當歸痛風方對小鼠高尿酸血癥腎病的FTIR研究

劉必旺, 路榮榮, 曹 越, 王秀文, 趙 換, 郝 渺, 馬曉霞, 馬艷苗, 王永輝

1. 山西中醫藥大學傅山學院, 山西 榆次 030619

2. 山西中醫藥大學基礎醫學院, 山西 榆次 030619

3. 山西中醫藥大學中藥與食品工程學院, 山西 榆次 030619

4. 山西中醫藥大學附屬醫院藥劑科, 山西 太原 030024

引 言

高尿酸血癥腎病(Hyperuricemia)是人體血尿酸升高后(高尿酸血癥), 過高的尿酸負荷超過腎臟的清除能力, 因尿酸結晶沉積于集合管、 腎盂和尿道, 產生腎內、 甚至腎外梗阻所引起腎臟損害[1]。 早期機體表現為尿濃縮功能減退, 其后逐步出現腎小球濾過率下降, 血肌酐升高, 導致慢性腎功能不全[2]。 近年來, 隨著高尿酸血癥發病率的日益提高, 高尿酸腎病發病率也顯著逐年增高[3]。 因此, 尋求包括中醫藥方法在內的高尿酸腎血癥病的有效防治措施, 具有重要意義。

當歸痛風方國醫大師王世民教授治療高尿酸血癥腎病的常用方, 該方是由《傷寒論》中的當歸四逆湯基礎上進行加減化裁而成, 其組成為當歸、 桂枝、 芍藥、 通草、 炙甘草、 黃芪、 土茯苓、 山楂等。 當歸四逆湯主要用于治療血虛受寒之證, 例如手足逆冷、 舌淡苔白、 脈細欲絕等癥狀。 高尿酸血癥作為一種代謝性疾病, 從中醫角度是由于人體正氣不足, 衛氣不固, 感染了風、 寒、 濕、 熱導致經絡閉阻引發的肌肉、 筋骨、 關節發生疼痛、 屈伸不利、 重者關節腫大變形。 當歸痛風方中黃芪鼓舞人體正氣, 桂枝散寒祛風; 桂枝、 芍藥、 當歸、 通草通脈活血, 土茯苓清熱祛濕, 山楂健脾祛濕。 故本方針對病機, 組成嚴謹, 療效確切。

傅里葉變換紅外光譜儀(FTIR), 同色散型紅外分光的原理, 是基于對干涉后的紅外光進行傅里葉變換的原理而開發的紅外光譜儀[4]; 是鑒別物質和分析物質結構的有效手段, 可對樣品進行定性和定量分析, 廣泛應用于醫藥化工等領域[5]。 FTIR作為一種操作簡便、 實用、 準確率高和費用低的鑒別方法, 如今已經普遍應用于各種藥品檢驗中, 而有關其應用于藥理研究中非常少。

目前已有采用紅外光譜分析法對各種腫瘤組織對大小鼠死亡時間進行研究的報道。 董勤等[6]對鼻咽癌患者以及胃癌患者的指甲進行了紅外光譜研究; 孫雷明等[7-8]對肺癌組織進行了研究。 王磊等研究結果表明大鼠死后腎肝脾等組織FTIR光譜特征具有差異, 因此可以采用光譜推斷死亡時間[9-10]。 采用FTIR研究高尿酸血癥腎病具有可行性。

本工作探討高分辨率的傅里葉變換紅外光譜儀快速地測定正常腎組織和高尿酸血癥腎病模型腎組織以及當歸痛風方高中低劑量干預的腎組織, 分析比較正常組和模型組及各給藥組的紅外光譜吸收差別。 本工作使用FTIR技術評價高尿酸血癥腎病小鼠模型, 并評價藥物的藥效, 為藥物藥理學研究及藥物對生物組織微觀結構的影響及其發生機制探討提供了積極的參考。

1 實驗部分

1.1 儀器

紅外光譜儀(Cary50)美國賽默飛IS10型; Pannoramic250數字切片掃描儀(Pannoramic250)匈牙利3DHISTECH(Hungary); 研磨儀(KZ-Ⅱ)Servicebio; 電熱鼓風干燥箱(GZX-9146MBE)上海博迅實業有限公司醫療設備廠; 酶標檢測儀(Rt2100c)美國賽默飛K3 Touch; 全自動生化分析儀(AU5800)美國Beckman公司。

1.2 動物樣品

SPF級健康雄性KM小鼠60只, 6～8周齡, 18～24 g, 購自北京維通利華實驗動物技術有限公司, 許可證號： SCXK(京)2016-006。 飼養于山西中醫藥大學中醫腦病學山西省重點實驗室超凈飼養單元內, 許可證號： SYXK(晉)2020-0006。

1.3 藥物和試劑

當歸痛風方藥物組成： 當歸12 g、 桂枝9 g、 白芍9 g、 黃芪9 g、 甘草6 g, 通草6 g、 山楂6 g、 土茯苓15 g等。 中藥飲片由上?？禈蛑兴庯嬈邢薰咎峁?。 水煎濃縮, 藥物配制好后置于-20 ℃冰箱中分裝保存, 臨用前恢復至室溫備用。 別嘌醇膠囊(黑龍江澳利達奈德制藥有限公司, 批號： H20181432) 250 mg·粒-1。

尿酸(UA)試劑盒(20200921); 白細胞介素-1β(inter-leukin-1β)測定試劑盒(ab254360)abcam公司; 蘇木素染液(ZH202509)、 伊紅染液(CR2011064)武漢塞維爾生物科技有限公司; 溴化鉀(20190920)天津市北辰方正試劑廠; 氧嗪酸鉀(C10099414)上海麥克林生化科技有限公司; 別嘌呤醇(20190901)廣東彼迪藥業有限公司; 羧甲基纖維素鈉(2018102701)成都市科龍化工試劑廠。

1.4 方法

1.4.1 動物分組、 造模及給藥

60只雄性KM小鼠適應性喂養7 d以后, 隨機分為正常對照組(NC)、 模型組(MC)、 當歸痛風方低劑量組(DD, 3.9 g·kg-1·d-1)、 當歸痛風方中劑量組(DZ, 7.8 g·kg-1·d-1)、 當歸痛風方高劑量組(DG, 15.6 g·kg-1·d-1)、 陽性對照組(YC, 別嘌醇, 10 mg·kg-1·d-1), 每組10只。 當歸痛風方灌胃1周后, 實驗組于每天上午9點給予腹腔注射0.5%羧甲基纖維素鈉溶液配制的氧嗪酸鉀溶液14 d, 誘導高尿酸血癥腎病模型[1-2]。 各組小鼠造模1 h后, 灌胃相應劑量藥物, 正常對照組灌胃等劑量生理鹽水。 腹腔注射劑量為0.1 mL·10g-1, 灌胃劑量為0.2 mL·10g-1。

1.4.2 樣品收集

實驗第20天, 將所有小鼠放入代謝籠中, 正常飲水和飲食, 收集尿液樣本24 h, 2 000 r·min-1離心10 min, 置于4 ℃保存, 用于測定尿尿酸、 肌酐水平, 并記錄24 h尿量。 在第21天末次給藥1 h后處死動物, 之后收集血清和腎臟。 使血清凝結大約1 h, 然后4 ℃, 3 000 r·min-1離心10 min, 用于測定血清尿酸、 肌酐和IL-1β水平。 將部分腎臟制成勻漿, 進行IL-1β水平檢測。 部分腎臟進行病理學組織檢測和傅里葉變換紅外光譜儀分析。

1.4.3 生化指標的測定

血清和尿液的尿酸(UA)、 肌酐(CRE), 以及腎臟和血清中的IL-1β水平的測定, 均按照試劑盒使用說明書進行檢測。

1.4.4 腎臟蘇木精-伊紅(HE)染色

取腎臟組織, 經4%多聚甲醛固定, 固定狀態良好后, 按照病理檢測SOP程序進行染色操作, 最后鏡檢。 每張切片先于40倍下觀察全部組織, 選擇腎臟髓質和皮質, 采集200倍圖片, 觀察具體病變。

1.4.5 傅里葉變換紅外光譜分析腎組織

取各組的部分腎組織于冷凍干燥儀中干燥后, 在瑪瑙研缽中研磨成細粉末, 并與溴化鉀混勻, 裝入模具內在壓片機上壓制1 mm的透明薄片, 置于傅里葉變換紅外光譜儀中測定紅外光譜。 使用OMNIC軟件分析處理所有光譜數據, 按組將數據歸一化處理后, 通過統計譜圖獲得各組的腎組織紅外光譜平均譜圖, 對所得紅外光譜均值中的各個譜帶的峰位進行標定[11], 并對其進行二階導數轉換以便做進一步分析模型組與正常組, 各施藥組與模型組大鼠腎組織紅外光譜特征的差異。

1.4.6 統計學處理

2 結果與討論

2.1 當歸痛風方對氧嗪酸鉀誘導高尿酸血癥腎病小鼠體重的影響

模型組中, 體重增長受到抑制。 隨著時間的延長, 各治療組小鼠體重也呈現出穩定增長的趨勢, 且與模型組比較有統計學差異(p<0.05)。

圖1 當歸痛風方對高尿酸血癥腎病小鼠體重的影響(n=10)

2.2 當歸痛風方對血清UA、 CRE和尿液UA、 CRE的影響

尿液中CRE的變化可以作為腎臟早期損傷的標志。 與正常對照組比較, 模型組血清UA、 CRE水平均升高(p<0.05), 尿液UA、 CRE水平均降低(p<0.05), 表明模型組已經出現早期腎功能損傷, 說明高尿酸血癥腎病的小鼠模型復制成功(表1)。

表1 當歸痛風方對小鼠血清和尿液的UA、 CRE的影響

與模型組比較, 別嘌醇和當歸痛風方高劑量組降低了血清UA水平(p<0.05)。 當歸痛風方高、 中、 低劑量組也顯著降低了血清CRE水平(p<0.05)。 當歸痛風方各劑量組對尿液中的UA、 Cr水平均有升高趨勢(p<0.05), 表明當歸痛風方有潛在的腎保護作用(表1)。

2.3 當歸痛風方對高尿酸血癥腎病小鼠24 h尿量的影響

由圖2所知, 與模型組比較, 當歸痛風方高劑量組可以提高24 h尿量, 有統計學意義(p<0.05)。

圖2 當歸痛風方對小鼠24 h尿量的影響

2.4 當歸痛風方對高尿酸血癥腎病小鼠血清和腎臟IL-1β水平的影響

由表2所示, 與模型組比較, 當歸痛風方低劑量與高劑量的小鼠血清IL-1β和腎臟IL-1β均有統計學意義(p<0.05)。

表2 當歸痛風方對小鼠血清IL-1β和腎臟IL-1β水平的影響

2.5 當歸痛風方對高尿酸血癥腎病小鼠腎臟組織病理學的影響

由圖3可知, 正常組小鼠皮質和髓質分界清晰, 腎小球結構完整清晰, 未見炎性滲出; 腎小管上皮細胞結構正常, 未見明顯壞死; 間質內未見明顯炎性細胞浸潤和纖維組織增生。

圖3 當歸痛風方對高尿酸血癥腎病小鼠腎臟組織病理結果的影響

模型組腎小管輕微擴張, 部分管型內見透明管型和白細胞管型, 白細胞管型內見桿狀核中性粒細胞和和單個核圓形深染的淋巴細胞, 間質內伴有炎性細胞浸潤, 主要為淋巴細胞, 亦見纖維組織增生, 以核呈長梭形的纖維細胞為主, 部分集合管見透明管型。

當歸痛風方低、 中、 高劑量組以及別嘌醇組均可以不同程度改善小鼠腎臟損傷, 主要表現在腎小管上皮細胞結構正常, 無炎性細胞浸潤, 管腔內無管型。

2.6 健康小鼠腎組織紅外光譜

小鼠腎組織的FTIR圖譜在900～3 500 cm-1之間共出現18個關于生物大分子的吸收峰, 分別為969.83、 1 080.83、 1 170.94、 1 236.78、 1 309.99、 1 340.46、 1 396.86、 1 454.54、 1 543.62、 1 656.89、 1 741.40、 2 852.37、 2 871.57、 2 923.49、 2 957.96、 3 013.45、 3 068.31和3 291.26 cm-1。 圖4為健康小鼠腎組織的平均FTIR譜, 生物大分子的分子結構可以通過峰位大致描述, 為高尿酸血癥腎病小鼠找到標準化健康對照。 表3列出關于生物大分子譜帶的指認結果。

表3 健康小鼠生物大分子的圖譜指認

圖4 健康小鼠不同波數范圍的平均傅里葉變換紅外光譜

2.7 高尿酸血癥腎病模型小鼠與健康小鼠的腎組織FTIR光譜譜圖比較

高尿酸血癥腎病模型小鼠和健康小鼠的腎組織傅里葉變換紅外譜吸收峰主要集中在900～1 800、 2 800～3 500 cm-1兩個波段內。

圖5和圖6分別為高尿酸血癥腎病模型組與正常對照組腎組織的紅外光譜, 兩者的峰位、 峰強、 峰形均有差異, 結果見表4。

表4 高尿酸血癥腎病小鼠與健康小鼠腎組織波數與吸光度

圖5 MC與NC腎組織900～1 800 cm-1 FTIR

圖6 MC與NC腎組織2 800～3 500 cm-1 FTIR

由圖5與圖6、 表4可以看出, MC與NC小鼠腎組織的紅外光譜特征有一定差異, 在MC腎組織光譜中, 3 013 cm-1附近為脂類的不飽和碳C—H的吸收, 3 068 cm-1附近為蛋白質酰胺B帶的吸收, 處于3 013 cm-1附近吸收峰的強度高于3 068 cm-1附近的吸收峰, 而NC小鼠腎組莊光譜中則相反。

與NC腎組織相比, MC小鼠腎組織在969、 1 080、 1 236、 1 340、 2 852、 2 923、 3 013和3 291 cm-1附近的吸收峰發生紅移, 其他吸收峰發生藍移。 從NC小鼠正常組織到高尿酸血癥病變組織, 969 cm-1附近由于磷酸化蛋白振動的譜帶吸收強度逐漸減弱[7]。 1 080.38 cm-1的吸收峰表明高尿酸血癥腎病小鼠腎組織中細胞的DNA含量有所減少, 可能與高尿酸血癥腎病導致腎小管上皮細胞凋亡有關。 1 236.67 cm-1表明細胞內核酸氫鍵化程度有所降低。

1 741、 2 871和3 013 cm-1附近的各特征帶均與脂類相關, 1 170、 1 543、 1 656和3 068 cm-1附近來自蛋白質分子, 1 080和1 236 cm-1附近則與核酸相關。 在不同生理或病癥條件下, 大分子濃度信息可以從各特征帶的分配、 吸光度比值觀察出來, 進一步了解生物大分子的組成及結構的改變。 與NC比較, MC小鼠腎組織的特征吸光比A1 080/A2 871、A1 236/A2 871明顯降低;A1 543/A2 871、A3 068/A2 871、A1 543/A1 080、A1 656/A1 080明顯升高。A1 080/A2 871、A1 236/A2 871表現為核酸相對于脂類的含量;A1 543/A2 871、A3 068/A2 871為蛋白質相對于脂類的含量;A1 543/A1 080、A1 656/A1 080為蛋白質相對于核酸的含量, 表明高尿酸小鼠腎組織中蛋白質的含量相對于脂類含量、 蛋白質含量相對于核酸含量呈明顯上升趨勢, 核酸含量相對于脂質含量呈下降趨勢。

2 852與2 871 cm-1附近分別指代脂質的亞甲基對稱振動、 甲基對稱振動, 2 923 cm-1附近處與2 957 cm-1附近處分別指代亞甲基非對稱振動、 甲基非對稱振動。 與NC比較, MC小鼠腎組織A2 852/A2 871,A2 923/A2 957比值增大, 表明細胞膜脂質中甲基、 亞甲基基團數量發生了相對變化, 烴鏈變長。

1 396 cm-1附近處與1 454 cm-1附近處分別指代蛋白質的甲基對稱與非對稱彎曲振動。 MC小鼠腎組織的A1 454/A1 396比NC小鼠腎組織的數值大, NC中1 454 cm-1處的吸收峰相對強度弱于1 398 cm-1處的相對強度。 而在MC中這兩處吸收峰的相對強度大小相等, 表明與健康腎組織比較, 高尿酸血癥腎病腎組織中蛋白質分子的甲基反對稱彎曲振動相對于對稱彎曲振動基團數目增加[5]。

2.8 當歸痛風方的腎組織FTIR光譜譜圖比較

由圖7可以看出, 當歸痛風方各劑量組腎組織傅里葉變換紅外譜吸收峰主要集中在900～1 800、 2 800～3 500 cm-1兩個波段內, 且排列比較有規律。 越接近模型組, 峰逐漸變小, 譜圖變得越扁平。 推測可能對腎組織損傷越大, 腎組織中的成分越單一。

圖7 當歸痛風方的腎組織FTIR光譜譜圖

從當歸痛風方對高尿酸血癥腎病小鼠體重、 血清UA血清CRE、 尿液UA、 尿液CRE、 血清IL-1β、 腎臟IL-1β和病理切片等的影響可知, 當歸痛風方的高劑量組和陽性對照組與模型組比較有統計學意義。 由圖7當歸痛風方的腎組織FTIR光譜比較可進一步證明了以上的分析。 由圖7分析可知, NC、 MC、 YC、 DD、 DZ、 DG之間有明顯變化差異, MC的強度均低于NC。 DG與YC的譜圖接近NC, 說明當歸痛風方高劑量和陽性對照藥物對高尿酸血癥腎病治療效果好。 從圖8當歸痛風方腎組織FTIR的二階導數譜也進一步證明了以上分析。

3 結 論

目前高尿酸血癥腎病的輔助診斷有影像學技術, 包括肌骨超聲、 高頻超聲等, 但超聲主要有超聲波穿透力弱、 無法完整的顯示解剖結構、 受氣體影響大、 與操作者的經驗、 技術水平密切相關等局限性[12]。 近年來, 傅里葉變換紅外光譜技術因其能快速、 準確、 直觀地觀察出患病組織的紅外譜變化而廣泛用于診斷乳腺癌、 關節炎、 白血病等多種疾病, 許多學者通過傅里葉變化紅外光譜技術觀察正常與患病組織的蛋白質、 核酸、 糖類、 脂質等生物大分子的紅外光譜變化, 進而鑒別和區分正常組織與患病組織, 找到疾病診斷的新途徑[13-14]。

本實驗首先建立小鼠高尿酸血癥腎病模型, 通過體重、 血清UA、 血清CRE、 尿液UA、 尿液CRE、 血清IL-1β、 腎臟IL-1β和病理切片等指標評價了當歸痛風方治療高尿酸血癥腎病的效果。 實驗結果表明當歸痛風方治療高尿酸血癥腎病療效確切, 即當歸痛風方具有促尿酸排泄和改善腎功能的作用, 體現為使高尿酸血癥腎病小鼠血清尿酸、 肌酐水平降低, 尿液尿酸、 肌酐水平增多, 同時改善了高尿酸血癥腎病小鼠的腎臟病理結果。

高尿酸血癥腎病模型小鼠與健康小鼠的腎組織FTIR光譜圖及比較分析, 當歸痛風方對高尿酸血癥腎病的腎組織FTIR光譜圖及比較分析, 也證明模型復制成功, 并說明當歸痛風方具有改善高尿酸血癥腎病的作用, 這與前面的分析結果一致。 FTIR檢測比尿酸、 肌酐檢測及病理分析經濟、 快速、 簡便、 實用、 準確率高, 并能分析藥物對生物組織微觀結構的影響及其發生機制[12], 因此具有其他檢測方法無可比擬的優勢。 本工作首次采用FTIR檢測方法評價高尿酸血癥腎病小鼠模型, 并首次采用FTIR檢測方法對藥物的療效進行評價。 為高尿酸血癥腎病的動物實驗及藥物評價具有重要的參考意義和價值, 這種意義和價值并可進一步向臨床轉化, 并拓展FTIR檢測方法的使用范圍。