF含量較高,WSC含量低于6%,難以很好的青貯;而酒糟中WSC含量較高(7.49% DM),故而本研究中添加茅臺酒糟與構樹混合青貯彌補了新鮮構樹原料WSC含量的不足,以促進LAB發酵。

本研究中,所有混合青貯組青貯飼料的WSC含量均顯著低于JCK組,這是因為新鮮酒糟本身WSC含量較高。隨著茅臺酒糟混合比例的提高,各混合青貯組青貯飼料CP含量呈上升趨勢,這與陳冬梅等[21]的研究中,隨著白酒糟混合比例的提高,青貯飼料CP含量呈上升趨勢的研究結果一致。本研究中,所有混合青貯組青貯飼料NDF和ADF含量顯著低于GCK組;任海偉等[22]研究報道,白酒糟與菊芋渣混合青貯,青貯飼料的NDF和ADF含量變化與本研究類似,這說明構樹與茅臺酒糟混合青貯有利于青貯原料中纖維的降解,從而提高青貯飼料的飼用價值[23]。

3.2 構樹與茅臺酒糟不同混合比例對其青貯飼料發酵品質的影響

本研究中,構樹與茅臺酒糟混合青貯處理對其青貯飼料pH以及LA、AA、PA和NH3-N含量有顯著影響。其中,所有混合青貯組青貯飼料pH都顯著低于GCK組,這與張遠凌[24]的研究結果相似,表明混合青貯能夠降低構樹青貯pH,提高構樹青貯成功率。除Ⅲ組外,所有混合青貯組青貯飼料LA含量均顯著高于JCK組,其中Ⅱ組青貯飼料LA含量最高,且顯著高于Ⅲ組,證明該組青貯發酵效果較好。尉小強等[25]研究表明,青貯中PA含量越高,有氧穩定性越好。本試驗中,所有混合青貯組青貯飼料PA含量均較高,且顯著高于GCK組和JCK組,這說明混合青貯組有氧穩定性可能更好。而PA含量較高的原因可能是混合調制的青貯飼料在60 d之前就已經發酵完全[26],酒糟比例越高可能發酵完全的越快,故而PA含量隨酒糟比例的提高而提高。NH3-N含量可以反映青貯過程中蛋白質和氨基酸的降解程度[27]。本研究中,Ⅱ組青貯飼料NH3-N含量低于GCK組,說明Ⅱ組的蛋白質水解程度小于構樹單獨青貯。如果青貯飼料中檢測到BA,則說明青貯飼料中有梭菌存在,這會加劇青貯中DM的損失,本研究中所有混合青貯組均未檢測到BA,說明構樹與茅臺酒糟混合青貯有利于青貯飼料養分含量的保存[28]。從發酵指標綜合來看,構樹與茅臺酒糟混合比例為6∶4時的青貯飼料發酵品質較好。

3.3 構樹與茅臺酒糟不同混合比例對其青貯飼料微生物組成的影響

微生物作為青貯發酵過程中的關鍵因素,將直接影響青貯飼料發酵品質的好壞。本研究基于門水平的青貯飼料細菌組成中,混合青貯組(Ⅳ組除外)的優勢菌門為厚壁菌門,而JCK組和GCK組的優勢菌門為變形菌門,這與陶蓮等[29]的研究結果類似。由此說明構樹與茅臺酒糟混合青貯后有益菌相對豐度提高,且抑制了有害菌的生長,從而降低了青貯飼料養分的消耗。從屬水平上來看,單獨青貯組的優勢菌屬為假單胞菌屬和其他,而乳桿菌屬和腸球菌屬(Enterococcus)等有益菌相對豐度較低,這說明這2種原材料單獨青貯時都不易成功[30]。構樹與茅臺酒糟混合青貯后優勢菌屬為乳桿菌屬,且隨著茅臺酒糟混合比例的提高,乳桿菌屬相對豐度呈現先提高后降低的變化趨勢,當茅臺酒糟混合比例達到40%時乳桿菌屬相對豐度最高,這說明Ⅱ組青貯效果較好;而茅臺酒糟混合比例過高時,乳桿菌屬相對豐度出現下降,這說明茅臺酒糟混合比例不宜過高。

基于門水平的青貯飼料真菌組成中,青貯飼料的優勢菌門為子囊菌門,其中JCK組子囊菌門相對豐度最高。隨著茅臺酒糟混合比例的提高,混合青貯組青貯飼料的子囊菌門相對豐度逐漸提高。從屬水平上來看,JCK組青貯飼料的哈薩克斯坦酵母屬-假絲酵母屬分支相對豐度達20.00%,這可能是因為茅臺酒糟原料中酵母菌屬相對豐度較高所致;而混合青貯組和GCK組未檢測到哈薩克斯坦酵母屬-假絲酵母屬分支,這說明混合青貯有利于減少哈薩克斯坦酵母屬-假絲酵母屬分支的存在。隨著茅臺酒糟混合比例的提高,青貯飼料的畢赤酵母屬相對豐度呈現先降低后升高的趨勢,Ⅱ組青貯飼料的畢赤酵母屬相對豐度低于JCK組和GCK組,這說明混合青貯可以減少畢赤酵母屬的存在;而Ⅰ組青貯飼料的畢赤酵母屬相對豐度高于單獨青貯組,這說明構樹混合比例不宜過高。

從微生物組成來看,當構樹與茅臺酒糟混合比例為6∶4時,混合青貯飼料中乳桿菌屬等有益菌相對豐度較高,假單胞菌屬等有害菌相對豐度較低,哈薩克斯坦酵母屬-假絲酵母屬分支相對豐度較低,更適宜青貯。

4 結 論

構樹與茅臺酒糟混合青貯不僅提高了構樹的利用率,豐富了飼料來源,而且提升了青貯飼料的營養價值和發酵品質,同時提高了青貯飼料中乳桿菌屬等有益菌的相對豐度,降低了假單胞菌屬等有害菌的相對豐度。從營養價值、發酵品質和微生物組成等因素綜合考慮,60%構樹與40%茅臺酒糟混合青貯發酵品質較好。