抑制長鏈非編碼RNA MALAT1對糖脂毒性誘導的內皮細胞功能障礙的影響及可能機制

張志揚 劉芬 張雪鶴 房彬彬 張冀鑫 謝騫 楊毅寧 李曉梅

目的：探討糖脂毒性環境中抑制長鏈非編碼RNA（lnc RNA）人類肺腺癌轉移相關轉錄本1（MALAT1）的表達水平對人臍靜脈內皮細胞功能影響的分子機制。

方法：用葡萄糖和棕櫚酸處理人臍靜脈內皮細胞，建立體外糖脂毒性內皮細胞模型，并分為對照組、高糖高脂組、高糖高脂對照組以及小干擾RNA（si-RNA）干預的高糖高脂+si-MALAT1 組、高糖高脂+si-絲裂原活化蛋白激酶1（si-MAPK1）組。應用實時熒光定量PCR 檢測MALAT1、MAPK1 的mRNA 表達水平；蛋白免疫印跡法檢測自噬、線粒體融合分裂、凋亡、通路相關蛋白的表達水平；免疫熒光共聚焦定位檢測自噬及溶酶體相關蛋白的熒光共定位情況；透射電鏡觀察內皮細胞中自噬溶酶體的數目；線粒體探針染色檢測線粒體形態；免疫熒光檢測細胞內活性氧（ROS）的產生；流式細胞儀檢測各組細胞的凋亡；細胞增殖及劃痕實驗檢測不同時間點各組細胞的增殖及遷移能力；血管形成試驗檢測各組細胞中新生血管數量。

結果：與對照組相比，高糖高脂組、高糖高脂對照組的MALAT1 mRNA、磷酸化的絲裂原活化蛋白激酶1（p-MAPK1）的表達水平增加，磷酸化的哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（p-mTOR）的表達水平下降，P 均<0.05。與高糖高脂對照組相比，高糖高脂+si-MALAT1 組微管相關蛋白 1A/1B-輕鏈3（LC3）、螯合體1（p62）、ROS、剪切后活化的半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶-3（cleaved caspase-3）、BCL-2 相關X 蛋白（BAX）、p-MAPK1 的表達水平均下降，線粒體融合蛋白視神經萎縮蛋白1（OPA1）、BCL-2、p-mTOR 的表達水平均增加，P 均<0.05；LC3 和溶酶體相關膜蛋白2（LAMP2）蛋白的熒光共定位陽性顆粒增加（P 均<0.01），溶酶體數目減少；細胞增殖、遷移、成管能力均增加（P均<0.01）。與高糖高脂對照組相比，高糖高脂+si-MAPK1 組內皮細胞中p-MAPK1 的表達下降，p-mTOR 的表達上升（P均<0.01）。

結論：抑制MALAT1 表達，可降低糖脂毒性環境中線粒體的自噬水平，減少內皮細胞的凋亡及改善內皮細胞的功能，可能與調節MAPK1/mTOR 信號通路有關。

心血管疾?。–VD）是導致人群死亡和殘疾的主要原因[1]。高血糖、高血脂是動脈粥樣硬化（AS）發生發展的重要驅動因素[2]。高血糖會導致內皮細胞凋亡和自噬[3]，抑制高血糖誘導的內皮細胞自噬對內皮細胞具有保護作用[4]。血脂過高可引起低密度脂蛋白在內皮細胞下積聚，逐漸堆積成斑塊導致AS[5]?！疤侵拘浴钡母拍钭钤缡窃谝认佴?細胞損傷中提出[6]，目前研究發現，糖脂毒性可影響內皮細胞功能，加速AS 的進程[7-8]。

長鏈非編碼RNA（lnc RNA）是長度至少為200 bp，具有高度保守序列的非蛋白質編碼RNA，其可調節內皮細胞功能，影響AS 的進展[8]。人類肺腺癌轉移相關轉錄本1（MALAT1）是一種保守的lnc RNA，在內皮細胞中高度表達，與內皮細胞的增殖和血管生成等功能密切相關[9]。然而，糖脂毒性環境中MALAT1 對內皮細胞功能影響的具體機制很少研究。鑒于此，本研究探究了糖脂毒性環境中MALAT1 對內皮功能的影響及作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

人臍靜脈內皮細胞（HUVEC）購于深圳豪地華拓生物科技有限公司；澳洲胎牛血清、DMEM 培養基購于美國Gibco 公司；活性氧（ROS）試劑盒購于北京索萊寶科技有限公司；CCK8 試劑盒購于北京博奧森生物科技有限公司；E 偶聯膜聯蛋白V（Annexin-V）凋亡檢測試劑盒購于美國BD 公司；BCA 蛋白定量試劑盒購于美國Thermo 公司；微管相關蛋白 1A/1B-輕鏈3（LC3）、螯合體1（p62）、芐氯素1（Beclin1）一抗購于武漢三鷹生物技術有限公司；BCL-2 相關X蛋白（BAX）、BCL-2 和半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶-3（caspase-3）、線粒體融合蛋白視神經萎縮蛋白1（OPA1）、動力相關蛋白（Drp1）、絲裂原活化蛋白激酶1（MAPK1）、磷酸化MAPK1（p-MAPK1）、磷酸化哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（p-mTOR）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）一抗購于美國Cell Signaling Technology 公司。羊抗兔/羊抗鼠 IgG-HRP 二抗購于北京博奧森生物科技有限公司。

1.2 方法

細胞培養、細胞模型制作及分組：HUVEC 培養在含有5%胎牛血清、1%抗生素的DMEM 完全培養基中，每隔2 天換液1 次，在細胞密度達95%左右時，按照1:2 的比例進行細胞傳代處理。在細胞密度達80%左右時加入終濃度為30 mmol/L 葡萄糖、500 μmol/L 棕櫚酸培養24 h，制備體外高糖高脂處理細胞模型；在細胞密度達70%左右時提前給予小干擾RNA（si-RNA）處理，6 h 后更換為含抗生素的完全培養基，24 h 后加入高糖高脂培養基，培養24 h制備高糖高脂si-RNA 干預細胞模型。將不同處理的HUVEC 分為對照組、高糖高脂組、高糖高脂對照組以及經si-RNA 干預的高糖高脂+si-MALAT1 組、高糖高脂+si-MAPK1 組。

細胞內MALAT1 表達及活性氧（ROS）的測定：用TRIzol 試劑法提取細胞總RNA，測定其濃度和純度；逆轉錄合成互補DNA；嚴格按說明書配置逆轉錄聚合酶體系；實時熒光定量PCR（RT-qPCR）擴增體系相同[10]，每組3 個副孔。引物序列見表1。ROS 檢測[7]：在24 孔板中進行爬片后，嚴格按ROS試劑盒說明書測定各組ROS 含量并在熒光顯微鏡下觀察并拍照。

表1 引物序列

自噬蛋白LC3、溶酶體相關膜蛋白2（LAMP2）共聚焦定位[7]：在24 孔板中根據不同分組進行細胞處理，每組3 個復孔。各組細胞干預結束后，多聚甲醛固定爬片；室溫封閉；孵育一抗（LC3、LAMP2）；孵育相應種屬熒光標記的熒光二抗，避光孵育，對標本進行染核；封片后在熒光顯微鏡下觀察；隨后進行激光共聚焦熒光檢測。透射電鏡觀察溶酶體數目[7]：收集細胞，固定保存。離心洗滌后加入1%瓊脂糖溶液，1%鋨酸避光室溫固定，脫水，包埋過夜，聚合，切片，染色過夜后在透射電子顯微鏡下觀察，采集圖像分析。

線粒體熒光探針法檢測線粒體動力學功能：在24 孔板中進行爬片計數，根據不同分組進行細胞處理，每組3 個復孔。各組細胞干預結束后，多聚甲醛固定爬片，孵育，染核，封片，然后在熒光顯微鏡/共聚焦顯微鏡下觀察采集圖像[11]。

流式細胞術檢測細胞凋亡：收集處理后的各組細胞，嚴格按照E 偶聯Annexin-V 凋亡檢測試劑盒操作，在流式細胞儀上檢測細胞凋亡率[12]。

CCK-8 檢測細胞存活率[12]：將細胞接種到96孔板中，按照上述方法分別處理各組細胞，每組3個復孔；干預結束后，分別于0、24、48、72 h 進行轉染；每孔加入10 μl CCK-8 溶液，37℃孵箱孵育2 h，用紫外分光光度計測各組在540 nm 處的吸光度。

傷口愈合實驗檢測遷移能力[12]：細胞計數后6孔板鋪板，每組3 個復孔；24 h 后細胞劃痕，按照上述方法分別處理各組細胞放入培養箱培養。分別于0 、24、48 h 在高倍顯微鏡下觀察細胞遷移情況。

血管化實驗檢測成管能力[12]：細胞計數后6 孔板鋪板，每組3 個復孔；處理各組細胞，在血管生成載玻片每個孔中加入10 μl 基質膠后放入培養箱中使膠凝固；每孔加入50 μl 細胞懸液；培養箱培養2 h 后開始觀察，并在適當時間點拍照記錄實驗結果。

蛋白免疫印跡法檢測自噬、線粒體融合分裂、凋亡、通路相關蛋白的表達水平：各組細胞干預結束后，使用BCA 蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。配制蛋白上樣體系；配制10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）凝膠，蛋白上樣20 μg，電泳結束后將蛋白轉至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，Tris 緩沖鹽溶液+0.1% Tween 20（pH7.4，TBST）溶液洗膜3 遍，5%脫脂牛奶封閉2 h，再次洗膜3遍后，裁剪PVDF膜，分別放置在相應稀釋好的一抗中，4℃孵育過夜，洗膜3 遍后，二抗孵育1 h，漂洗3 遍后，進行電化學發光法（ECL）顯影。利用Image J 軟件進行灰度分析，以GAPDH 作為內參照計算各組蛋白的相對表達量。

統計學方法：所有統計分析均使用SPSS 22.0 軟件進行。計量資料以±s表示，多組間比較采用方差分析，多組間兩兩比較采用SNK 法。P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 抑制MALAT1 表達后糖脂毒性環境下內皮細胞中的線粒體自噬情況（圖1）

圖1 抑制MALAT1 表達后糖脂毒性環境下內皮細胞中的線粒體自噬情況（x±s,n=3）

RT-qPCR 結果顯示，與對照組相比，高糖高脂組、高糖高脂對照組MALAT1 mRNA 表達水平升高（P均<0.001）；與高糖高脂對照組相比，高糖高脂+si-MALAT1 組MALAT1 mRNA 的表達水平明顯降低（P<0.001），見圖1A。蛋白免疫印跡法結果顯示，與對照組比較，高糖高脂組、高糖高脂對照組自噬激活的特異性標志物LC3、p62 表達增加（P均<0.05），Beclin1 表達下降（P均<0.01），見圖1B。熒光共定位情況結果顯示，與對照組比較，高糖高脂組、高糖高脂對照組中LC3 和LAMP2 蛋白的熒光共定位陽性顆粒增加（P均<0.01）；與高糖高脂對照組相比，高糖高脂+si-MALAT1 組中LC3、LAMP2 陽性顆粒減少（P均<0.01），見圖1C。透射電子顯微鏡觀察結果顯示，與對照組比較，高糖高脂組、高糖高脂對照組內皮細胞中溶酶體數目增加；與高糖高脂對照組相比，高糖高脂+si-MALAT1 組中溶酶體數目減少，見圖1D。

2.2 抑制MALAT1 表達對糖脂毒性引起的內皮細胞氧化應激與線粒體動力學功能障礙的影響（圖2）

ROS 熒光探針檢測與蛋白免疫印跡法結果顯示，與對照組比較，高糖高脂組、高糖高脂對照組ROS、線粒體分裂蛋白Drp1 的表達水平均增加（P均<0.05），細胞內線粒體裂變增多，表現為線粒體碎片化，抑制MALAT1 表達后細胞內的線粒體裂變減少，融合增多。與高糖高脂對照組相比，高糖高脂+si-MALAT1 組細胞ROS 表達下降，線粒體融合蛋白OPA1 表達水平增高（P均<0.05）。

2.3 抑制MALAT1對糖脂毒性導致的人臍靜脈內皮細胞凋亡水平的影響（圖3）

與對照組相比，高糖高脂組、高糖高脂對照組中細胞凋亡率，剪切后活化的caspase-3、BAX 表達均增加，BCL-2 表達減少（P均<0.01）；與高糖高脂對照組相比，高糖高脂+si-MALAT1 組凋亡率，剪切后活化的caspase-3、BAX 表達均下降，BCL-2表達增加（P均<0.05），見圖3A、3B。

2.4 抑制MALAT1 表達對糖脂毒性導致的人臍靜脈內細胞增殖、遷移、成管功能障礙的影響（圖4）

圖4 抑制MALAT1 表達對糖脂毒性導致的人臍靜脈內細胞增殖、遷移、成管功能障礙的影響（x±s,n=3）

與對照組相比，高糖高脂組、高糖高脂對照組內皮細胞增殖、遷移、成管能力均下降（P均<0.01）；與高糖高脂對照組相比，高糖高脂+si-MALAT1 組細胞增殖、遷移、成管功能均上升（P均<0.01），見圖4A～C。

2.5 糖脂毒性條件下MALAT1 對內皮細胞中MAPK1/mTOR 信號通路相關蛋白的mRNA 及蛋白表達水平的影響（圖5）

圖5 糖脂毒性條件下MALAT1 對內皮細胞中MAPK1/mTOR 信號通路相關蛋白的mRNA 及蛋白表達水平的影響（x±s,n=3）

RT-qPCR 結果顯示，與對照組相比，高糖高脂組、高糖高脂對照組內皮細胞中MAPK1 mRNA 表達水平升高（P<0.001），見圖5A；蛋白免疫印跡法顯示，與高糖高脂對照組相比，高糖高脂+si-MALAT1 組p-MAPK1 表達水平降低（P<0.05），p-mTOR 表達水平上升（P<0.01），見圖5B；高糖高脂+si-MAPK1 組p-MAPK1 表達水平降低（P<0.01），p-mTOR 的表達水平升高（P<0.01），見圖5C。

3 討論

AS 是一種慢性炎癥疾病，其主要特征是斑塊的形成。斑塊表面由內皮細胞、纖維細胞等組成的“纖維帽”成分覆蓋，內部含有脂質和（或）壞死核心[13]。內皮細胞的自噬、凋亡和損傷均會導致內皮屏障減弱、脂質積累和粘附蛋白積累，這些都是AS的早期事件。因此，內皮細胞功能受損在AS 的發生發展過程中起著重要作用[14]。

自噬可利用溶酶體自我消化降解那些功能受損的細胞器和蛋白質[15]，為細胞生存提供能量代謝前體并維持細胞穩態，因此自噬的啟動與溶酶體活性的變化密切相關[16]。細胞氧化應激時會積累受損或有毒的蛋白質和細胞器，從而激活自噬以維持細胞穩態[17]。然而，細胞內自噬的過度激活會導致自噬流受損，并誘導細胞凋亡[18]和功能受損。

線粒體自噬（mitophagy）是細胞內一種重要的選擇性自噬，在細胞受到有害因子刺激后可維持細胞正常的功能狀態，減少內皮細胞中ROS 的產生，從而緩解AS 的進展[19]。據報道，線粒體自噬的活化是在ROS 生成增加的條件下被激活的[20]，這說明ROS 的增加不僅能誘導線粒體自噬的活化，且線粒體自噬活性被上調的程度與ROS 含量呈正相關[21]。且有研究表明，線粒體動力學可調節線粒體自噬[22]。本研究結果顯示，在高糖高脂環境下，內皮細胞中ROS 含量增加，線粒體動力學功能障礙，自噬相關蛋白Beclin1、p62、LC3 表達結果，免疫熒光線粒體自噬特異性蛋白LC3、LAMP2 共聚焦結果、透射電鏡采集內皮細胞中溶酶體數目結果均顯示內皮細胞自噬被激活。其中作為自噬的底物，p62 被運送到溶酶體進行降解，而暴露于糖脂毒性后p62 的表達增加可能與自噬體的不連續更新有關[23]。所有這些證據表明，干預內皮細胞自噬是治療冠心病的一種有前途的新策略。

研究發現，MALAT1 在冠心病血液樣品中的表達顯著上調[24]。這表明，MALAT1 可能作為AS 的潛在生物標志物，加速了冠心病進展[25]。MAPK1也稱為ERK2、p42MAPK，在細胞增殖、分化、轉錄調節和發育中起著至關重要的作用[26]。據報道，MAPK1 與MALAT1 的表達正相關[27]，MALATI 可以激活MAPK1 信號通路[28]。本研究RT-qPCR 的結果顯示，MALAT1 和MAPK1 在高糖高脂環境下的內皮細胞中表達顯著上調，在給予si-MALAT1 后MAPK1 的表達下降，與上述研究結果相符。

mTOR 作為在自噬中發揮作用的關鍵調節因子，被抑制后可激活自噬[29]。研究顯示，在冠心病中mTOR 信號通路被激活[24]，其調節自噬的過程中受MAPK 的調節[30]。因此，研究MAPK1/mTOR 信號通路調控自噬對AS 治療具有重要意義。本研究蛋白免疫印跡結果顯示，內皮細胞中MAPK1 表達顯著增高，mTOR 表達顯著下降，與上述研究結果相符。

為了確定MALAT1 是否可以激活mTOR 信號，首先通過RT-qPCR 在不同分組中檢測MALAT1 和MAPK1 的表達水平，發現MALAT1 和MAPK1 的表達在高糖高脂環境下的內皮細胞中高表達且呈正相關，再通過蛋白質免疫印跡在不同條件下檢測上游調節劑MAPK1（ERK1/2），發現MALAT1/MAPK1影響mTOR 信號傳導以介導細胞自噬，并進一步影響冠心病進展。結果表明，MALAT1 通過調節MAPK1 觸發mTOR 信號通路。

本研究發現當高糖高脂刺激HUVEC 時，內皮細胞中MALAT1表達升高激活內皮細胞線粒體自噬，導致內皮細胞凋亡與細胞功能障礙，加速AS 進程。在給予si-MALAT1 干擾后，MAPK1 表達下降及mTOR 表達上升，內皮細胞功能得到改善。

綜上所述，本研究認為糖脂毒性環境下lncRNA MALAT1 誘導內皮細胞線粒體自噬，內皮細胞凋亡與功能障礙，可能與調節MAPK1/mTOR 信號通路有關。抑制MALAT1 表達后，可改善內皮細胞功能，為臨床上進一步治療AS 提供了新思路。然而，本研究有局限性，未設計動物實驗進行驗證。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突