番鴨不同質地蛋殼超微結構及其與蛋殼強度的關聯分析

梅慧靈 鄭定黔 趙邦哲 田若寧 陳 瑩 李 昂 連森陽 梅景良 吳 旭

(福建農林大學動物科學學院(蜂學學院),福州 350002)

蛋殼是家禽產生的一種生物礦化殼,是蛋體與外界接觸的最外圍結構,由內而外依次為:殼膜層、乳突層、柵欄層、晶體層和角質層5個部分[1-5]。當前,由于養殖方式的改變尤其是現代集約化封閉式舍飼或籠養的出現,破殼蛋、軟殼蛋、沙殼蛋(也稱砂殼蛋)以及裂紋蛋等大幅增加,致使蛋殼不能完全發揮其應有的作用,嚴重影響禽蛋品質乃至養禽業的健康發展[6]。因此,研究蛋殼品質的改善問題具有非常重要的經濟價值和生物學意義。

長期以來,改善蛋殼品質的研究主要是聚焦于飼養環境、營養供給控制、蛋殼品質調控候選基因以及蛋殼沉積形成機制差異等諸多方面[7-11],與此同時,蛋殼超微結構的相關研究也已逐漸成為熱點。目前,關于蛋殼超微結構及組成的研究主要集中在雞蛋方面[5-7,12],在鴨蛋方面的研究報道仍較少[13-14]。

番鴨原產于熱帶地區,因其喜溫的特性,使其成為我國南方飼養比較多的水禽品種,然而有關其蛋殼的相關研究報道卻極少。李昂等[15]以白番鴨為研究對象,探究了其所產鴨蛋蛋殼氣孔數以及殼厚對出雛效果的影響;連森陽等[16]比較了白番鴨沙殼蛋與白殼蛋、青殼蛋蛋殼性狀對孵化效果的影響。條紋蛋(亦稱螺紋蛋)在番鴨蛋中也是頗為常見的一種蛋殼結構異常蛋,其孵化率(64.3%)顯著低于正常蛋(88.5%)[17]。目前國內外未見有番鴨正常蛋、沙殼蛋和條紋蛋蛋殼在超微結構性狀上的比較研究報道,蛋殼超微結構性狀與蛋殼強度(eggshell strengh,ESS)之間的關聯性如何亦屬未知。

因此,本試驗以白羽番鴨為研究對象,通過觀察比較白色的正常蛋、沙殼蛋和條紋蛋蛋殼的超微結構,并分析蛋殼超微結構性狀與蛋殼強度之間的關聯性,以期為番鴨不同質地蛋殼的結構和力學特性研究,以及為今后選育和改良提高番鴨蛋蛋殼質量研究積累基礎數據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究所用白殼蛋產自福建省莆田秀嶼番鴨育種場300日齡MB品系白羽番鴨。該番鴨為籠養,按常規方法管理,飼養條件相同。產蛋當天隨機采集白色的正常蛋、沙殼蛋和條紋蛋各200枚,其中:長徑為61.5～63.5 mm、寬徑為45.5～46.5 mm,在照蛋器光照下能顯示顏色均勻、無沙質點和條紋的鴨蛋即為正常蛋;沙質點分布面積大于蛋殼表面40%的為沙殼蛋;整個蛋殼分布有多條明暗相間螺旋條紋的為條紋蛋。

1.2 試驗方法

1.2.1 蛋殼質量常規測定

將鴨蛋運回實驗室后,除去蛋表面的臟污,對完好無損的3種蛋分別加以編號。用電子天平[賽多利斯科學儀器(北京)有限公司]對每枚蛋進行稱重;用速讀式游標卡尺(東菀三量量具有限公司)測量蛋的長徑和寬徑,計算蛋形指數(egg shape index,ESI);用蛋殼強度測定儀(EFG-0503,日本Robotmation公司)測定蛋殼強度。然后將每枚蛋分為兩半,除去蛋中內容物(包括殼膜),沖洗干凈后收集蛋殼,置于5%乙二胺四乙酸二鈉鹽(EDTA-Na2)溶液中浸泡20 min,用刷子除去蛋殼外表層的角質層后即為鈣化殼,置烘箱于45 ℃下烘干,再對每枚蛋的鈣化殼進行稱重,即得鈣化殼重(calcified shell weight,CSW)。將鈣化殼依蛋殼長徑方向分成5個部位,依次為大頂、大區、赤道、小區和小頂,用螺旋測微器(東菀三量量具有限公司)測量每個部位的厚度,5個部位厚度的平均值即為該枚蛋殼的鈣化殼厚度(calcified shell thickness,CST)。最后,將這些蛋殼置于-70 ℃冰箱保存備用。

1.2.2 蛋殼超微結構觀測

在1.2.1蛋殼質量常規測定的基礎上,選取鈣化殼厚度相近的正常蛋、沙殼蛋和條紋蛋蛋殼各12枚,分別作為3種不同質地蛋殼的試驗組,每組設12個重復,每個重復1枚蛋殼。將這3組蛋殼從-70 ℃冰箱中取出,隨后用酒精進行浸泡和去污處理,再使用無水乙醇清洗后晾干,保存備用。

3組蛋殼分別逐個取其赤道部各一塊(1 cm×1 cm)作為樣品,并做好標注。將每個蛋殼樣品分成小碎塊,各取3個小塊作為每個蛋殼的測試材料。將每一小塊蛋殼按外表面、內表面和橫斷面的順序黏于觀測臺上,噴金。使用S3400N型掃描電鏡觀察蛋殼各個區域的超微結構,拍照。

測定乳突層厚度(mastoid layer thickness,MLT)和乳突間隙(mastoid gap,MG)。乳突層厚度為相鄰乳突底部交界處最低點到乳突結節頂點的距離,乳突間隙為2個相鄰乳突結節頂點之間的距離。各測量3個不同位置的乳突層厚度和乳突間隙,各取其平均值。計算有效厚度(effective thickness,ET),這里的有效厚度是指不包括乳突層的鈣化殼厚度。

在放大100倍顯微鏡下測定視野內蛋殼乳突大小。平均乳突大小(average mastoid size,AMS)以乳突錐體基底部直徑或寬度S表示,計算公式為:

S=L/N。

式中:L為視野內一排乳突錐體的總寬度;N為乳突錐體的個數。

1.3 數據統計與分析

應用Excel 2016對試驗數據進行初步處理;運用統計分析軟件SPSS 20.0對數據進行統計分析。其中,用Z分數檢驗剔除差異過大的數據(Z分數大于3或小于-3的數據為需要剔除的數據),用單因素方差分析(one-way ANOVA)統計3組蛋殼之間蛋殼品質指標的差異,用雙變量相關分析統計各個蛋殼品質指標之間的相關性,結果以“平均值±標準差”表示,以P<0.05為差異顯著判斷標準。

2 結果與分析

2.1 3種不同質地蛋殼質量性狀的比較

對3種蛋殼的質量性狀指標進行統計,結果見表1。蛋殼強度在3種蛋之間差異顯著(P<0.05),表現為正常蛋>沙殼蛋>條紋蛋;蛋形指數、鈣化殼厚度和鈣化殼重在3組間差異均不顯著(P>0.05)。

表1 蛋殼質量性狀測定結果

對3種蛋殼的質量性狀指標進行了相關性分析,結果見表2。3種蛋的蛋形指數、鈣化殼厚度及鈣化殼重與蛋殼強度之間的相關性均不顯著(P>0.05)。

表2 蛋殼質量性狀相關性分析結果

2.2 3種蛋殼的超微結構

2.2.1 蛋殼外表面和內表面的超微結構

如圖1所示,正常蛋蛋殼外表面皸裂較少,裂紋較淺,顯得比較平整;分布的氣孔數量少,直徑小而淺(圖1-A);沙殼蛋蛋殼外表面皸裂略多,深度略深,局部裂紋已連成網狀,表觀顯得不平整;分布的氣孔較多,直徑大且深(圖1-B);條紋蛋蛋殼外表面皸裂密集且較深,裂紋間連通形成的網絡較明顯,表觀凹凸不平;分布的氣孔較少且較小(圖1-C)。此外,條紋蛋蛋殼外表面分布有眾多大小不等的顆粒狀突起,正常蛋和沙殼蛋蛋殼較少見。

A、B和C分別表示正常蛋、沙殼蛋和條紋蛋蛋殼外表面;D、E和F分別表示正常蛋、沙殼蛋和條紋蛋蛋殼內表面;G、H和I分別表示正常蛋、沙殼蛋和條紋蛋蛋殼橫斷面。

正常蛋蛋殼內表面纖維密集,主次分支清晰,纖維按層次呈直線狀縱橫交錯,且同一層次的纖維方向比較一致有序,整體纖維網結構平面感較強(圖1-D);沙殼蛋蛋殼內表面纖維疏松凌亂,主次分支不清晰,結構層次性不佳,纖維間空隙較多,可見眾多乳突的頂端侵入纖維層中形成乳突結節(圖1-E);條紋蛋蛋殼內表面纖維分布較沙殼蛋更為稀少,走向也雜亂無序,主次分支不明,纖維間有明顯間隙,可見到每個乳突的乳突結節,甚至可觀察到纖維層下部分乳突頂部的樣貌(圖1-F)。

2.2.2 蛋殼橫斷面的超微結構

正常蛋蛋殼橫斷面較平整,整體結構致密,乳突錐體小且突出,乳突單元排列緊密,大小均一,乳突層與殼膜內層連接較緊密(圖1-G);沙殼蛋蛋殼橫斷面凹凸不平,其乳突錐體較大,各乳突單元排列不甚整齊,有個別畸形乳突單元存在于正常乳突單元之間,使得乳突間縫隙加大(圖1-H);條紋蛋蛋殼橫斷面平整性極差,乳突錐體大小不均,各乳突單元排列不整齊,乳突層厚度占蛋殼橫斷面整體的比例比正常蛋、沙殼蛋的大(圖1-I)。此外,沙殼蛋和條紋蛋蛋殼的乳突層與殼膜內層連接均不緊密。正常蛋蛋殼乳突錐體之間排列整齊性最好,乳突間隙較小,乳突錐體大小較為均一,乳突層厚度較小(圖1-G);沙殼蛋蛋殼乳突錐體大小相對于正常蛋而言,明顯瘦小,乳突間縫隙有所增大,乳突錐體排列開始出現疏松現象,乳突層厚度有所增加(圖1-H);條紋蛋蛋殼乳突錐體排列十分疏松,乳突間的縫隙明顯擴大,各乳突錐體變得細長,乳突層更厚(圖1-I)。

如圖2所示,鈣化殼的最外層是晶體層,3種蛋殼晶體層的晶體排布均較為雜亂。正常蛋蛋殼的晶體層較平整,大部分晶體生長方向與蛋殼表面垂直,晶體排列緊密,晶格棱角分明(圖2-A);沙殼蛋蛋殼的晶體層平整性略差,僅少部分晶體生長方向與蛋殼表面垂直,晶格棱角不分明(圖2-B);條紋蛋蛋殼的晶體層排列疏松,大量小塊晶體堆積分布,與柵欄層之間連接不緊密(圖2-C)。

A、B和C分別表示正常蛋、沙殼蛋和條紋蛋蛋殼晶體層;D、E和F分別表示正常蛋、沙殼蛋和條紋蛋蛋殼柵欄層;G、H和I分別表示正常蛋、沙殼蛋和條紋蛋蛋殼乳突層頂部。

晶體層之下是柵欄層,3種蛋殼的柵欄層均呈明顯的波浪形起伏。進一步放大倍數觀察,可見正常蛋蛋殼柵欄層的塊狀晶體具有3種亞超微結構形式:一種是與蛋殼表面平行的多層板狀結構,每層小板晶體致密平滑,厚度約50 nm,層間結合緊密,由許多小板晶體單元相互層疊在一起構成一個大晶體,大晶體間有少量氣孔洞,這種晶體結構較為多見;另一種是塊狀晶體結構,其上存在多種方解石解理,許多塊狀晶體單元相互連接在一起構成一個大的單晶,大晶體間分布有少量氣孔洞,這種晶體結構也較常見;再一種是無定形晶體,呈顆粒狀,許多顆粒狀晶體單元也可構成一個大的單晶,這種晶體結構較少見(圖2-D)。沙殼蛋蛋殼柵欄層的多層板狀結構不明顯,小晶體呈不定形結構,可見不平行的層疊狀紋理,由小晶體構成的大晶體排列不規則,斷面不整齊,大晶體間可見較多氣孔洞(圖2-E)。條紋蛋蛋殼的柵欄層基本上也是由多層平行的小板晶體單元組成,晶面呈多方向排列,且夾雜較多非板狀結構晶體;小板晶體較易破碎,斷面不整齊,層疊狀的大單晶較少見,氣孔洞較多(圖2-F)。

正常蛋蛋殼乳突層頂部質地致密,與纖維層連接較好,乳突錐體上有少量小的氣孔洞(圖2-G);沙殼蛋蛋殼乳突層頂部由顆粒狀霰石構成,結構致密性較差,與纖維層連接不緊密,乳突錐體上有較多大小不一的氣孔洞(圖2-H);條紋蛋蛋殼乳突層頂部和周邊組織結構松散,整體致密性差,與纖維層的連接不夠緊密,連接部有大量方塊狀霰石散布,乳突錐體上有許多小的氣孔洞(圖2-I)。

通過對3種蛋殼超微結構的量化統計分析可知(表3),3種蛋殼鈣化殼厚度和平均乳突大小均無顯著差異(P>0.05);沙殼蛋和條紋蛋蛋殼乳突間隙均顯著高于正常蛋蛋殼(P<0.05),但沙殼蛋和條紋蛋蛋殼之間差異不顯著(P>0.05);在乳突層厚度和有效厚度的性狀上,各組之間均存在顯著差異(P<0.05)。

表3 3種蛋殼超微結構的比較

2.3 蛋殼超微結構性狀相關性分析

蛋殼超微結構性狀相關性分析結果見表4。3種蛋殼的有效厚度與蛋殼強度均呈顯著正相關(P<0.05),其相關系數分別為0.693、0.743和0.657,這表明有效厚度在一定程度上影響蛋殼強度;3種蛋殼的乳突層厚度與蛋殼強度均呈顯著負相關(P<0.05),其相關系數分別為-0.868、-0.856和-0.837,這表明蛋殼的乳突層厚度與蛋殼強度的關系更為緊密,乳突層厚度越小,其蛋殼強度就越大;3種蛋殼的乳突間隙與蛋殼強度也均呈顯著負相關(P<0.05),其相關系數分別為-0.736、-0.764和-0.781,這表明乳突間隙在很大程度上與蛋殼強度相關聯,乳突間隙越大,其蛋殼強度就越小;3種蛋殼的鈣化殼厚度和平均乳突大小與蛋殼強度的相關性均不顯著(P>0.05)。

表4 蛋殼超微結構性狀相關性分析結果

3 討 論

3.1 蛋殼強度與蛋殼品質的關系

禽類的蛋殼是一種礦化殼,因其具有高度的密閉性、隔絕性和抗壓性,成為禽蛋的天然保護殼,能保護其內容物不受到破壞,尤其是有效限制了微生物對其內容物的污染,使禽蛋可以較長時間保存;另外,其具有的多孔性也有利于卵生禽類胚胎在體外發育時可以順利進行氣體交換和水分蒸發[1,18]。蛋殼的質量性狀主要包括蛋形指數、蛋殼強度、蛋殼韌度、蛋殼厚度、蛋殼比例、蛋比重及蛋殼顏色等,這些性狀基本上構成了蛋殼的結構屬性,共同影響著蛋殼品質[7]。隨著研究的不斷深入,研究者逐漸將目光聚焦到蛋殼強度與蛋殼品質的相互關系上,并認為蛋殼強度是影響蛋殼品質的主要因素[6,8,19]。因此,研究者將研究重心轉向了蛋殼強度的影響因素上,并發現蛋殼強度是取決于蛋殼物質變量和結構變量的一個綜合屬性。結構變量包括蛋殼的厚度、蛋殼表面物質的分布以及蛋的大小和形狀等因素,這些因素對蛋殼強度有一定影響[8],如章世元等[7]發現蛋殼強度是與蛋殼的結構屬性不同相關聯的,但鄒劍敏等[20]認為蛋殼強度變化與蛋殼厚度的變化無關。因此,為了排除厚度這一不確定因素的干擾,本試驗選取了番鴨厚度相似的3種不同質地蛋殼來進行相關研究。

對蛋殼質量性狀進行研究的結果表明,厚度相似的這些番鴨蛋蛋殼其蛋殼強度在正常蛋、沙殼蛋和條紋蛋三者間差異顯著,而蛋形指數、鈣化殼厚度和鈣化殼重在三者間差異均不顯著。由此可見,對于厚度相似的蛋殼,不同質地會顯著影響到蛋殼強度,但對蛋形指數和鈣化殼重的影響并不顯著。同時,本研究還發現厚度相似的蛋殼其蛋形指數和鈣化殼重與蛋殼強度的相關性均不顯著,這說明在鈣化殼厚度相似的情況下,與蛋殼強度變化密切相關的不是蛋形指數和鈣化殼重,而是蛋殼的其他結構屬性。目前,大多數研究者認為蛋殼的超微結構對蛋殼強度具有重大影響,并進行了廣泛而深入的研究[6,7,21]。因此,為了探究番鴨蛋蛋殼質地對蛋殼強度的影響機理,本文在超微結構水平上對其展開了初步研究。

3.2 蛋殼超微結構對蛋殼強度的影響

蛋殼的結構由內至外一般有5層,但在本研究中通過掃描電鏡觀察到,3種質地的番鴨蛋蛋殼其超微結構均為4層,由內而外依次為殼膜層、乳突層、柵欄層和晶體層。這里的殼膜層應是殼膜內層。通常情況下,殼膜有2層,即殼膜外層和殼膜內層。由于殼膜內層與乳突結節緊密嵌合在一起較難剝離,因此在處理樣品制作鈣化殼時被剝離的殼膜是殼膜外層,而在掃描電鏡下觀察到的蛋殼內表面纖維組織是屬于殼膜內層的結構。本研究中未明顯觀察到晶體層之外的角質層,因其在樣品清洗處理時已基本被去除。因此,本研究中觀察到的蛋殼橫斷面的4層結構與其他禽類蛋殼的相應層次構成是一致的[1,6,7,19,22]。然而,番鴨蛋蛋殼在不同層次上的超微結構特點于3種蛋之間是存在差異的,沙殼蛋和條紋蛋蛋殼的外表面不平整,皸裂較正常蛋蛋殼多且深,氣孔也較多,在條紋蛋蛋殼外表面尚分布有更多大小不等的顆粒狀突起;沙殼蛋殼膜內層纖維較疏松凌亂,纖維間空隙較多,條紋蛋殼膜內層纖維分布較沙殼蛋更為稀少,纖維間有明顯間隙;沙殼蛋和條紋蛋蛋殼的橫斷面(柵欄層和晶體層占大部分)的平整性及致密度都更差,乳突錐體較小,乳突單元排列不緊密不整齊且大小不均,乳突層與殼膜層聯系也更加不緊密。番鴨3種蛋殼在超微結構上存在的這種差異,應該是這3種蛋殼在結構屬性上表現出不同質地的內在原因。

本研究也觀察到3種蛋蛋殼強度的高低與蛋殼在超微結構方面的特點是相一致的,且與現有的大部分研究報道[23-25]相符合。為進一步探討蛋殼超微結構與蛋殼強度之間的關系,以及不同層次超微結構對蛋殼強度的影響程度,本文尚對3種蛋殼的超微結構性狀與蛋殼強度進行了相關性分析,結果發現三者的乳突層厚度、乳突間隙及有效厚度與蛋殼強度均存在相關性,其中乳突層厚度和乳突間隙與蛋殼強度均呈顯著負相關,有效厚度與蛋殼強度呈顯著正相關,說明在超微結構層面上乳突層厚度、乳突間隙及有效厚度的變化與蛋殼強度的增減高度相關。在3組相關系數中,乳突層厚度與蛋殼強度間的這組數據的絕對值最接近1,說明蛋殼的乳突層厚度與蛋殼強度的關系更為緊密,乳突間隙次之。從3種蛋殼超微結構層次上的變化也可發現,隨著正常蛋、沙殼蛋和條紋蛋蛋殼的乳突層厚度依次顯著增厚,乳突間隙逐漸變大,3種蛋的蛋殼強度顯著遞減。蛋殼厚度相似的番鴨蛋蛋殼強度與超微結構間的這種變化規律,與章世元等[7]的研究結果也是相一致的。

關于不同層次超微結構中哪一層是對蛋殼強度起主要決定作用,目前研究者的觀點并不統一,有的認為是柵欄層[18,26],有的認為是乳突層[27],而Bain[8]則發現乳突層對蛋殼的硬度特性沒有起貢獻作用,并得到Carnarius等[28]的研究證實。因此,Bain[8]后來提出了有效厚度(即從柵欄柱融合點到角質層外緣的距離)這一概念,認為有效厚度才是評價蛋殼強度的最合適指標。有效厚度的概念已為研究者所接受和應用[18,29],但國內也有學者將有效厚度稱為有效層厚度[30],因此這里暫且將有效厚度所包含的柵欄層與角質層之間的諸層一起統稱為有效層。大量的相關研究結果已表明,蛋殼中的有效層是蛋殼鈣化的主要部分,也是與蛋殼強度關系最密切的部分。因而實際上,有效厚度是剔除乳突層后的鈣化殼厚度。本研究亦發現,有效厚度與番鴨的蛋殼強度呈顯著正相關。有學者認為,有效層的內在強度主要是取決于乳突層的穩定性以及方解石柱狀結構交叉的程度和碳酸鈣的密度[28]。因此總的來說,在超微結構層面上,乳突層厚度、乳突間隙和有效厚度共同對蛋殼強度產生重大影響。

4 結 論

① 厚度相似的3種番鴨蛋蛋殼其蛋殼強度存在顯著差異,超微結構也存在顯著差異,其中乳突層厚度和乳突間隙與蛋殼強度均呈顯著負相關,有效厚度與蛋殼強度呈顯著正相關。

② 在蛋殼的超微結構層面上,乳突層厚度、乳突間隙及有效厚度是影響蛋殼強度的主要因素。